ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические композиции и области их терапевтического применения

Классы МПК:C07D487/04 орто-конденсированные системы
A61K31/4196  1,2,4-триазолы
A61K31/53  содержащие шестичленные кольца с тремя атомами азота в качестве гетероатомов, например хлоразанил, меламин
A61P25/28 для лечения нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы, например ноотропные агенты, агенты для усиления умственных способностей, для лечения болезни Альцгеймера или других форм слабоумия
A61P33/02 противопротозойные средства, например для лечения лейшманиоза, трихомоноза, токсоплазмоза
A61P35/04 специально против метастаза
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):ИБРИЖЕНИКС СА (FR)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-10-25
публикация патента:

Описываются новые тетрациклические соединения общей формулы (I),

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

(I) где новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 - одинарная или двойная связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 - отсутствие связи или одинарная связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 или новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

V означает N; Т и Х как указано в структурных фрагментах выше;

U и W - независимо означают С или N, причем один из них - обязательно N;

R3, R4, R5 и R6 - Н; Rv отсутствует;

Ru и Rw - независимо отсутствуют или означают (С1-12)алкил;

Y=N-OR1 или NR'1, где

R1 - Н, (С1-12)алкил, возможно замещенный фенилом, фенилокси, карбокси, (С1-12)алкокси, (С1-12)алкоксикарбонилом, или (С2-12)алкенил;

R'1 - фенил, или их фармацевтически приемлемые соли, или их диастереомеры, или их региоизомеры, или их смеси, фармацевтическая композиция, их содержащая, и конкретные соединения для ингибирования цистеиновых протеаз. Соединения могут найти применение в медицине при лечения рака, нейродегенеративных заболеваний, воспалительных нарушений, сердечно-сосудистых заболеваний и т.д. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам цистеиновых протеаз, способу их получения и их терапевтическому применению.

Уровень техники

Протеазы можно классифицировать на основе их субстратной специфичности или по механизмам катализа. Если исходить из механизма гидролиза пептидов, то известно пять основных классов протеаз: сериновые, циотеиновые, аспартатные, треониновые протеазы и металлопротеазы. Цистеиновые протеазы включают, в частности, ферменты деубиквитинилирования, каспазы, катепсины, кальпаины, а также пистеиновые протеазы вирусов, бактерий или паразитов.

Ферменты деубиквитинилирования включают убиквитин-специфические протеазы (USPs) и убиквитинкарбоксигидролазы (UCHs). В широком смысле, убиквитин-зависимый метаболический путь регулирует разрушение белков и, в частности, он включен в развитие рака, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, воспаления, в инфекционность и латентность вирусов (в частности, вируса простого герпеса 1, вируса Эпштейна-Бара, коронавируса SARS) или в развитие сердечно-сосудистых заболеваний (Chem. Rev. 1997, 97, р.133-171; Chem. Rev. 2002, 102, p.4459-4488; J.Biochem. 2003, 134, p.9-18; J.Virology, 2005, 79(7), p.4550-4551; Cardiovasc. Res. 2004, 61, p.11-21).

Было показано, что каспазы вовлечены в апоптоз и, таким образом, они являются мишенями при гепатите, печеночной недостаточности, воспалении, ишемии сердца и сердечной недостаточности, почечной недостаточности, нейродегенерации, тугоухооти, диабете или инсульте (J. Pharmacol Exp. Ther., 2004, 308(3), р.1191-1196, J. Cell. Physiol., 2004, 200(2), p.177-200; Kidney Int, 2004, 66(2), р.500-506; Am J. Pathol., 2004, 165(2), p.353-355; Mini Rev. Chem., 2004, 4(2), р.153-165; Otol. Neurotol., 2004, 25(4), р.627-632; Ref. 7, 21, 22, 23, 24, 25).

Было показано, что обычно катепсины вовлечены в развитие рака и метастазирование, воспаление, иммунологию/иммунорегуляпию (Eur. Respir. J, 2004, 23(4), р.620-628) и атеросклероз (Ageing Res. Rev.. 2003, 2(4), p.407-418). Более детально, катепсины включают катепсин В и катепсин В-подобную протеазу, которые вовлечены в развитие рака и метастазирование и артрит (Cancer Metastasis Rev., 2003, 22(2-3), p.271-286; Biol. Chem., 2003, 384(6), p.845-854 и Biochem. Soc. Symp., 2003, 70, р.263-276), катепсин D, вовлеченный, в частности, в развитие рака и метастазирование (Clin. Exp. Metastasis, 2004, 21(2), p.91-106), катепсин K, действующий при остеопорозе и артрите (Int. J. Pharm., 2004, 277(1-2), р.73-79), катепсин S, который, как было показано, играет роль в презентации антигенов в иммунологии (Dryg News Perspective, 2004, 17(6), р.357-363).

Кальпаины в основном играют роль при старении (Ageing Res. Rev. 2003, 2(4), p.407-418), а также при диабете (Mol. Cell. Biochem., 2004, 261(1), р.161-167) и, в частности, при катаракте (Trends Mol. Med., 2004, 10(2), р.78-84).

