интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение препарата и его применение

Классы МПК:C07K14/56 альфа-интерферон
C07K17/08 с носителем, являющимся синтетическим полимером
A61K38/21 интерфероны
A61P31/12 противовирусные средства
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):, , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):БИОСТИД ДЖЕНЕ ЕКСПРЕШЕН ТЕК. КО., ЛТД. (CN)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-09-04
публикация патента:

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен пегилированный интерферон-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b), имеющий структуру, как указано в формуле изобретения. Пегилированный интерферон-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b получают соединением IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с Y-образным разветвленным полиэтиленгликолем (YPEG), где YPEG связан с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с помощью амидной связи, сформированной интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппой боковой цепи остатка Lys в IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в положении 134 в SEQ ID No.1. Способ получения и очистки пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b включает следующие этапы. В щелочной среде при рН 9,0 проводят реакцию Y-образного разветвленного PEG с IFN-a2b и получают пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b. Извлекают полученные продукты реакции с помощью анионообменной смолы и элюируют данные продукты анионным градиентом, чтобы получить модифицированные продукты. В качестве анионообменной смолы используют Q Сефарозу FF, а в качестве анионного градиента используют хлорид-ионный градиент. Далее элюируют модифицированные продукты с помощью катионообменной смолы катионным градиентом. При этом в качестве катионообменной смолы используют SP Сефарозу FF, а в качестве катионного градиента используют натриевый ионный градиент. Далее собирают каждый пик в отдельности. Определяют активность продукта каждого пика и выбирают пик, соответствующий продукту реакции, обладающему наиболее высокой активностью. Также предложен состав для лечения заболевания, требующего применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, который состоит из фармацевтически эффективного количества указанного пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и фармацевтически приемлемого носителя или неактивного вещества. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b или указанный выше состав также применяют для получения лекарственного препарата для лечения различных заболеваний, требующих применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b. Предложенный пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b обладает более высокой удельной активностью 2,65±0,185×10 6 МЕ/мг и продолжительным временем полужизни в сыворотке. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 3 пр.

Рисунки к патенту РФ 2485134

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

Область техники

Изобретение относится к интерферону-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированному Y-образным разветвленным полиэтиленгликолем (PEG) по одному аминокислотному остатку, и его получению, а также к применению полученного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, пегилированного по одному аминокислотному остатку, в фармацевтике.

Уровень техники

Интерфероны (IFNs) - это семейство низкомолекулярных белков или гликопротеинов, вырабатываемых эукариотными клетками в ответ на вирусную инфекцию и другую антигенную стимуляцию и демонстрирующих широкий спектр противовирусных, противопролиферативных и иммуномодулирующих эффектов. Интерфероны широко применяются при лечении различных патологических состояний и заболеваний, таких как вирусные инфекции (например, гепатит В, гепатит С и ВИЧ-инфекция); воспалительные реакции и заболевания (например, рассеянный склероз, артрит, бронхиальная астма, муковисцидоз и интерстициальные заболевания легких); опухоли (например, миеломы, лимфомы, рак печени, рак легкого, волосатоклеточный лейкоз) и т.д. (Kenji Oritani, Paul W Kincade с соавт. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster с соавт. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002).

Выделяют четыре вида интерферонов, различающиеся по химическим, иммунологическим и биологическим свойствам - Интерфероны интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 и интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 . интерферон альфа (IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 ) секретируется лейкоцитами. Интерферон альфа человека кодируются большим мультигенным семейством, состоящим примерно из 20 генов; белки, кодируемые этими генами, достигают примерно 90% гомологии аминокислотной последовательности (Неnсо K., Brosius F.J. и др. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985). IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b человека является одним из подтипов подсемейства интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2 семейства IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 человека; это одноцепочечный белок, обладающий различными видами биологической активности. Этот одноцепочечный белок состоит из 165 аминокислотных остатков, четыре из которых являются остатками Cys. В этом белке присутствуют две внутрицепочечные дисульфидные связи (соответственно Cysl-Cys98 и Cys29-Cys138), и N-концевой аминокислотой является Cys с одной свободной интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2-группой. В данной аминокислотной последовательности остатки в положениях 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 и 164 являются остатками Lys, каждый из которых содержит одну свободную интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2-группу. Этот белок не гликозилирован и чувствителен ко многим протеазам. Аминокислотная последовательность интерферона-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b человека обозначена как SEQ ID No:1.

В клинической практике обычно осуществляется парентеральное введение интерферонов. В связи с коротким периодом полувыведения in vivo (2-4 часа) и высокой иммуногенностью интерфероны необходимо вводить более часто, используя более короткие интервалы между введениями доз. Поскольку вырабатываемые антитела значительно снижают терапевтическую эффективность, достижение идеальной клинической эффективности при лечении интерферонами затруднено. Возможным решением этих проблем является недавно разработанная технология модификации полиэтиленгликолем (PEG-модификации).

Полиэтиленгликоль является инертным, нетоксичным и биоразлагаемым органическим полимером, играющим важную роль в биотехнологической и фармацевтической областях. Методика PEG-модификации обеспечивает связывание PEG с активным белком с помощью ковалентной связи. После полиэтиленгликолирования (пегилирования) возможно значительное улучшение свойств белка - например, увеличение продолжительности периода метаболического полувыведения препарата, снижение иммуногенности, повышение безопасности, повышение терапевтической эффективности, снижение частоты введения доз, повышение растворимости препарата/растворимости в воде, повышение стойкости против протеолиза, облегчение контролируемого высвобождения препарата и т.д. Дополнительная информация содержится в работах Inada с соавт. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado с соавт. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993, и публикации патента США 4179337.

В патенте США № 4179337 указано, что после присоединения PEG к ферменту или инсулину отмечается снижение иммуногенности белка с одновременным ослаблением его эффектов. Аналогичная закономерность была выявлена в отношении G-CSF (Satake-Ishikawa с соавт. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Katre с соавт. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987), TNF-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 (Tsutsumi с соавт. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Inoue с соавт. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) и CD4-IgG (Chamow с соавт. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).

Сообщалось о том, что белок, модифицированный разветвленным PEG, демонстрирует лучшую переносимость изменений уровня рН, термостабильность и стойкость против протеолиза, чем белок, модифицированный линейноцепочечным PEG (Monfardini с соавт. Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995). Как правило, модификация белка обеспечивается присоединением молекулы PEG к N-концевой интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппе или интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппам остатков Lys в молекуле белка. Обычно с целью модификации белка используются три вида PEG - линейноцепочечный PEG (ЕР 0593868), U-образный разветвленный PEG (ЕР 0809996) и Y-образный разветвленный PEG (CN 1243779 C).

В настоящее время в клинической практике используется большое количество различных видов пегилированных белков. В 1990 году Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) был одобрен препарат Адаген (пегилированная бычья аденозиндезаминаза), производимый компанией ЭНЗОН Инк.; этот препарат применяется для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov). В 1994 году на рынок США был выпущен другой PEG-модифицированный белок - пегилированная аспарагиназа (пегаспаргаза, Онкаспар); этот препарат предназначен для лечения острого лимфобластного лейкоза (103411s5052lbl, http://www.fda.gov). В 2000 году FDA одобрило для рыночной реализации PEG-модифицированный интерферон-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (PEG IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, PEG-Интрон), разработанный компанией Шеринг-Плау, а в 2002 году - пегилированный интерферон-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2а (PEG IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2a, Пегасис), разработанный компанией Хоффман ля Рош Лтд.; оба эти препарата применяются для лечения гепатита (103964s5037lbl, pegsche011901LB, http://www.fda.gov). Кроме того, в 2002 году FDA одобрило PEG-модифицированный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, производимый компанией Амген Инк. (PEG-филграстим, Нейласта); этот препарат используется для лечения метастатического рака молочной железы (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov). Помимо этого, FDA приняло заявку на пегилированный антагонист человеческого фактора роста, разработанный компанией Фармация. В настоящее время осуществляется поздняя стадия клинических испытаний пегилированного фрагмента антитела против TNF-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , разработанного компанией Селлтек, и пегилированного рецептора TNF, разработанного компанией Амген. Кроме того, началась II фаза клинических исследований пегилированного камптотецина - первого конъюгата PEG с органической молекулой. В 2004 году FDA одобрило PEG-модифицированный олигонуклеотид (Пегаптаниб, Макугенинтерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 ). К настоящему времени сформировались четкие представления о метаболизации PEG, присутствующего в составе лекарственных препаратов, и самого PEG in vivo, а также получены доказательства адекватности и безопасности модификации лекарственных препаратов с помощью PEG и отсутствия каких-либо неблагоприятных эффектов при использовании PEG-модифицированных препаратов.

