штамм бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 - деструктор нефти и нефтепродуктов

Классы МПК:C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
B09C1/10 микробиологическими способами или с использованием ферментов
C02F3/34 отличающаяся используемыми микроорганизмами
C02F101/32 углеводороды, например масла
C12R1/38 Pseudomonas
Автор(ы):
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-04-16
публикация патента:

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты, в частности дизельное топливо. Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от+8 до +30°С. 3 табл., 5 пр.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 - деструктор нефти и нефтепродуктов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при очистке почвы и поверхностных вод при попадании в окружающую среду нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо).

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (SU 1493666), Flavobacterium tirrennicum (SU 1409594), которые осуществляют деструкцию нефтепродуктов в воде, но не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetronacter sp. HB-1 (RU 2077579); Acinetronacter sp. JN-2 (RU 2064017), Pseudomonas alcaligenes E7 (RU 2134723), Pseudomonas putida 36 (SU 1076446), пригодные для очистки почвы от нефти, но процесс утилизации резко замедляется при понижении температуры ниже 20°С, что затрудняет их использование в условиях Севера.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (RU 2019527), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Pseudomonas panipatensis С71, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур (от +8 до +30°С).

Штамм Pseudomonas panipatensis C71 выделен из воды открытого водоема (озеро Халы-Балы, село Чапчылган, Амгинский район, Республика Саха (Якутия)), загрязненного арктическим дизельным топливом, с пробы, отобранной с глубины 10 см, в удалении 1 м от берега.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) (Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ВКПМ В-10593.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Это микроскопическая характеристика (внешний вид под микроскопом). Грамотрицательные подвижные палочки размером 2,0-3,0×0,6-0,8 мкм. Спор и капсул не образуют. В мазках располагаются беспорядочно, одиночно или короткими цепочками (по 2-3).

На питательном агаре (масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 7,1-7,5) и на мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2) через 24 часа штамм формирует дискообразные, влажные, пастообразной консистенции S - колонии сероватого или грязно-голубоватого цвета диаметром 1,5-5 мм, легко снимающиеся с агара. При температуре выше +20°С штамм образует диффундирующий пигмент зеленого цвета, который при температуре +4°С может теряться и восстанавливаться при температуре от +20°С.

На среде Эндо (масс.%: панкреатический гидролизат рыбной муки - 1,2; экстракт пекарских дрожжей - 0,1; натрий хлористый - 0,34; сульфит натрия - 0,08; натрий фосфорнокислый двух замещенный - 0,05; фуксин основной - 0,02; лактоза - 1,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное) при рН 7,4±2 образует круглые с голубым оттенком колонии 0,5-3,0 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, с более плотным центром и плоским краем, блестящие, полупрозрачные, со временем приобретающие матовую поверхность.

На среде Сабуро (масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 6,0±3) образует круглые с сероватым оттенком колонии 1,0-5,0 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, блестящие, непрозрачные, через 24-72 ч приобретающие матовую поверхность и зеленый пигмент.

Штамм растет на минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо) следующего состава: (масс.%) KNO3 - 0,4; MgSO4·7H 2O - 0,08; NaCl - 0,1; K2HPO4 - 0,14; KH2PO4 - 0,06; агар - 2,0; нефть или дизельное топливо - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, в виде влажных непрозрачных голубоватых колоний диаметром 1-2 мм.

В мясопептонном бульоне (масс.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; рН 7,0-7,2) растет в виде диффузного помутнения.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм является аэробом. Быстро (в течение 24-72 часов) растет на средах с добавлением гидролизата рыбной муки, при температуре от +8°С до +41°С. Оптимум роста +30°С. Растет при рН 6,0-8,0. Растет в солевой среде с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Обладает оксидазной и каталазной активностью. В качестве источника углерода потребляет ацетат и цитрат. Восстанавливает нитраты. Денитрификационная активность отсутствует. Не гидролизует желатин. Обладает уреазной активностью. Не гидролизует крахмал. Лецитиназу не образует. Индолоотрицателен. Окисляет мальтозу и D-глюкозу. Не ферментирует глицерин, инозит, маннит, рамнозу, сорбит, раффинозу, арабинозу. Не окисляет сахарозу, маннит, ксилозу, арабинозу, фруктозу, галактозу. Не нуждается в дополнительных факторах роста.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°С.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

Штамм Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593 выделен из воды озера Халы-Балы (с.Чапчылган, Амгинский район. Центральная Якутия) следующим образом:

1,0 см3 исследуемой воды растирали шпателем на поверхности агаризированной питательной среды Мюнца следующего состава (масс.%): KNO3 - 0,4; MgSO4·7Н2О - 008; NaCl - 0,1; K 2HPO4 - 0,14; KH2PO4 - 0,06; агар - 2,0; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду в количестве 0,16 масс.%. Инкубирование проводили в термостате при температуре +8, +20 и +30°С в течение 1-10 суток. Образование голубоватых влажных колоний штамма Pseudomonas panipatensis C71 на среде Мюнца с нефтью происходит через 1-3 суток при температуре +30°С, через 4-6 суток при температуре +20°С, через 7-10 суток при температуре +8°С.