Вирусные цистеиновые протеазы были обнаружены у риновирусов, вируса полиомиелита, вируса гепатита А, вируса гепатита С, аденовируса или коронавируса SARS (Chem. Rev. 1997, 97, р.133-171; Chem. Rev. 2002, 102, p.4459-4488; J. Virology, 2005, 79(7), p.4550-4551 и Acta Microbiol. Immunol. Hung., 2003, 50(1), р.95-101).

Бактериальные цистеиновые протеазы включают стрептопаин, стафилококковую цистеиновую протеазу, клострипаин или гингипаины; было также показано, что дрожжи, такие как Aspergillus flavus, экспрессируют цистеиновые протеазы, которые могут представлять собой фактор вирулентности (Chem. Rev. 1997, 97, р.133-171).

Цистеиновые протеазы паразитов были рассмотрены, например, в Molecular & Biochemical Parasitology (2002, 120, p.1-21) и Chem. Rev. (2002, 102, p.4459-4488). Следует отметить, что паразитарные агенты, ответственные за большинство паразитарных заболеваний, используют свои собственные цистеиновые протеазы в тот или иной момент их инфекционных, пищевых или репродуктивных циклов; такие заболевания включают малярию, болезнь Чагаса, африканский трипаносомоз, лейшманиоз, лямблиоз, трихомониаз, амебиаз, криптоспоридиоз, токсоплазмоз, цистосомоз, фасциолез, онхоцеркоз и другие инфекции некоторыми другими плоскими или круглыми червями.

Таким образом, обнаружение нового класса ингибиторов цистеиновых протеаз очень важно для широкого спектра заболеваний и патологических состояний.

Патенты US 6,514,927, WO 01/79209 и WO 02/02562 раскрывают соединения, включающие 4 конденсированных цикла. Однако их применение в качестве ингибиторов цистеиновых протеаз предложено не было.

Раскрытие изобретения

В соответствии с первой целью настоящее изобретение относится к соединению

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

где:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 в зависимости от ситуации представляет собой или одинарную, или двойную связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 в зависимости от ситуации обозначает или отсутствие связи, или одинарную связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 представляет собой 5-7-членный гетероцикл, предпочтительно гетероарил, включающий от 1 до 5 гетероатомов, необязательно замещенных одним или несколькими заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из Н, CN, =O, Hal, Alk, OAlk, ОН, NRCN, C(CN)=C(OH)(OAlk), SR, NRR', C(O)NRR', гетероцикла, арила, гетероарила, где Alk, арил, гетероарил, гетероцикл необязательно замещены Hal, NRR', CN, ОН, CF3, арилом, гетероарилом, OAlk;

гденовые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 и новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 конденсированы вместе с помощью Т и X;

Y представляет собой N-OR1, NR'1, CR2R'2;

R1 представляет собой Н, алкил, алкенил, алкоксиалкил, арилоксиалкил, арилалкил, алкоксикарбонилалкил, карбоксиалкил;

R'1 представляет собой Н, алкил, арил или арилалкил;

каждый из R2, R'2 является одной и той же или разными группами, и их независимо выбирают из Н, алкила, арила или арилалкила;

Т, U, V, W, Х являются одинаковыми или разными, и их выбирают из С, N, О, S.

Ru, Rv, Rw являются одинаковыми или разными, и их выбирают из группы, состоящей из Н, CN, =O, Hal, Alk, OAlk, OH, NRCN, C(CN)=C(OH)(OAlk), SR, NRR', C(O)NRR' гетероцикла, арила, гетероарила, циклоалкила, где Alk, арил, гетероарил, гетероцикл, циклоалкил необязательно замещены Hal, NRR', CN, ОН, CF3, арилом, гетероарилом, OAlk.

Каждая из R3, R4, R5, R6 является одной и той же или разными группами, и их независимо выбирают из группы, состоящей из Н, OAlk, Alk, Hal, NRR', CN, ОН, OCF3 , CF3, арила, гетероарила;

каждая из R и R' является одной и той же или разными группами, и их независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Alk, где Alk необязательно замещен Hal, NRR', CN, ОН, CF3, арилом, гетероарилом;

или к его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или гидратированным солям, или к полиморфным кристаллическим структурам этих соединений, или к их оптическим изомерам, рацематам, диастереомерам или энантиомерам, или к их региоизомерам, геометрическим изомерам (Е и Z), или к их смесям.

Предпочтительно Т, U, V, W, Х являются С или N.

Предпочтительно Y представляет собой N-OR1 или NR'1, более предпочтительно N-OR1, в частности, N-OH, N-алкил, N-O-алкенил, N-O-алкил-О-алкил, N-O-алкил-СО-О-алкил, N-O-алкил-СООН.

Следует понимать, что если Y представляет собой CR2R2', то R2 и/или R2' не могут образовывать конденсированное кольцо с остатком структуры формулы (I).