Обычно для присоединения к белковому препарату PEG должен быть предварительно дериватизирован таким образом, чтобы можно было химически активировать одну или две концевые группы на концах PEG и получить подходящие функциональные группы, демонстрирующие активность и, таким образом, способные сформировать стабильную ковалентную связь по крайней мере с одной функциональной группой препарата, к которому присоединяют PEG. Например, PEG можно присоединить к группе интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2 остатка Lys или к группе интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2 N-концевого аминокислотного остатка пептидной цепочки белка. При пегилировании IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , описанном в европейском патенте ЕР 0809996, PEG-NHS связывается посредством нуклеофильного замещения с группой интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2 N-концевой аминокислоты или с группой интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2 остатка Lys в IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 . В вышеуказанном патенте PEG-NHS представляет собой U-образное разветвленное производное PEG (PEG2-NHS), имеющее следующую молекулярную формулу:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R и R' в отдельности и независимо друг от друга представляют собой низкомолекулярную алкильную группу; n и n'=600-1500; и средний молекулярный вес PEG=26-66 кД. Ниже представлена молекулярная формула IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , модифицированного присоединением PEG2-NHS:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

В тех случаях, когда одна или большее количество молекул PEG2-NHS присоединяются к группе интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NH2 N-концевой аминокислоты или группе интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NF2 остатка Lys IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , получаемые продукты представляют собой смесь непегилированного IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , пегилированного по одному аминокислотному остатку, и IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , пегилированного по многим аминокислотным остаткам. IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , пегилированный по одному аминокислотному остатку, может быть выделен из полученных продуктов с помощью любого подходящего способа очистки. IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 имеет одну N-конценую аминокислоту и несколько остатков Lys, то есть несколько реактивных участков для присоединения PEG2-NHS; в связи с этим выделяемый IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , пегилированный по одному аминокислотному остатку, представляет собой смесь изомеров IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 , пегилированных по разным единичным аминокислотным остаткам.

В европейском патенте ЕР 0593868 описана модификация IFN линейноцепочечным PEG; получаемый при этом модифицированный продукт имеет следующую молекулярную формулу:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R - низкомолекулярная алкильная группа; R1, R2, R3 и R4 - Н или низкомолекулярные алкильные группы; m - диапазон от единицы до количества возможных положений PEG-модификации в IFN; W - О или NH; х - диапазон от единицы до 1000, y и z - диапазоны от нуля до 1000, x+y+z - диапазон от 3 до 1000; и по крайней мере один из R1, R2, R3 и R 4 - низкомолекулярная алкильная группа. Ю-Сен Ван с соавт. (Yu-Sen Wang с соавт., Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002; Yu-Sen Wang с соавт., Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000) сообщили о модификации rIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b линейным монометокси-PEG (Пег-Интрон; 12 кД) и с помощью ионообменной ВЭЖХ показали, что получаемый продукт представляет собой смесь более чем 14 изомеров, модифицированных PEG по разным единичным аминокислотным остаткам. Ниже представлена молекулярная формула линейных PEG, использованных Ю-Сен Ваном с соавт.:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

Средний молекулярный вес данных PEG равен 12 кД.

Краткое описание изобретения

Производные PEG, используемые в настоящем изобретении, представляют собой новые разветвленные, а именно Y-образные разветвленные, производные PEG, и их структура отличается от структуры U-образных разветвленных PEG. Наиболее значительное различие между этими двумя видами PEG заключается в следующем: в Y-образных производных PEG по настоящему изобретению две ветви PEG соединены посредством атома N, тогда как в U-образных производных PEG по изобретению ЕР 0809996 две ветви PEG соединены посредством атома С. Ниже представлен молекулярный состав Y-образных производных PEG по настоящему изобретению:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где Ра и Pb - одинаковые или разные PEG; j - целое число в диапазоне от 1 до 12; R i - Н, замещенная или незамещенная С1-С12-алкильная группа, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; X1 и Х 2 в отдельности и независимо друг от друга представляют собой соединяющую группу, где X1 - (СН2 )n, а Х2 выбирается из группы, состоящей из (CH2)n, (CH2)n OCO, (CH2)nNHCO и (CH2) nCO; n - целое число в диапазоне от 1 до 10; и F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из гидроксильной группы, карбоксильной группы, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеимида, пиридиндисульфида, способных взаимодействовать с амино-, гидроксильной или меркапто-группой терапевтического агента или субстрата с образованием ковалентной связи.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения: используется молекула Y-образного производного PEG

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

в которой R и R' в отдельности и независимо друг от друга представляют собой С1-С4-алкильную группу, предпочтительно метил; m и m' обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m' предпочтительно составляет от 600 до 1500; Ri - H, замещенная или незамещенная С1-С12-алкильная, замещенная арильная, аралкильная или гетероалкильная группа; j - целое число в диапазоне от 1 до 12; и F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из гидроксильной группы, карбоксильной группы, эфирной группы, хлорангидрида карбоновой кислоты, гидразида, малеимида, пиридиндисульфида, способных взаимодействовать с амино-, гидроксильной или меркапто-группой терапевтического агента или субстрата с образованием ковалентной связи. Предпочтительно средний общий молекулярный вес PEG находится в примерном диапазоне от 10000 до 60000 дальтон; наиболее предпочтительно, он равен примерно 40000 дальтонам.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения: возможная структурная формула молекулы Y-образного производного PEG (I) -

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R и R' в отдельности и независимо друг от друга представляют собой С1-С4-алкильную группу, предпочтительно метил; m и m' обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m' предпочтительно составляет от 600 до 1500; j - целое число в диапазоне от 1 до 12; и средний общий молекулярный вес PEG равен примерно 40000 дальтон.

С целью модификации интерферона-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b) авторы настоящего изобретерия использовали Y-образные разветвленные производные PEG (YPEG) и выделяли YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку, с помощью ионообменной хроматографии на Q-Сефарозе FF. Кроме того, выделенный YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку, дополнительно разделяли с помощью хроматографии на SP-Сефарозе FF с целью получения YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, в котором YPEG связан в основном с интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -NF2 боковой цепи остатка Lys в положении 134 аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID NO.1 (этот YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b называется YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (134)). Измерения показывают, что в условиях in vitro активность YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (134) значительно выше активности YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, в котором YPEG связан с другим аминокислотным остатком, и период полувыведения YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (134) из сыворотки значительно превосходит аналогичный показатель немодифицированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает получение IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, пегилированного по одному аминокислотному остатку, имеющего следующую структуру:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где Ра и Pb - одинаковые или разные PEG; j - целое число в диапазоне от 1 до 12; Ri - Н, замещенная или незамещенная С1-С12-алкильная группа, замещенная арильная, аралкильная или гетероалкильная группа; X1 и Х2 в отдельности и независимо друг от друга представляют собой соединяющую группу, где X 1 - (СН2)n, а Х2 выбирается из группы, состоящей из (CH2)n, (CH 2)nOCO, (CH2)nNHCO и (CH 2)nCO, где n - целое число в диапазоне от 1 до 10.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения: пегилированный IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению имеет следующую структурную формулу (II):

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R и R' в отдельности и независимо друг от друга представляют собой С1-С4-алкильную группу, предпочтительно метил; j - целое число в диапазоне от 1 до 12; m и m' обозначают степень полимеризации и могут быть любыми одинаковыми или разными целыми числами. В этой структуре Y-образная разветвленная молекула PEG связана с молекулой IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b посредством одного одиночного аминокислотного остатка. Средний молекулярный вес YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, имеющего формулу (II), зависит в основном от степени полимеризации, m и m'. При m+m', предпочтительно составляющем от 600 до 1500, соответствующий средний молекулярный вес YPEG находится в примерном диапазоне от 26000 до 66000 дальтон. При m+m', предпочтительно составляющем от 795 до 1030, соответствующий средний молекулярный вес YPEG находится в примерном диапазоне от 35000 до 45000 дальтон. При m+m', предпочтительно составляющем от 885 до 1030, соответствующий средний молекулярный вес YPEG находится в примерном диапазоне от 39000 до 45000 дальтон. При m+m', наиболее предпочтительно равном 910, соответствующий средний молекулярный вес YPEG равен 40000 дальтон. Диапазон соотношений m и m' может составлять от 0,5 до 1,5 и предпочтительно составляет от 0,8 до 1,2.

