способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по мутации гена LDLR, характеризующийся тем, что определяют наличие мутации гена LDLR и при выявлении хотя бы одной мутации из 478T>G (C139G), 1252G>Т (E397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>А или 2389+5G>С прогнозируют крайне высокий риск раннего развития ИБС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, и может быть использовано при определении риска раннего развития ишемической болезни сердца (ИБС) у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия, гетерозиготная форма (СГХС).

СГХС - моногенное аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся высокой концентрацией холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), сухожильными ксантомами и повышенным риском раннего возникновения ИБС [Civeira F., 2004]. СГХС является одним из наиболее частых моногенных заболеваний. Гетерозиготная форма СГХС в большинстве стран встречается с частотой 1 на 500 в общей популяции. СГХС может быть обусловлена мутациями нескольких генов: гена рецептора ЛПНП - LDLR, гена аполипопротеина В 100 - АРОВ, гена PCSK9 кодирующего конвертазу. Наиболее часто встречаются мутации генов LDLR и АРОВ, мутации гена PCSK9 встречаются только в 1-2% случаев. В настоящее время в мире известно более 1000 разных мутаций в гене LDLR, приводящих к развитию СГХС и три патогенные мутации в гене АРОВ: R3500Q, R3500W, R3531C [Soutar AK, 2007].

СГХС характеризуется высокой частотой раннего развития ИБС (в возрасте <55 лет у мужчин и <60 лет у женщин), что во многих семьях приводит к уменьшению продолжительности жизни. При этом заболевании клинически распознаваемая ИБС обычно отмечается в возрасте 45-48 лет у пациентов мужского пола и 55-58 лет - женского. Приблизительно у 85% мужчин и 50% женщин с не леченной СГХС развивается какое-либо сердечно-сосудистое осложнение до 65 лет. Длительные наблюдения показали, что ИБС является основной причиной смерти пациентов с СГХС [DeMott К, 2008; Civeira F, 2004; Sijbrands EJ, 2000]. В некоторых семьях отмечается особенно тяжёлое течение СГХС с ранними фатальными исходами у многих членов одной семьи, особенно при отсутствии адекватной терапии или при несвоевременном ее начале. Нередки случаи, когда ИБС появляется у мужчин-гетерозигот в 3-й декаде жизни, а у пациенток - до наступления менопаузы. Ежегодно в мире погибает около 200 тыс больных с СГХС вследствие потенциально предотвратимых сердечных приступов, а при длительной адекватной медикаментозной терапии, существенно снижающей уровень ХС ЛПНП, можно увеличить продолжительность жизни многих пациентов на 10-30 лет [Civeira F, 2004]. Вместе с тем ранний атеросклероз развивается далеко не у всех больных с СГХС, и нередко эти пациенты имеют нормальную продолжительность жизни даже без лечения, направленного на снижение уровня ХС [Jansen AC, 2005; Sijbrands EJ, 2000].

Понимание причин фенотипической разнородности СГХС необходимо для оценки индивидуального риска развития ИБС и подбора адекватной гиполипидемической терапии, в том числе с применением ЛПНП-афереза, в связи с чем в последнее время проводится активное изучение факторов риска развития ИБС у этих больных. Все факторы, так или иначе влияющие на сердечно-сосудистый риск при СГХС, можно разделить на 3 основные группы: 1) связанные с характером основного генетического дефекта (наличие мутации в одном из трех генов LDLR АРОВ PCSK9), 2) классические и 3) другие генетические-полигенные.

В заявляемом техническом решении разработан метод определения риска развития ранней ИБС, основанный на характеристике основного генетического дефекта.

Риск ИБС у больных СГХС в 20 раз выше, чем в общей популяции [Hopkins PN, 2011]. Согласно данным Slack и др. у больных СГХС мужчин ИБС развивалась к 30 годам у 5,4%, к 50 годам - 51,4%, к 60 годам - 85,4%, а у женщин к 50 годам - 12,2% и к 60 годам - 53,3% [Slack J., 1969]. По данным регистра Саймона Брума при исследовании 282 мужчин и 244 женщин больных СГХС смертность от ИБС самой высокой была в возрасте 20-39 лет и достоверно уменьшалась с возрастом [Betteridge DJ, 1991]. При исследовании больных СГХС из российской популяции у 61,5% больных была диагностирована ИБС, и у 31% - инфаркт миокарда [Мешков А.Н., 2009].