Пример 2. Приготовление бактериального изолята и препарата на основе клеток штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

Изолированные колонии штамма Pseudomonas panipatensis C71, полученные в примере 1, пересевают на скошенный мясопептонный агар и инкубируют 24 часа при температуре +30°С. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см3, с концентрацией 1×109 микробных клеток/см3 по оптическому стандарту ГИСК им.A.M.Тарасевича.

15,0 см3 суспензии полученного бактериального изолята вносят в 150 см3 среды состава (масс.%): K2HPO4 - 0,17; KH2PO4 - 0,14; NaCl - 0,2; глицерин - 2,0; пептон - 0,4; MnSO4·7H2O - 0,002 и культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов при температуре 29±1°С (рН 7,2).

Получают жидкую культуру зеленоватого оттенка с титром не менее 1 млрд клеток/см3 , которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593 в лабораторных условиях

В колбочки объемом 200,0 см3, содержащие по 100,0 см3 минеральной среды Мюнца, вносят суспензию бактериального изолята, полученного по примеру 2, доводят концентрацию до 1×10 9 микробных клеток на 1 см3 по оптическому стандарту ГИСК им.A.M.Тарасевича, и добавляют 1% нефти или дизельного топлива.

В качестве контроля используют такую же колбу со средой, нефтепродуктом, но без бактерий (для определения общих (естественных) потерь). Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, при температурах +8°С; +20°С и +30°С в течение 5 дней.

Содержание нефтепродуктов в среде определяют с помощью концентратометра «ИКН-025» (ФР.1.31.2007.03234). Степень деградации нефтепродуктов рассчитывают как отношение разницы исходного и остаточного содержания нефтепродуктов в воде к их исходному содержанию, выраженное в процентах,

Результаты, приведенные в табл.1, показывают, что в минеральной среде предлагаемый штамм уже на пятый день при температуре +8°С утилизирует 79,6% нефти и 40,0% дизельного топлива; при +20°С - 94,5% нефти и 48,5% дизельного топлива; при +30°С - 96,4% нефти и 67,7% дизельного топлива.

Таблица 1
Степень утилизации нефтепродуктов через 5 суток культивирования штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593
t°C (+) Нефть Дизельное топливо
До опыта, мгЧерез 5 суток, мгДеструкция, %До опыта, мг Через 5 суток, мг Деструкция, %
30 1000,035,62 96,43 1000,0322,96 67,70
201000,0 54,1594,59 1000,0 514,1848,58
8 1000,0203,96 79,60 1000,0599,54 40,05
Контроль1000,0 1000,0 0,01000,0 1000,00,0

Пример 4. Очистка ледовой воды от сырой нефти с помощью клеток штамма бактерий Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

В эксикатор объемом 5,0 дм3 вносят 3,0 дм3 ледовой воды и 30,0 см3 микробной суспензии бактериального изолята Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 (по примеру 1), содержащей 1,0·10 9 клеток/см3 суспензии. Для создания нефтяной пленки в емкости добавляют 30 г сырой неочищенной нефти. В качестве контроля используют ледовую воду в количестве 3,0 дм3 с добавлением 30 г нефти и без внесения микроорганизмов.

Эксперимент проводят в течение 2-х месяцев, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С.

Таблица 2
Динамика деструкции нефти в воде после внесения препарата на основе штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593
Вариант опыта Количество нефти до внесения клеток штамма, г Количество нефти через 60 дней после внесения клеток штамма, гСтепень утилизации нефти, %
Вода + нефть + клетки штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 30 0,499698,33
Вода + нефть 30 300,0

Полученные результаты (табл.2) показали, что деструкция нефти штаммом Pseudomonas panipatensis C71 В-10593 за 2 месяца составила 98,33%. Деструкция в контрольной емкости отсутствует.

Пример 5. Очистка почвы от нефтепродуктов с помощью клеток штамма бактерий Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной арктическим дизельным топливом, проведен в естественных условиях на территории Момского филиала ГУП «ЖКХ в PC (Я)» (п.Хонуу, Северо-восточная Якутия). Температура почвы в течение всего периода постановки эксперимента составляла в среднем на глубине 20 см +8°С; на глубине 10 см +13°С. Глубина проникновения нефтепродуктов составила в среднем 20 см.

Препарат на основе клеток штамма Pseudomonas panipatensis C71 ВКПМ В-10593 по примеру 2 вносят в почву, загрязненную нефтепродуктами, из расчета 1 литр препарата на 1 м2 загрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют в естественных условиях в течение 2 месяцев. Содержание нефтопродуктов в почве определяют в соответствии с РД 52.18.647-2003. Методические указания определения массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика измерений гравиметрическим методом.