Предпочтительный вариант осуществления: молекула PEG в пегилированном IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению связана с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с помощью амидной связи, сформированной интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппой N-концевой аминокислоты или интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппой боковой цепи остатка Lys IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в положении 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 или 164 аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID No.1.

Другой предпочтительный вариант осуществления: молекула PEG в пегилированном IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению связана с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с помощью амидной связи, сформированной в основном интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппой боковой цепи остатка Lys IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в положении 134 аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID No.1.

По выбору, IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению может быть экстрагирован из естественных источников или получен с помощью рекомбинантной биотехнологии. Предпочтительно данный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b является человеческим IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (hIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b), имеющим аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID No.1, и экстрагируемым из естественных источников или получаемым с помощью рекомбинантной биотехнологии. Более предпочтительно данный человеческий IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b является рекомбинантным человеческим IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b). Данный rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b может быть искусственно синтезирован или экспрессирован прокариотными экспрессионными системами (например, Е. coli), или экспрессирован эукариотными дрожжевыми экспрессионными системами (например, Pichia), или экспрессирован экспрессионными системами клеток насекомых или экспрессионными системами клеток млекопитающих (например, клеток яичника китайского хомячка). В технике известны способы получения препаратов естественных или рекомбинантных IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и способы проверки активности IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG.

Как и IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению может быть использован в клинике для лечения опухолей и вирусных инфекций - например, гепатита, волосатоклеточного лейкоза, клеточно-опосредованного лимфолиза, саркомы Капоши и т.д. В клиническом отношении YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению имеет четкие преимущества по сравнению с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с точки зрения стабильности, растворимости, периода полувыведения из сыворотки и клинической терапевтической эффективности. Что касается способа введения препарата, YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению можно вводить пациентам в составах, содержащих фармацевтически эффективное количество YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и фармацевтически приемлемый носитель или неактивное вещество. Таким образом, другой признак настоящего изобретения связан с составом, содержащим фармацевтически эффективное количество пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или неактивное вещество. Предпочтительно состав содержит маннитол, аминокислоты, хлорид натрия и ацетат натрия, при этом аминокислоты предпочтительно выбраны из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, аспарагина и глицина.

Следующий признак настоящего изобретения связан с использованием пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению или состава, содержащего пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по настоящему изобретению, в лекарственном препарате для лечения заболевания, требующего применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b. Предпочтительно болезнь, требующая применения лечения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, выбрана из группы, состоящей из вирусных инфекций (например, гепатита В, гепатита С, гепатита D и остроконечной кондиломы), опухолей (например, волосатоклеточного лейкоза, хронического миелолейкоза, неходжкинской лимфомы низкой степени злокачественности, клеточно-опосредованного лимфолиза, саркомы Капоши, миеломной болезни, злокачественной меланомы, кожной Т-клеточной лимфомы, папилломы гортани, рецидива почечно-клеточного рака или метастатического почечно-клеточного рака), воспалительных патологических состояний и заболеваний (например, рассеянного склероза, артрита, бронхиальной астмы, муковисцидоза и интерстициальных заболеваний легких) и тромбоцитемии, связанной с миелопролиферативными заболеваниями.

Вариант осуществления настоящего изобретения: с целью получения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG, в первую очередь полиэтиленгликольную часть активированного производного YPEG (например, N-гидроксилсукцинимидилового эфира PEG (YPEG-NHS)) посредством нуклеофильного замещения ковалентно присоединяют к аминогруппе (-NH2) белка, причем данной аминогруппой является N-концевая интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппа белка и интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппа остатка Lys. Уравнение реакции образования YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b из IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и YPEG представлено ниже:

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

Условия реакции мягкие, рН равно от 4,5 до 9,5, температура - от 0 до 25°С; требуется перемешивание или использование других приемов, обеспечивающих смешивание взаимодействующих веществ. Подробное описание условий представлено в Примерах раздела "Подробное описание изобретения". С помощью вышеописанного способа к IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b может быть присоединен любой YPEG независимо от его молекулярного веса. Получаемые продукты включают в себя YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку (YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b); YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по двум аминокислотным остаткам (YPEG2-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b); и YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по многим аминокислотным остаткам (YPEGn-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b), причем путем коррекции условий реакции можно обеспечить преобладание среди продуктов реакции YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного PEG по одному аминокислотному остатку.

Затем YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку, может быть выделен из смеси всех видов IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG, с помощью, например, катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии, после чего IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по разным одиночным аминокислотным остаткам, может быть подвергнут дополнительному разделению с целью получения YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, в котором YPEG присоединен в определенном положении. Обычные способы очистки включают в себя катионообменную хроматографию, анионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и эксклюзионную хроматографию. С целью отделения продуктов, модифицированных PEG по одному аминокислотному остатку, от продуктов, модифицированных PEG по двум или большему количеству аминокислотных остатков, и немодифицированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2bC, может быть выполнен характеристический анализ с помощью способа, известного в технике - например, анализ молекулярного веса продуктов с помощью масс-спектроскопии, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии. Кроме того, вышеуказанные способы очистки могут быть использованы для дополнительного разделения продуктов, модифицированных PEG по одному аминокислотному остатку, с целью получения различных изомеров, модифицированных PEG по разным единственным положениям. С помощью любого известного количественного анализа активности IFN (например, теста ингибирования цитопатического эффекта) может быть оценена биологическая активность любого вида продуктов, модифицированных PEG, in vitro. В IFN, модифицированных PEG по одному аминокислотному остатку, полиэтиленгликольные части разных изомеров в неодинаковой степени поддерживают активные домены IFN, вследствие чего изомеры резко отличаются друг от друга в отношении биологической активности. В целом, после модификации PEG активность IFN in vitro существенно снижается. Вместе с тем определение удельной активности in vitro изолятов трех пиков, полученных с помощью ионообменной хроматографии в соответствии с настоящим изобретением, показало, что изолят пика № 3 (SP2) обладает значительно более высокой удельной активностью по сравнению с изолятами других пиков и PEGASYS (Хоффманн-Ля Рош, Базель, Швейцария), а также имеет значительно больший период полувыведения из сыворотки по сравнению с немодифицированным IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

Другой вариант осуществления: пептид, соединенный с Y-разветвленным PEG, выделенный из пика SP2, секвенируют с помощью разложения по Эдману; получаемые результаты показывают, что основным компонентом пика SP2 является YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (134).