На клинический фенотип заболевания может оказывать влияние функциональный класс мутации, приводящей к дефектному рецептору. В одном из наиболее крупных исследований в неотобранной группе пациентов с СГХС [Defesche et al. 2003] показано, что риск ССЗ значительно различается в зависимости от типа мутации гена LDLR; у носителей мутации 1359-1 отмечался наибольший сердечно-сосудистый риск по сравнению со здоровыми родственниками, а у носителей мутации V408M наименьший (таблица 1).

Таблица 1.
Риск ИБС у пациентов с семейной гиперхолестеринемией относительно здоровых родственников соответственно возрасту, полу и родству [Defesche et al. 2003]
Мутации	N	OP	Риск ИБС
(носители/здоровые)	95%-ный ИД
N543H/2393del9bp	241/401	7,83	3,11-19,67
V408M	77/181	7,01	2,18-22,59
1359-1	102/176	15,95	5,52-46,14
313+1/2	83/151	11,14	4,67-26,57
ОР - относительный риск, ИД - интервал доверия

Следует отметить, что вышеуказанная работа имела ряд недостатков, затрудняющих применение результатов в клинической практике: в работе сравнивались носители мутаций гена LDLR только со здоровыми родственниками и не проводилось сравнение с больными СГХС, у которых мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали, некоторые пациенты до включения в исследования ранее принимали гиполипидемические препараты, что искажало естественную картину заболевания, мутации, которые описаны в работе, не встречаются в России. Работы других авторов также показали, что риск ССЗ значительно различается в зависимости от типа мутации гена LDLR, и для каждой новой описанной мутации гена LDLR требуется проведение исследований подтверждающих и уточняющих степень сердечно-сосудистого риска [Gudnason V, 1994; Gudnason V, 1995; Bertolini S,

2000; Dedoussis G.V.Z., 2004].

С учетом этих фактов были проведены исследования по поиску таких мутаций гена LDLR, по которым можно было бы делать более достоверный прогноз о крайне высоком риске раннего развития ИБС. В исследовании была проведена выборка пациентов с СГХС, ранее не получавших гиполипидемическую терапию, и сравнение с пациентами у которых при генетическом анализе мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали. В результате исследований были выявлены 5 мутаций гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252GТ (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C, являющихся индикаторами крайне высокого риска раннего развития ИБС. Полученные результаты не известны из уровня техники, каждая мутация встречается у 2 и более неродственных пациентов.

Задачей изобретения является создание более достоверного способа прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия.

Достигаемым техническим результатом является определение риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия.

Поставленная задача решается тем, что в способе прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по мутации гена LDLR вывод о крайне-высоком риске раннего развития ИБС делают при наличии одной любой мутации из списка 5 мутации гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252G>T (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>C.

В основе предлагаемого способа прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца (у мужчин до 55 лет, у женщин до 60 лет) лежит определение мутаций в генах АРОВ и LDLR. При выявлении любой мутации гена LDLR из списка (478T>G (C139G), 1252GТ (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>С) прогнозируют крайне-высокий риск раннего развития ИБС (абсолютный риск развития ИБС у мужчин до 55 лет и у женщин до 60 лет составляет более 50%); при отсутствии мутаций генов АРОВ или LDLR прогнозируют средний риск

раннего развития ИБС (абсолютный риск около 30%).

Выявленные прогностические признаки были получены в результате

проведения следующего исследования:

1. Критерии отбора больных для исследования

В исследование включались пациенты с клиническим диагнозом СГХС, гетерозиготная форма установленным на основании диагностической системы The Dutch Lipid Clinic Network (Таблица 2) - с количеством баллов 6 и более, обоих полов, ранее не получавшие гиполипидемическую терапию [DeMott К, 2008]. В исследование включались как пробанды, так и их больные родственники 1 и 2 степени родства. Пациентам проводилось обследование на наличие ИБС и наличие мутаций генов LDLR и АРОВ. Мутации в генах определяли методом анализа кривых плавления высокого разрешения (АКП) с последующим секвенированием фрагментов с аномальной кривой плавления.