Результаты исследований, приведенные в табл.3, показывают, что при температуре почвы в интервале от +8 до +13°С заявленный штамм в течение 2 месяцев осуществил деградацию арктического дизельного топлива на 91,71%

Таблица 3
Динамика деструкции нефтепродуктов в почве, загрязненной арктическим дизельным топливом
Вариант опытаСодержание нефтепродуктов до внесения штамма, мг/кг Содержание нефтепродуктов, через 2 месяца после внесения штамма, мг/кгДеструкция разлитого дизтоплива за 2 месяца, %
Почва + дизельное топливо + клетки штамма Pseudomonas panipatensis C71 В-1059318351 1521 91,71
Почва+дизельное топливо3260 1907 58,50

Таким образом, заявляемый штамм достаточно быстро утилизирует нефть и дизельное топливо в воде и почве в широком диапазоне температур (от +8 до +30°С).

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс B09C1/10 микробиологическими способами или с использованием ферментов

способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами -  патент 2529735 (27.09.2014)
способ детоксикации грунта, загрязненного нефтью и нефтепродуктами -  патент 2528198 (10.09.2014)
выделение белка, ответственного за восстановление урана (vi) -  патент 2527892 (10.09.2014)
способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
способ очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов спорообразующими бактериями bacillus vallismortis -  патент 2525930 (20.08.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
грунтошламовая смесь -  патент 2522317 (10.07.2014)
способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий exguobacterium mexicanum -  патент 2521654 (10.07.2014)
способ учета нефтеокисляющих бактерий в морской воде -  патент 2520084 (20.06.2014)
штамм rhodococcus sp.-деструктор нефтяных углеводородов -  патент 2518349 (10.06.2014)

Класс C02F3/34 отличающаяся используемыми микроорганизмами

биосорбент для ликвидации нефти с поверхности водоемов -  патент 2529771 (27.09.2014)
штамм rhodotorula sp. для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов -  патент 2526496 (20.08.2014)
способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
способ очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов спорообразующими бактериями bacillus vallismortis -  патент 2525930 (20.08.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий exguobacterium mexicanum -  патент 2521654 (10.07.2014)
способ очистки водного раствора, содержащего соль никеля, от ионов никеля. -  патент 2521653 (10.07.2014)
способ биологической очистки -  патент 2520561 (27.06.2014)
способ учета нефтеокисляющих бактерий в морской воде -  патент 2520084 (20.06.2014)
штамм rhodococcus sp.-деструктор нефтяных углеводородов -  патент 2518349 (10.06.2014)

Класс C02F101/32 углеводороды, например масла

способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
штамм бактерий exiguobacterium mexicanum - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2523584 (20.07.2014)
штамм бактерий bacillus vallismortis - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2513702 (20.04.2014)
способ очистки водного потока, выходящего после реакции фишера-тропша -  патент 2507163 (20.02.2014)
устройство для очистки ливнесточных вод -  патент 2489362 (10.08.2013)
способ увеличения потока воды из отстойного резервуара процесса переработки нефтеносных песков через мембранную систему разделения и очистки воды -  патент 2487085 (10.07.2013)
способ обезвреживания отходов, содержащих углеводороды, с одновременным осаждением растворенных солей металлов и устройство для его осуществления -  патент 2485400 (20.06.2013)
способ удаления органических компонентов из их смеси с водой и устройство для его осуществления -  патент 2477706 (20.03.2013)
способ очистки щелочных стоков нефтепереработки -  патент 2472718 (20.01.2013)
способ очистки нефтепромысловых вод -  патент 2465209 (27.10.2012)

Класс C12R1/38 Pseudomonas

способ очистки воды и мерзлотных почв от нефти и нефтепродуктов штаммом бактерий pseudomonas panipatensis вкпм в-10593 -  патент 2525932 (20.08.2014)
препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений и способ его получения -  патент 2516412 (20.05.2014)
ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов -  патент 2509150 (10.03.2014)
штамм rhodococcus erythropolis, используемый для разложения нефти -  патент 2489485 (10.08.2013)
штамм pseudomonas citronellolis, используемый для разложения нефти и дизельного топлива -  патент 2489484 (10.08.2013)
штамм rhodococcus fascians, используемый для разложения нефти -  патент 2489483 (10.08.2013)
штамм penicillium sp., обладающий полифункциональными свойствами и осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения -  патент 2487933 (20.07.2013)
способ получения гидроксилированного l-лейцина и бактерия, трансформированная днк, кодирующей диоксигеназу -  патент 2468085 (27.11.2012)
штамм pseudomonas brassicacearum, используемый для получения бактериального удобрения под зерновые, овощные и кормовые культуры -  патент 2453596 (20.06.2012)
фосфатрастворяющий штамм pseudomonas species 181a с фунгицидными свойствами -  патент 2451069 (20.05.2012)
Наверх