Таким образом, другой признак настоящего изобретения связан с получением и способами очистки YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (134), включающими в себя следующее:

(а) в щелочной среде, предпочтительно при рН 9,0, проводят реакцию Y-образного разветвленного PEG, соответствующего формуле (I) (см. ниже), с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и получают пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b;

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R и R' в отдельности и независимо друг от друга представляют собой С1-С4-алкильную группу, предпочтительно метил; j - целое число в диапазоне от 1 до 12; m и m' обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m' предпочтительно составляет от 600 до 1500;

(б) извлекают продукты реакции, полученные на этапе (а), с помощью анионообменной смолы (предпочтительно Q Сефарозы FF) и элюируют данные продукты анионным (предпочтительно хлорид-ионным) градиентом, чтобы получить модифицированные продукты;

(в) элюируют продукты реакции, извлеченные на этапе (b), с помощью катионообменной смолы (предпочтительно SP Сефарозы FF) катионным (предпочтительно натриевым ионным) градиентом, собирая каждый пик в отдельности;

(г) определяют активность продукта каждого пика и выбирают пик, соответствующий продукту реакции, обладающему наиболее высокой активностью.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: ДСН-ПААГ (SDS-PAGE) двух партий IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG (40 кД). Концентрация разделяющего геля составляла 12%; в качестве красителя использовали бриллиантовый синий Кумасси R-250. Представленный на Фиг.1 результат ДСН-ПААГ показывает, что в указанных условиях уровень PEG-модификации rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b составлял от 30 до 50% и был стабильным. Основным модифицированным продуктом являлся IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку (YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b); кроме того, присутствовало некоторое количество IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного PEG по многим аминокислотным остаткам (YPEGn-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b). Дорожка 1: IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b; NHS-YPEG (40 кД): реакция модификации на этапе 0 часов; дорожка 2: Партия 060604-1 IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b; NHS-YPEG (40 кД): реакция модификации на этапе 2 часов; дорожка 3: Партия 060604-2 IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b; NHS-YPEG (40 кД): реакция модификации на этапе 2 часов; дорожка 4: маркер (ДжиИ Лайфсайенсиз).

Фиг.2: Профиль разделения модификационных изомеров YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b на SP-Сефарозе FF.

Фиг.3: ДСН-ПААГ (12%) с окрашиванием серебром: пробы YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, очищенные с помощью SP-Сефарозы FF. Дорожка 1: маркер молекулярного веса (ДжиИ Лайфсайенсиз); дорожка 2: пик № 1 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, полученный при очистке с помощью SP-Сефарозы FF; дорожка 3: пик № 2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, полученный при очистке с помощью SP-Сефарозы FF; дорожка 4: пик № 3 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, полученный при очистке с помощью SP-Сефарозы FF; дорожка 5: пик № 4 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, полученный при очистке с помощью SP-Сефарозы FF.

Фиг.4: Кажущийся молекулярный вес пробы YPEG-rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, очищенной с помощью SP-Сефарозы FF, определенный с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях (концентрация геля - 7,5%) с применением окрашивания серебром. Дорожка 1: маркер молекулярного веса (ДжиИ Лайфсайенсиз); дорожка 2: пик SP1 YPEG-HuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, 2 мкг; дорожка 3: пик SP2 YPEG-rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, 2 мкг; дорожка 4: пик SP3 YPEG-rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, 2 мкг.

Фиг.5: Молекулярные веса проб YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, очищенных SP-Сефарозой FF, определенные с помощью MALDI-TOF MS.

Фиг.6: Молекулярный вес YPEG-NHS (40 кД), определенный с помощью MALDI-TOF MS.

Фиг.7: Концентрация и активность препарата в сыворотке после одной подкожной инъекции YPEG-rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b макаке-крабоеду (Масаса fascicularis) в дозе 30 мкг/кг.

Фиг.8: Слепой контроль: трипсиназное картирование пептидов пика SP2 YPEG-rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, переваренного трипсином. Были выявлены два небольших пика соответственно при 71,674 мин и 17,589 мин; и в интервале между 2 и 3 минутами был выявлен пик трипсина.

Фиг.9: Трипсиназное картирование пептидов пробы пика SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, переваренного трипсином (0 часов): анализ с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ (C18). Время удерживания пика SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b составляло 62,114 мин, а пик элюции при 71,908 мин был фоном, 2-3 мин.

Фиг.10: Трипсиназное картирование пептидов пробы пика SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, переваренного трипсином (48 часов): анализ с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ (C18). Пика субстрата (62,114 мин) в интервале между 60,5 и 63,2 минутами выявлено не было, что свидетельствует о полном переваривании пробы.

Фиг.11: Профиль разделения пептидов, модифицированных YPEG, на Sephacryl S-100 HR, из пробы пика SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, полностью переваренной трипсином. Сбор проб осуществлялся в соответствии с пиками; S100-1 - пептиды, модифицированные YPEG - а именно целевая проба.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано примерами, приведенными ниже, однако ни один из этих примеров и ни одно из сочетаний примеров не следует рассматривать как ограничение области применения или вариантов осуществления данного изобретения. Область применения данного изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения. Специалисты в данной области техники, ознакомившись с настоящим документом и используя имеющиеся знания, могут сформировать четкое представление об области применения данного изобретения, ограничиваемой его формулой.

Пример 1

Получение рекомбинантного человеческого IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного Y-образным разветвленным PEG

(1) Получение небольшого количества рекомбинантного человеческого IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного Y-образным разветвленным PEG

Навеску YPEG (формула (I), средний молекулярный вес 40 кД, одинаковые ветви, партия № RD010P041, компания Бейцзин ЦзенКем Текнолоджи Ко., Лтд.), равную 166,1 мг, растворили в 1 мл 2 мМ раствора НСl (Гуандун Гуанхуа Кемикал Фэктори Ко., Лтд.). Затем к полученному раствору добавили 40 мг IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (Сиамень Амойтоп Байотек Ко., Лтд.) и 50 мМ буферный раствор борной кислоты-буры (рН 9,0, Синофарм Шанхай Кемикал Риэйджент Ко., Лтд.), доведя окончательный объем реакционной смеси до 10 мл. В этой реакционной системе конечная концентрация IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b составляла 4 мг/мл, и молярное соотношение взаимодействующих друг с другом IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и YPEG равнялось 1:2. В течение двух часов температуру реакционной системы поддерживали на уровне 0-20°С и осуществляли перемешивание смеси. Образовался пегилированный IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, и реакцию остановили добавлением ледяной уксусной кислоты (Шантоу Силон Кемикал Ко., Лтд.), обеспечившей снижение рН до уровня ниже 4,0. Был проведен электрофорез пробы в ДСН-ПААГ. Реакционную систему 50-кратно разбавили водой и профильтровали с помощью фильтра с размером пор 0,2 мкм; после этого реакционную систему до последующего использования хранили при температуре 4°С.

С помощью хроматографии на Q-Сефарозе FF осуществили разделение остатка PEG и гидролятов PEG; IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG по многим аминокислотным остаткам; IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG по одному аминокислотному остатку; и немодифицированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b. Колонку с Q-Сефарозой FF (ДжиИ Хелскейр) (Ф12 мм × 90 мм; один объем колонки (CV) = 10 мл) регенерировали тремя CV 20 мМ буферного раствора борной кислоты-буры (рН 9,0)-1 М раствора NaCl (БиБиАй), после чего уравновесили пятью CV 20 мМ буферного раствора борной кислоты-буры (рН 9,0). Установка длины волны УФ-детектирования - 280 нм. Загрузили всю пробу, хранившуюся при 4°С. После загрузки колонку уравновесили тремя CV буферного раствора борной кислоты-буры (рН 9,0), а затем элюировали 20 мМ буферным раствором борной кислоты/буры (рН 9,0)-12 мМ раствором NaCl до полного элюирования первого пика, являвшегося пиком остатка PEG. Затем элюировали 20 мМ буферным раствором борной кислоты/буры (рН 9,0)-60 мМ раствором NaCl; проба элюируемого при этом пика состояла в основном из YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного PEG по одному аминокислотному остатку. Затем элюировали 20 мМ буферным раствором борной кислоты/буры (рН 9,0)-500 мМ раствором NaCl; элюируемый при этом пик состоял из немодифицированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

Целевым продуктом был в основном YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку; выход составил 20-40%.