Таблица 2. Диагностические баллы, используемые при постановке диагноза семейной гиперхолестеринемии
Показатели Семейный анамнез	Баллы
а Родственник 1-й степени родства с ранней (мужчины <55 лет, женщины <60
лет) ИБС или другим сосудистым поражением
б Родственник 1-й степени родства с ХС ЛПНП >95-й персентили и/или	1
а Родственник 1-й степени родства с ксантомами сухожилий и/или дугой роговицы

б Дети моложе 18 лет с ХС ЛПНП >95-й персентили	2
История заболевания
а У пациента ранняя ИБС	2
б У пациента раннее церебро-васкулярное или поражение периферических сосудов	1
Физикальное обследование
а Ксантомы сухожилий	6
б Дуга роговицы в возрасте моложе 45 лет	4
Лабораторный анализ
а ХС ЛПНП >8,5 ммоль/л	8
б ХС ЛПНП 6,5-8,4 ммоль/л	5
в ХС ЛПНП 5-6,4 ммоль/л	3
г ХС ЛПНП 4-4,9 ммоль/л	1
(ХС ЛПВП и ТГ - в норме)

2. Диагностика ИБС

Диагноз ИБС устанавливали, когда: 1) отмечалась типичная ангинозная боль, а ЭКГ-проба с нагрузкой не проводилась, 2) отмечались стенокардия и положительный ЭКГ-тест с нагрузкой (когда такая проба проводилась), 3) пациент перенёс документированный инфаркт миокарда (ИМ) (см. ниже), 4) при проведении коронарографии выявлялось гемодинамически значимое поражение коронарного русла - более 50% для ствола левой коронарной артерии или более 70% при иной локализации, 5) проводились эндоваскулярные коронарные вмешательства или операция коронарного шунтирования.

3. Выделение геномной ДНК

Выделение ДНК из исследуемых образцов крови проводилось с помощью стандартной методики, селективным осаждением ДНК из лизата при помощи детергентов, с использованием коммерческих наборов фирмы «Синтол».

4. Выполнение метода анализа кривых плавления высокого разрешения

ПЦР проводилась в термоциклере «ABI 7500 fast» фирмы "Applied Biosystems". Использовалась смесь, содержащая 10 мкл ×2 MeltDoctor HRM master mix(Applied Biosystems), смысловой и антисмысловой праймеры к соответствующим участкам исследуемых генов, MgCl ₂, геномную ДНК (200 нг/мкл), H₂O. Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода анализа кривых плавления высокого разрешения, представлены в Таблице 3. Анализ кривых высокого разрешения проводился с помощью пакета программ High Resolution Melting (HRM) Software, фирмы Applied Biosystems.