(2) Получение большого количества рекомбинантного человеческого IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного Y-образным разветвленным PEG

Навеску YPEG (формула (I), средний молекулярный вес 40 кД, одинаковые ветви, партия № RD010P041, компания Бейцзин ЦзенКем Текнолоджи Ко., Лтд.), равную 4982,4 мг, растворили в 25 мл 2 мМ раствора HCl. Затем к полученному раствору добавили 1200 мг IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и 50 мМ буферный раствор борной кислоты-буры (рН 9,0), доведя окончательный объем реакционной смеси до 200 мл. В этой реакционной системе конечная концентрация IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b составляла 6 мг/мл, и молярное соотношение взаимодействующих друг с другом IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и YPEG равнялось 1:2. В течение двух часов температуру реакционной системы поддерживали на уровне 0-25°С и осуществляли перемешивание смеси. Реакцию остановили добавлением ледяной уксусной кислоты, обеспечившей снижение рН до уровня ниже 4,0. Был проведен электрофорез пробы в ДСН-ПААГ. Реакционную систему 50-кратно разбавили водой и профильтровали с помощью фильтра с размером пор 0,2 мкм; после этого реакционную систему до последующего использования хранили при температуре 4°С.

С помощью хроматографии на Q-Сефарозе FF осуществили разделение остатка PEG и гидролятов PEG; IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG по многим аминокислотным остаткам; IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного YPEG по одному аминокислотному остатку; и немодифицированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b. Колонку с Q-Сефарозой FF (ДжиИ Хелскейр) (Ф38 мм × 265 мм; один объем колонки (CV)=300 мл) регенерировали тремя CV 20 мМ буферного раствора борной кислоты-буры (рН 9,0)-1 М раствора NaCl, после чего уравновесили пятью CV 20 мМ буферного раствора борной кислоты-буры (рН 9,0). Установка длины волны УФ-детектирования - 280 нм. Загрузили всю пробу, хранившуюся при 4°С. После загрузки колонку уравновесили тремя CV буферного раствора борной кислоты-буры (рН 9,0), а затем элюировали 20 мМ буферным раствором борной кислоты/буры (рН 9,0)-12 мМ раствором NaCl до полного элюирования первого пика, являвшегося пиком остатка PEG. Затем элюировали 20 мМ буферным раствором борной кислоты/буры (рН 9,0)-60 мМ раствором NaCl; проба элюируемого при этом пика состояла в основном из YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного PEG по одному аминокислотному остатку. Затем элюировали 20 мМ буферным раствором борной кислоты/буры (рН 9,0)-500 мМ раствором NaCl; элюируемый при этом пик состоял из немодифицированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

Целевым продуктом был в основном YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку; выход составил 35-50%.

На Фиг.1 представлены результаты электрофореза в ДСН-ПААГ, полученные в отношении двух партий IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированных YPEG (40 кД). Данные Фиг.1 показывают, что в описанных условиях уровень PEG-модификации rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b составлял от 35 до 50% и был стабильным. Основным модифицированным продуктом являлся IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированный PEG по одному аминокислотному остатку (YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b); кроме того, присутствовало некоторое количество IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, модифицированного PEG по многим аминокислотным остаткам (YPEGn-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b).

Пример 2

Разделение YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b на SP-Сефарозе FF

Уровень рН пробы YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, извлеченной Q-Сефарозой FF, довели до 5,0 20% раствором уксусной кислоты, после чего пробу 15-кратно разбавили 5 мМ раствором NaAc/HAc (рН 5,0, Шантоу Силон Кемикал Ко., Лтд.). Пробу загрузили в колонку (Ф18 мм × 394 мм) с SP-Сефарозой FF объемом 100 мл (GE Healthcare); емкость загрузки пробы составляла 0,5 мг/мл. Колонку уравновесили тремя CV 5 мМ раствора NaAc/HAc (рН 5,0), а затем осуществили элюирование 2,5 CV градиента от 0 до 30% 5 мМ NaAc/HAc-70 мМ NaCl (рН 5,0) с последующим элюированием 50 CV градиента от 30 до 100% 5 мМ NaAc/HAc-70 мМ NaCl (рН 5,0). В результате разделения YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b на SP-Сефарозе FF (100 мл) было получено 4 пика элюирования. Был осуществлен сбор проб в соответствии с данными пиками, после чего эти пробы были оценены с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с применением окрашивания серебром. Результаты электрофореза в ДСН-ПААГ показали, что 1-й пик, полученный на SP-Сефарозе FF, состоял в основном из продуктов, модифицированных YPEG по многим аминокислотным остаткам (YPEGn-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b). Второй пик, полученный на SP-Сефарозе FF, состоял в основном из продуктов, модифицированных PEG по одному аминокислотному остатку (YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b), а также содержал некоторые продукты, модифицированные PEG по многим аминокислотным остаткам. Третий и 4-й пики, полученные на SP-Сефарозе FF, состояли из продуктов, модифицированных PEG по одному аминокислотному остатку. Второй, 3-й и 4-й пики, полученные на SP-Сефарозе FF, состояли из изомеров, модифицированных YPEG по разным единственным положениям; эти пики были названы соответственно "пик SP1 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b", "пик SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b" и "пик SP3 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b". Профиль разделения и результаты электрофореза в ДСН-ПААГ с применением окрашивания серебром представлены соответственно на Фиг.2 и Фиг.3.

В каждую пробу пиков SP1-3 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b добавили хлорид натрия, ацетат натрия, маннитол и аспарагиновую кислоту, после чего пробы простерилизовали с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и оставили на хранение при температуре 4°С с целью последующего использования.

Пример 3

Характеристический анализ модификационных изомеров YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b

(1) Концентрация белка

С помощью метода Кьельдаля была определена концентрация модификационных изомеров YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

(2) Кажущийся молекулярный вес белка

С помощью электрофореза в ДСН-ПААГ был определен кажущийся молекулярный вес модификационных изомеров YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b. Был использован метод Laemmli с соавт. (Nature 227: 680, 1970). Концентрация геля составляла 7,5%; визуализация геля осуществлялась с помощью окрашивания серебром. Кажущийся молекулярный вес модификационных изомеров YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b был почти одинаковым и составлял примерно 123 кД (Фиг.4).

(3) Молекулярный вес был определен с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-ТОФ)

С целью определения молекулярных весов модификационных изомеров YPEG-rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b была использована масс-спектрометрия MALDI-TOF (система Autoflex TOF/TOF, Брюкер Дальтоникс, Германия). В качестве матрицы была использована синапиновая кислота (SA, C11H 12O5, MB 224,22, номер партии: 2006236870002, Брюкер Дальтоникс, Германия). В качестве стандарта молекулярного веса белка был использован Калибрационный стандарт для белка II (часть № 207234, Брюкер Дальтоникс, Германия); с целью анализа данных было использовано программное обеспечение FlexAnalysis Версия 3.0.54.0. Молекулярный вес модификационных изомеров YPEG-rHuIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, установленный с помощью масс-спектрометрии, был почти одинаковым и составлял примерно 59000 Дальтон (Фиг.5).

(4) Тест содержания эндотоксинов

Был проведен тест содержания эндотоксинов с использованием лизата амебецитов мечехвоста Limulus poliphemus (Фармакопея Китайской Народной Республики, 2005, том 3, Приложение Х С); было установлено, что во всех пробах YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b содержание эндотоксинов составляло менее 5,0 ЭЕ/мг.