Таблица 3
Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода анализа кривых плавления высокого разрешения
Ген	Экзон	Праймер S	Праймер AS
LDLr	Prom	CAGCTCTTCACCGGAGACCC	ACCTGCTGTGTCCTAGCTGG
LDLr	1	ACTCCTCCCCCTGCTAGAAACCTCA	CTATTCTGGCGCCTGGAGCAAGCC
LDLr	2	TTGAGAGACCCTTTCTCCTTTTCC	GCATATCATGCCCAAAGGGG
LDLr	3	TCAGTGGGTCTTTCCTTTGAG	CAGGACCCCGTAGAGACAAA
LDLr	4(1)	TGGTGTTGGGAGACTTCACA	CACTCATCCGAGCCATCTTC
LDLr	4(2)	AAGTG CATCTCTCGGCAGIT	CCCCTTGGAACACGTAAAGA
LDLr	4(3)	AGCTTCCAGTGCAACAGCTC	CATACCGCAGTTTTCCTCGT
LDLr	4(4)	TGTTCCAAGGGGACAGTAGC	AAATCACTGCATGTCCCACA
LDLr	5	AGAAAATCAACACACTCTGTCCTG	GGAAAACCAGATGGCCAGCG
LDLr	6	TCCTCCTTCCTCTCTCTGGC	TCTGCAAGCCGCCTGCACCG
LDLr	7	GGCGAAGGGATGGGTAGGGG	GTTGCCATGTCAGGAAGCGC
LDLr	8	CATTGGGGAAGAGCCTCCCC	GCCTGCAAGGGGTGAGGCCG
LDLr	9	TCCATCGACGGGTCCCCTCTGACCC	AGCCCTCATCTCACCTGCGGGCCAA
LDLr	10	AGATGAGGGCTCCTGGTGCGATGCC	GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA
LDLr	10	GATCCACAGCAACATCTACTGGACC	AGCCCTCAGCGTCGTGGATA
LDLr	11	TCCTCCCCCGCCCTCCAGCC	GCTGGGACGGCTGTCCTGCG
LDLr	12	GCACGTGACCTCTCCTTATCCACTT	CACCTAAGTGCTTCGATCTCGTACG
LDLr	13	GTCATCTTCCITGCTGCCTG	GTTTCCACAAGGAGGITTCAAGGTT
LDLr	14	GAATCTTCTGGTATAGCTGAT	GCAGAGAGAGGCTCAGGAGG
LDLr	15	GAAGGGCCTGCAGGCACGTGGCACT	GTGTGGTGGCGGGCCCAGTCTTT
LDLr	16	CCTTCCTTTAGACCTGGGCC	CATAGCGGGAGGCTGTGACC
LDLr	17	GGGTCTCTGGTCTCGGGCGC	GGCTCTGGCTTTCTAGAGAGGG
LDLr	18	GCCTGTTTCCTGAGTGCTGG	TCTCAGGAAGGGTTCTGGGC
АРОВ	26	TGTCAAGGGTTCGGTTCTTT	GGGTGGCTTTGCTTGTATGT

5. Секвенирование фрагментов с аномальной температурой плавления ПЦР-амплификация фрагментов генов для ссквенирования: ПЦР проводилась в термоциклере «Mastercycler Gradien» фирмы "Eppendorf". Использовалась смесь, содержащая 2 мкл ×10 ПЦР-буфера с 15 мМ MgCl₂ (MBI Fermentas), смысловой и антисмысловой праймеры к соответствующим участкам исследуемых генов, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, геномную ДНК (200 нг/мкл), 2-3 ед рекомбинантной термостабильной Taq-полимеразы (MBI Fermentas) и деионизированную воду до конечного объема. Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест-системе на основе метода прямого секвенирования, представлены в Таблице 4.

Таблица 4.
Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода прямого секвенирования
Ген и экзон	Прямой праймер (5'-3')	Обратный праймер (5'-3')
LDLR 1	TCCTCCCCCTGCTAGAAACC	CCAGCCGTTTGGGAAGG
2	TTTTCCCATACCCCAGAGAGTC	ТСАТТСТСТССССАССТССТААТ
3	TCAGTGGGTCTTTCCTTTGAGTG	AGCGGCTTGCCAGTGTGT
4	CGAGAGGGCAGTGGTTCAGAGTC	TCCACTTCGGCACCTAAATCA
5	GCAAAAGGCCCTGCTTCTTT	GCAAGCAGCAAGGCACAGA
6	TTTGCATGCGTTCTTATGTGAAT	TCTGCAAGCCGCCTGC
7	CCGGGAGGTGGAGGTTGTAA	GAGGCATGAGGGGTTTGGTT
8	GGTTCCCGTGGTGAATGATG	GAGCCCTCAGGAGCAAACAG
9-10	GGTGCCTCCTCTGGCTCAG	TTCCTGCTCCCTCCATTCC
11	CCTGAGCCTGGCTGTTTCTTC	GCTTGTCCCAGAGCCACCT
12	TGGAGAGGGCGTCACAGG	TGCGTTCATCTTGGCTTGAGT
13-14	TGGCCTGTGTCTCATCCCA	CAAGCCCGGTGCTGATGT
15	CTTTCGTCATTAGGCGCACA	TTGCAAAGAGGGCAAGAACTG
16	CCGGAATTGAGTCCTACAACCT	GAGGCTATTCCACAGCACGG
17	CGCAAGGCGATCTCTAAACAA	CCGCTGACATTCTGAATGAGC
18	GCAGGAGGCTACCAGGCAG	CATTGCATGGGCACTGTCC
АРОВ 26	CCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCAC	AAGGATCCTGCAATGTCAAGGTGTGCCTTT