(5) Активность in vivo и фармакокинетика SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b у животных

Активность SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b in vivo у животных

Одним из элементов механизма действия IFN является индукция выработки 2',5'-AS (2',5'-олигоаденилатсинтетазы), которая, в свою очередь, обладает противовирусным действием. С помощью маркера 125 I можно оценить активность 2',5'-AS in vivo, отражающую фармакодинамические свойства IFN. 2',5'-AS катализирует синтез 2',5'-А (2',5'-олигоаденилата) из АТФ в присутствии Поли(I)·Поли(С)-агара. (Активность 2',5'-AS можно выразить через концентрацию синтезированного 2',5'-А.) Сначала присутствующую в пробах 2',5'-AS абсорбируют и активируют Поли(I)·Поли(С)-агарозой, а затем катализируют синтез 2',5'-А из АТФ. К пробе добавляют смесь 2',5'-А, меченного 125I, сыворотки с антителами против 2',5'-А и вторичных антител, инкубируют и центрифугируют с целью разделения смеси. Надосадочную жидкость выбрасывают и с помощью гамма-счетчика измеряют радиоактивность осадка. Рассчитывают уровень связывания первоначально добавленного 2',5'-А, меченного 125 I. С помощью модели логарифмической регрессии, основанной на четырех параметрах, получают стандартную кривую, а затем определяют концентрацию 2',5'-А, индуцированного 2',5'-AS, в исследуемой пробе.

В таблице 1 и на Фиг.7 представлены данные, полученные с помощью вышеописанного способа, основанного на использовании 2',5'-А; представлена концентрация 2',5'-А в сыворотке после однократной подкожной инъекции SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в дозе 30 мкг/кг макаке-крабоеду (Масаса fascicularis) (18 макак крабоедов, Гуанси Веймей Байотекнолоджи Ко., Лтд., номер сертификации S.CXK GUI 2002-0001, вес тела 2,5-5,5 кг, 6 самок и 12 самцов, выращены в отдельных клетках, получали стандартный корм, предназначенный для обезьян, и свободный доступ к питью). Данные, представленные на Фиг.8, показывают, что средний интервал времени, предшествующий достижению максимальной концентрации, составлял 64±27,71 час, а максимальная концентрация составляла 292,30±148,08 пмоль/дЛ. После введения препарата отмечалось отчетливое возрастание активности 2',5'-AS в сыворотке, и интервал времени, предшествующий достижению максимума 2',5'-А в сыворотке, превышал интервал времени, предшествующий достижению максимума SP2 YPEG-rhIFNинтерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в сыворотке.

Таблица 1. Изменение концентраций 2',5'-А в сыворотке с течением времени после однократной подкожной инъекции SP2 YPEG-rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в дозе 30 мкг/кг макакам-крабоедам (моль/дЛ)

Время (часы) Номер макаки-крабоеда Средняя интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 Стандартное отклонение
12 3
0 19,32 13,6320,74 17,90 ±3,76
1 40,17218,67 - 129,42± 126,22
2 45,7414,30 80,23 46,76± 32,98
414,89 69,41138,23 74,18 +61,81
8 49,12243,43 141,66 144,74± 97,19
10119,51 274,99109,89 168,13 ±92,67
12 72,75152,81 112,87 112,81± 40,03
2410,05 321,23159,12 163,47 ±155,63
48 45,60622,42 164,49 277,50± 304,56
96 400,67352,65 123,58 292,30± 148,08
168 10,87286,38 4,17 100,47± 161,03
240 2,74323,83 10,48 112,35+ 183,19
31220,65 238,651,54 86,94 ±131,72

Фармакокинетика YPEG-IFNs-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b у макак-крабоедов

Макакам-крабоедам вводили однократную подкожную инъекцию YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в дозе 10, 30 или 100 мкг/кг. У этих животных из вены задней конечности, противоположной той конечности, которая была использована для введения препарата, брали 1 мл крови перед введением препарата, а также через 1, 2, 4, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240 и 312 часов после введения препарата. Отдельной группе животных вводили однократную подкожную инъекцию IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в дозе 30 мкг/кг; у этих животных 1 мл крови брали перед введением препарата, а также через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 24 часа после введения препарата. После выдерживания в течение 30 минут при температуре 4°С пробы крови центрифугировали со скоростью 2000 об/мин в течение 10 минут при низкой температуре, а затем сыворотку сразу же отделяли и хранили при -20°С до последующего анализа.

Был проведен количественный иммунологический анализ "двойной сэндвич". Поверхность лунок микротитровального планшета предварительно покрывали моноклональным антителом, специфически взаимодействующим с рекомбинантным человеческим IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 . Стандарт и пробы переносили пипеткой в микротитровальные лунки, в которых осуществлялось связывание IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b или SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с иммобилизованным антителом. Планшет промывали, чтобы удалить несвязанные вещества, а затем в лунки добавляли IgG против человеческого IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 (вторичное антитело). После завершения реакции планшет промывали и добавляли в лунки пероксидазу хрена (HRP). После удаления несвязанного фермента и реагентов с помощью промывания, в каждой лунке в результате добавления раствора субстрата HRP обнаруживалось окрашивание, пропорциональное количеству IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b или SP2 YPEG-rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, связанного на первом этапе реакции. Реакцию останавливали и измеряли интенсивность цвета. Чем выше оптическая плотность при соответствующих длинах волн, тем выше концентрация IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b или SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в исследуемой пробе. Получали стандартные кривые соответственно для IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, чтобы определить сывороточную концентрацию препарата в пробах крови.

В соответствии с протоколом теста, представленным в описании, прилагаемом к набору (Эмерикэн Байомедикал Ко., номер партии 3271), в каждую лунку поместили по 100 мкл стандарта или пробы крови и мягко перемешали с помощью планшетного миксера. Пробу разбавили разбавляющим раствором до уровня, соответствующего диапазону концентраций стандартной кривой, исходя из предполагаемой концентрации исследуемой пробы. Получили стандартную кривую IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b или SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b для каждого планшета, чтобы рассчитать концентрацию исследуемой пробы на данном планшете. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промыли один раз раствором для промывания планшетов. В каждую лунку добавили по 100 мкл раствора вторичных антител и выдерживали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшет промыли три раза, а затем в каждую лунку добавили по 100 мкл конъюгата HRP. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промыли четыре раза. В каждую лунку добавили по 100 мкл субстрата 5'-тетраметилбензидина (ТМВ) и выдерживали при комнатной температуре в темном месте в течение 15 минут. Затем в каждую лунку добавили по 100 мкл стоп-раствора и мягко перемешали с целью остановки реакции. В ближайшие 5 мин с помощью считывающего устройства для микропланшетов измерили оптическую плотность при длине волны 450 нм, чтобы определить концентрацию каждой пробы.

Период полувыведения после однократной подкожной инъекции макаке-крабоеду низкой, средней или высокой дозы YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (соответственно 10, 30 или 100 мкг/кг) составил соответственно 48,87±11,67, 51,94±3,52 и 49,60±2,97 часа. Период полувыведения после однократной подкожной инъекции макаке-крабоеду дозы IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, равной 30 мкг/кг, составил 3,22±0,10 часа. После YPEG-модификации IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b период полувыведения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b увеличился не менее чем в десять раз.

(6) С помощью теста ингибирования цитопатического эффекта была оценена биологическая активность каждого модификационного изомера YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b in vitro. Интерферон обеспечивал защиту амниотических клеток человека (WISH) от повреждений, вызываемых вирусом везикулярного стоматита (VSV), в соответствии со способом, описанным в "Способе определения активности интерферона" Фармакопеи Китайской Народной Республики (2005, том 3, Приложение Х С). Выжившие клетки WISH окрасили кристалвиолетом и измерили оптическую плотность при длине волны 570 нм. Построили кривую защитного эффекта интерферона для клеток WISH, чтобы определить биологическую активность интерферонов in vitro. В таблице 2 представлены результаты оценки биологической активности in vitro для каждой пробы; в связи с каждой пробой были проведены три параллельных теста. Для всех YPEG-модифицированных изомеров продуктов, модифицированных PEG по одиночному аминокислотному остатку, проба SP2 продемонстрировала наивысшую удельную активность in vitro; ее активность в 1-2 раза превышала активность SP1, SP3 и ПЕГАСИСА (производитель - компания Хоффманн-Ля Рош, Базель, Швейцария; отдельная упаковка осуществлена компанией Шанхай Рош Фармасьютикалс Лтд., номер партии продукта В1016, номер партии упаковки SH0020), а также в 1-2 раза превышала активность неразделенной пробы.

Таблица 2
Данные биологической активности in vitro для каждого модификационного изомера YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (3 параллельных теста)
ПробаВид PEG MB PEG (кД) Количество положений модификации Средняя удельная активность (×106 МЕ/мг)
SP1 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2bY-разветвленный 40 11,07±0,172
SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2bY-разветвленный 40 12,65±0,185
SP3 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2bY-разветвленный 40 11,13±0,215
Неразделенная проба YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2bY-разветвленный 40 11,68±0,217
ПЕГАСИС U-разветвленный 40 10,934±0,042
Примечание: Неразделенная проба - это проба перед разделением YPEG-rhIFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b на SP-Сефарозе FF.

(7) Разделение SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по положениям модификации

Система растворителя SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b была заменена 50 мМ раствором NH4HCO 3 (рН 8,0) посредством ультрафильтрации с использованием ультрафильтра 5K (Миллипор, полиэфирсульфоновый материал); с помощью УФ-спектроскопии было установлено, что концентрация белка равна 3,82 мг/мл. ТРСK-трипсин (Промега) был растворен в растворе, предоставленном производителем (концентрация 0,5 мкг/мкл). Пробы были добавлены в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3
Состав реакционной смеси при переваривании SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b трипсином
Состав реакционной смеси Объем
50 мМ раствор NH4HCO3, рН 8,0 7,08 мл
SP2 PEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (3,82 мг/мл) 1,32 мл
Трипсин (0,5 мкг/мкл) 0,2 мл
Общий объем реакционной смеси 8,6 мл

Реакционную систему выдерживали в водяной бане при температуре 37°С в течение 48 часов; после этого с целью остановки реакции добавляли 1,52 мл 20% уксусной кислоты. Брали небольшое количество пробы для проведения картирования пептидов с помощью HPLC-RP С18. С целью проведения данного анализа использовали систему ВЭЖХ Waters с контроллером типа 600 и детектором типа 2487 с двойной длиной волны; с целью обработки данных использовали программное обеспечение Empower 2. Была использована аналитическая колонка для ВЭЖХ Jupiter С18 (диаметр частиц - 5 мкм, диаметр пор - 300 Å, Ф 4,6×150 мм, производитель - Феноменекс, США). Подвижная фаза А - 0,1% трифторуксусная кислота/Н2О; подвижная фаза В - 0,1% трифторуксусная кислота/90% ацетонитрил/Н2О; расход составлял 1 мл/мин; и длина волны детекции была установлена на 214 нм. В таблице 4 указаны градиенты элюирования; полученные результаты приведены на Фиг.8-10.

Таблица 4
Градиенты элюирования при картировании пептидов пробы пика SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, переваренного трипсином, с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ (C18)
интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 Время (мин) А % В %ACN %
1 0100 00
2 8100 00
3 6840 6054
4 7240 6054
5 75100 00
6 80100 00

Результаты детектирования показывают, что данная проба была переварена почти полностью. Полученные продукты после остановки реакции были обработаны восстановителем дитиотреитолом (ДТТ). Колонка Sephacryl S-100HR (Ф 18×255 мм, 1 CV=64 мл; ДжиИ Хелскейр) была предварительно уравновешена тремя CV 20 мМ PBNa-400 мМ NaCl (pH 7,0), и 3% CV пробы SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, полностью переваренной ТРСК-трипсином, загрузили под гидростатическим давлением. С целью элюирования использовали 20 мМ PBNa-400 мМ NaCl (pH 7,0); установка длины волны детектирования - 280 нм. Собрали пробу первого пика элюирования (номер пробы: YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b S100-1, Фиг.11) и с применением ультрафильтра 5K систему растворителя сменили на 5 мМ PBNa (pH 7,0). Осуществили вакуумную лиофилизацию. С помощью разложения по Эдману были определены N-концевые аминокислоты лиофилизированной пробы; была выявлена последовательность семи аминокислот XYSPXAW на N-конце пробы (таблица 5), где буквой "X" обозначена интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминокислота цистеин (Cys), не-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминокислота или другая модифицированная аминокислота, которая не может быть детектирована с помощью разложения по Эдману. Последовательность, обозначенная как SEQ ID NO:1, показывает, что пик SP2 YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b состоял в основном из продуктов, модифицированных YPEG по Lys134.

Таблица 5
Результат секвенирования N-концевых аминокислот YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b S100-1
ПробаДетектированная N-концевая последовательность Соответствующее положение PEG-модификации
YPEG-IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b S100-1 XYSPXAWLys134
Примечание: буквой "X" обозначена интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминокислота цистеин, не-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминокислота или другая модифицированная аминокислота, которая не может быть детектирована с помощью разложения по Эдману.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пегилированный интерферон-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b (IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b), имеющий нижеуказанную структурную формулу, получаемый соединением IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с Y-образным разветвленным полиэтиленгликолем (YPEG):

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R и R' - в отдельности и независимо друг от друга представляют собой

С1-С4-алкильную группу,

j - целое число от 1 до 12 и

m и m' обозначают степень полимеризации и могут быть целыми числами, при этом m+m' составляет от 600 до 1500,

где YPEG связан с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b с помощью амидной связи, сформированной интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 -аминогруппой боковой цепи остатка Lys в IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b в положении 134 в SEQ ID No.1.

2. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.1, в котором средний общий молекулярный вес YPEG составляет примерно от 10000 до 60000 Дальтон.

3. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.1, в котором R и R' являются метилом.

4. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.1, в котором средний общий молекулярный вес YPEG составляет примерно 40000 Дальтон.

5. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по любому из пп.1-4, где IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b экстрагируют из естественного источника или получают с помощью рекомбинантной биотехнологии.

6. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.5, где IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b является человеческим IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, имеющим аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID No.1.

7. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.5, где IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b является рекомбинантным человеческим IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

8. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.7, где рекомбинантный человеческий IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b искусственно синтезируется или экспрессируется экспрессионной системой, выбранной из группы, состоящей из прокариотной экспрессионной системы, такой как Е. соli, эукариотной дрожжевой экспрессионной системы, такой как Pichia, экспрессионной системы клеток насекомых или экспрессионной системы клеток млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка.

9. Пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по любому из пп.1-4, 6-8, в котором YPEG представляет собой YPEG с одинаковыми ветвями, имеющий молекулярный вес 40000 Дальтон.

10. Состав для лечения заболевания, требующего применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, состоящий из фармацевтически эффективного количества пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемого носителя или неактивного вещества.

11. Состав по п.10, дополнительно содержащий маннитол, аминокислоту, хлорид натрия и ацетат натрия.

12. Состав по п.11, в котором аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, аспарагина и глицина.

13. Применение пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по любому из пп.1-9 или состава по любому из пп.10-12 для получения лекарственного препарата для лечения заболевания, требующего применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b.

14. Применение пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по п.13, где в качестве заболевания выбирают заболевание из группы, состоящей из вирусных инфекций, например гепатита В, гепатита С, гепатита D, и остроконечной кондиломы, опухолей, например волосатоклеточного лейкоза, хронического миелолейкоза, неходжкинской лимфомы низкой степени злокачественности, клеточно-опосредованного лимфолиза, саркомы Капоши, миеломной болезни, злокачественной меланомы, кожной Т-клеточной лимфомы, папилломы гортани, рецидива почечно-клеточного рака или метастатического почечно-клеточного рака, воспалительных патологических состояний и заболеваний, например рассеянного склероза, артрита, бронхиальной астмы, муковисцидоза и интерстициальных заболеваний легких и тромбоцитемии, связанной с миелопролиферативными заболеваниями.