Перед секвенированием исследуемый фрагмент ДНК очищался от неспецифических продуктов ПЦР с использованием коммерческого реактива ExoSAP-ITR по протоколу фирмы ABI[Applied Biosystems Chemistry Guide]. Нуклеотидная последовательность продуктов ПЦР определялась методом циклического секвенирования с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.

При выявлении нуклеотидной замены в последовательности гена АРОВ или LDLR, описанной в базе мутаций как вызывающей развитие СГХС, пациенту выставляется генетически подтвержденный диагноз СГХС. База мутаций доступна по адресу (http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/) и насчитывает более 1000 патогенных мутаций гена LDLR. Для гена АРОВ известны три патогенные мутации, вызывающие развитие СГХС: R3500Q, R3500W, R3531C. В анализ включались пациенты с мутациями гена LDLR (478T>G (C139G), 1252G>T (E397X), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C), в сравнении с пациентами у которых при генетическом анализе мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ был выполнен с помощью статистической программы Statistica 6.0. Для проведения сравнения при нормальном распределении переменных применяли параметрический метод (непарный t-тест), при отклонении от нормального - непараметрический (тест Манна-Уитни); величины выражали как среднее ± стандартное отклонение. Частоту ИБС в группах сравнивали с помощью ²-теста.

Таким образом, в исследование было включено 294 пациента с клиническим диагнозом СГХС гетерозиготная форма. 158 мужчин и 136 женщин в возрасте от 25 до 55 лет у мужчин и от 30 до 60 лет у женщин. У 37 пациентов была выявлена одна из 5 мутаций гена LDLR: (478T>G (C139G), 1252G>T (E397X), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C). У 124 пациентов были выявлены другие мутации гена LDLR или мутации гена АРОВ. У 133 пациентов мутаций генов LDLR и АРОВ не было выявлено.

Таблица 5
Сравнение частоты развития ранней ИБС
Показатели	Больные СГ с одной из 5 мутаций гена LDLR: (478T>G(C139G), 1252G>T(E397X), 1696A>T(I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C) (N=37)	Больные СГ без мутаций (N=133)	Р
LDLR vs
Без мутации
% мужчин	49	55	NS
% курящих	35	29	NS
% АГ	38	46	NS
(%) больных с ИБС	57	31	<0,05
Средний возраст (лет)	46,4±9,3	43±13,4	NS
н.д. - различия не достоверны (p>0,05)

Частота ИБС была достоверно выше в группе больных с мутацией в гене LDLR, чем у больных с СГХС без выявленной мутацией (табл.5). По частоте классических факторов риска ИБС (мужской пол, факт курения, наличие артериальной гипертензии (АГ), возраст) группы статистически не отличались. В связи с этим можно сделать вывод, что риск ИБС зависит от типа основного генетического дефекта (наличие мутации гена LDLR или иного дефекта).

Использование предлагаемого способа позволяет прогнозировать риск раннего развития ИБС у пациента с СГХС. Что способствует выбору правильной тактики лечения данных пациентов: проведению более агрессивной терапии пациентам с СГХС с крайне-высоким риском ранней ИБС с помощью комбинированной гиполипидемической терапии или проведением процедур ЛПНП-афереза.

Способ апробирован в отделе возрастных проблем сердечно-сосудистых заболеваний НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ «РКНПК МЗ и СР РФ». Он дал достоверно положительные результаты и найдет широкое применение в медицинской практике.