15. Способ получения и очистки пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по любому из пп.1-9, состоящий из следующих этапов:

(а) в щелочной среде проводят реакцию Y-образного разветвленного PEG, соответствующего нижеприведенной формуле, с IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и получают пегилированный IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b;

интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134

где R и R' в отдельности и независимо друг от друга представляют собой

С1-С4-алкильную группу,

j - целое число от 1 до 12;

m и m' обозначают степень полимеризации и могут быть целыми числами, при этом m+m' составляет от 600 до 1500;

(б) извлекают продукты реакции, полученные на этапе (а), с помощью анионообменной смолы и элюируют данные продукты анионным градиентом, чтобы получить модифицированные продукты;

(в) элюируют продукты реакции, извлеченные на этапе (b), с помощью катионообменной смолы катионным градиентом и собирают каждый пик в отдельности;

(г) определяют активность продукта каждого пика и выбирают пик, соответствующий продукту реакции, обладающему наиболее высокой активностью.

16. Способ по п.15, в котором на этапе (а) реакцию Y-образного разветвленного PEG проводят при рН 9,0.

17. Способ по п.15, в котором R и R' являются метилом.

18. Способ по п.15, в котором в качестве анионообменной смолы используют Q Сефарозу FF.

19. Способ по п.15, в котором в качестве анионного градиента используют хлоридионный градиент.

20. Способ по п.15, в котором в качестве катионообменной смолы используют SP Сефарозу FF.

21. Способ по п.15, в котором в качестве катионного градиента используют натриевый ионный градиент.

22. Способ по п.15, в котором YPEG имеет молекулярный вес 40000 Дальтон.

23. Способ по п.22, в котором в качестве YPEG используют YPEG с одинаковыми ветвями.

24. Способ по п.22, в котором молярное соотношение взаимодействующих друг с другом IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b и YPEG составляет 1:2.

25. Способ лечения больных, страдающих заболеванием, требующим применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, заключающийся во введении больному терапевтически эффективного количества пегилированного IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b по любому из пп.1-9 или состава по любому из пп.10-12.

26. Способ по п.25, в котором в качестве заболевания, требующего применения IFN-интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение   препарата и его применение, патент № 2485134 2b, выбирают заболевание из группы, состоящей из вирусных инфекций, например гепатита В, гепатита С, гепатита D, и остроконечной кондиломы, опухолей, например волосатоклеточного лейкоза, хронического миелолейкоза, неходжкинской лимфомы низкой степени злокачественности, клеточно-опосредованного лимфолиза, саркомы Капоши, миеломной болезни, злокачественной меланомы, кожной Т-клеточной лимфомы, папилломы гортани, рецидива почечно-клеточного рака или метастатического почечно-клеточного рака, воспалительных патологических состояний и заболеваний, например рассеянного склероза, артрита, бронхиальной астмы, муковисцидоза и интерстициальных заболеваний легких и тромбоцитемии, связанной с миелопролиферативными заболеваниями.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2485134

patent-2485134.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K14/56 альфа-интерферон

Патенты РФ в классе C07K14/56:
гибридный белок, обладающий пролонгированным действием, на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека (варианты), способ его получения и штамм saccharomyces cerevisiae для осуществления этого способа (варианты) -  патент 2515913 (20.05.2014)
новый функционально активный высокоочищенный стабильный конъюгат интерферона с полиэтиленгликолем, представленный одним позиционным изомером пэг-n h-ифн, с уменьшенной иммуногенностью, с пролонгированным биологическим действием, пригодный для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе -  патент 2447083 (10.04.2012)
способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека -  патент 2432401 (27.10.2011)
рекомбинантная плазмидная днк pfastbac-b17r, содержащая фрагмент генома вируса оспы коров, кодирующий альфа/бета-интерферонсвязывающий белок и штамм бакуловируса bvb17rg, продуцирующий растворимый альфа/бета-интерферонсвязывающий белок вируса оспы коров -  патент 2405824 (10.12.2010)
лекарственное средство на основе модифицированного интерферона альфа с пролонгированным терапевтическим действием -  патент 2382048 (20.02.2010)
полипептид, обладающий противовирусной, антипролиферативной и/или иммуномодулирующей активностью, выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид и их применение -  патент 2328528 (10.07.2008)
конъюгаты белка и производного полиэтиленгликоля, фармацевтическая композиция, способ борьбы с вирусной инфекцией -  патент 2298560 (10.05.2007)
способ получения рекомбинантного интерферона альфа-2b и интерферонсодержащий препарат (варианты) -  патент 2294372 (27.02.2007)
рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения -  патент 2230117 (10.06.2004)
способ определения цитокинового статуса человека на генетическом уровне -  патент 2181773 (27.04.2002)

Класс C07K17/08 с носителем, являющимся синтетическим полимером

Патенты РФ в классе C07K17/08:
новый вариант эксендина и его конъюгат -  патент 2528734 (20.09.2014)
пэг-модифицированный эксендин или аналог эксендина и его композиции и применение -  патент 2498814 (20.11.2013)
пептидное производное - миметик эритропоэтина и его фармацевтические соли, их получение и применение -  патент 2493168 (20.09.2013)
гормон роста, модифицированный двухцепочечным полиэтиленгликолем, способ его получения и применение -  патент 2488598 (27.07.2013)
способ направленной доставки днк в опухолевые и стволовые клетки -  патент 2408607 (10.01.2011)
способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения -  патент 2396342 (10.08.2010)
способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей -  патент 2381238 (10.02.2010)
способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа -  патент 2341286 (20.12.2008)
способ формирования белковых пленок на твердых подложках -  патент 2317100 (20.02.2008)
применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах -  патент 2309959 (10.11.2007)

Класс A61K38/21 интерфероны

Патенты РФ в классе A61K38/21:
способ приготовления средства, обладающего свойством стимуляции регенерации хрящевой, костной, мышечной тканей и способ стимуляции регенерации хрящевой, костной, мышечной тканей с использованием приготовленного средства -  патент 2527701 (10.09.2014)
способ защиты организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа h1n1 вируса гриппа а препаратом на основе альфа-2 интерферона человека -  патент 2523554 (20.07.2014)
лекарственный препарат в суппозиториях для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных вирусом простого герпеса 1-го типа и цитомегаловирусом и способ лечения им детей -  патент 2521272 (27.06.2014)
лекарственный препарат комплексного действия и способ его производства -  патент 2519553 (10.06.2014)
способ лечения язвенной болезни желудка и/или двенадцатиперстной кишки -  патент 2517789 (27.05.2014)
способ выбора патогенетически обусловленной тактики лечения вирусных заболеваний глаз -  патент 2494741 (10.10.2013)
полифункциональное комбинированное лекарственное средство для коррекции иммунодефицитных состояний и лечения тяжелых инфекционно-воспалительных заболеваний -  патент 2491087 (27.08.2013)
фармацевтическая композиция в форме геля для профилактики и лечения заболеваний пародонта - дентоферон -  патент 2490006 (20.08.2013)
способ лечения вирусных гепатитов -  патент 2489154 (10.08.2013)
лекарственное средство, обладающее противовирусным, противовоспалительным, иммуномодулирующим и обезболивающим действием, для местного и наружного применения - герпферон 2 -  патент 2488405 (27.07.2013)

Класс A61P31/12 противовирусные средства

Патенты РФ в классе A61P31/12:
способ получения алкилбензилдиметиламмонийфторидов, обладающих противовирусным и антибактериальным действием -  патент 2529790 (27.09.2014)
5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-альфа]пиримидинид l-аргининия моногидрат -  патент 2529487 (27.09.2014)
новое производное пиразол-3-карбоксамида, обладающее антагонистической активностью в отношении рецептора 5-нт2в -  патент 2528406 (20.09.2014)
фармацевтическая композиция и способ получения противовирусных фракций (антивирус-с) -  патент 2526799 (27.08.2014)
средство для снижения репродукции вируса гепатита с -  патент 2526179 (20.08.2014)
применение соли ацетилсалициловой кислоты для лечения вирусных инфекций -  патент 2524304 (27.07.2014)
пептидные производные 1-(1-адамантил)этиламина и их противовирусное действие -  патент 2524216 (27.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
способ изготовления вакцины против ящура -  патент 2522868 (20.07.2014)
способ получения антирабической вакцины -  патент 2522866 (20.07.2014)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

Патенты РФ в классе A61P35/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)


Наверх