Предпочтительно новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 содержит 2 или 3 гетероатома; более предпочтительно 2 или 3 N. Наиболее предпочтительно новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 представляет собой новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 , новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 или новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 .

Предпочтительно новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 незамещен.

Предпочтительно Ru, Rv, Rw выбирают из Н, арила, Alk, NRR', Hal, -алкиларила, -AlkOH, -AlkOAlk, циклоалкила.

Предпочтительно, новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 представляет собой новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 или новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 или новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 где Rw представляет собой Н.

Предпочтительно каждая из R3, R4, R5, R6 является одной и той же или разными группами, и их независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Hal, Alk, OAlk, OCF3.

Предпочтительно каждая из R и R' является одной и той же или разными группами,

и их независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Alk.

Предпочтительно Rv, Rw либо представляют собой Н, либо отсутствуют.

Предпочтительными соединениями формулы (I), являются соединения формулы

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Наиболее предпочтительные соединения, в частности, представляют собой соединения формулы (I1 )-(I4):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Предпочтительные соединения изобретения выбирают из группы, состоящей из:

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1-метил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 3-бутил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1-бутил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-децил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(2-метокси-этил)-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(3-фенокси-пропил)-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-этил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-этип-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-бензил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-бензил-оксима

- [1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-илиден]-фенил-амина

- этилового эфира (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-уксусной кислоты

- (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-ацетата лития,

или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратированных солей, или полиморфных кристаллических структур этих соединений, или их оптических изомеров, рацематов, диастереомеров или энантиомеров, или их региоизомеров, геометрических изомеров (Е и Z), или их смесей.

Наиболее предпочтительные соединения, в частности, выбирают из группы, состоящей из:

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 3-бутил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-децил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(2-метокси-этил)-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(3-фенокси-пропил)-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-этил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- этилового эфира (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-уксусной кислоты

- (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-ацетата лития,

или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратированных солей, или полиморфных кристаллических структур этих соединений, или их оптических изомеров, рацематов, диастереомеров или энантиомеров, или их региоизомеров, геометрических изомеров (Е и Z), или их смесей.

Как было указано в этом документе ранее и как будет указано ниже:

«Alk» представляет собой алкил, алкен или алкин.

«Алкил» означает алифатическую углеводородную группу, которая может быть линейной или разветвленной и иметь в цепи от 1 до 20 атомов углерода. Предпочтительные алкильные группы имеют в цепи от 1 до 12 атомов углерода. Термин «разветвленные» означает, что к линейной алкильной цепи присоединены одна или несколько низших алкильных групп, таких как метил, этил или пропил. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, октил, нонил, децил.

Термин «алкен» означает алифатическую углеводородную группу, которая содержит двойную связь углерод-углерод и которая может быть линейной или разветвленной; имеющую в цепи от 2 до 15 атомов углерода. Предпочтительные алкенильные группы имеют в цепи от 2 до 12 атомов углерода и, более предпочтительно, примерно от 2 до 4 атомов углерода в цепи. Примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, н-бутенил, изо-бутенил, 3-метилбут-2-енил, н-пентенил, гептенил, октенил, ноненил, деценил.

Термин «алкин» означает алифатическую углеводородную группу, которая содержит тройную связь углерод-углерод и которая может быть линейной или разветвленной; имеющую в цепи от 2 до 15 атомов углерода. Предпочтительные алкинильные группы имеют в цепи от 2 до 12 атомов углерода и, более предпочтительно, от 2 до 4 атомов углерода в цепи. Примеры алкинильных групп включают этинил, пропилил, н-бутинил, 2-бутинил, 3-метилбутинил, н-пентинил, гептинил, октинил и децинил.

Термин «алкоксиалкил» означает группу алкил-O-алкил, в которой алкильные группы являются независимыми группами, определенными в этом документе ранее. Примером алкоксиалкила является метоксиэтил.

Термин «алкоксикарбонилалкил» означает группу алкил-O-СО-алкил-, в которой алкильные группы являются независимыми группами, определенными в этом документе ранее. Примеры алкоксикарбонилалкильных групп включают метокси- и этоксикарбонилметильные и карбонилэтильные группы.

Термин «атом галогена» относится к атомам фтора, хлора, брома или йода; предпочтительно к атомам фтора и хлора.

Термин «арил» означает ароматическое моноциклическую или полициклическую углеводородную кольцевую систему, состоящую из 6-14 атомов углерода, предпочтительно 6-10 атомов углерода. Примеры арильных групп включают фенил или нафтил.

Термин «арилалкил» означает группу арил-алкил-, в которой арильные и алкильные группы были определены в этом документе. Примером арилалкильных групп является бензил.

Термин «арилоксиалкил» означает группу арил-O-алкил-, в которой алкильные и арильные группы были определены в этом документе. Примером арилоксиалкильной группы является феноксипропил.

Используемые в этом документе термины «гетероцикл» или «гетероциклический» относятся к насыщенным, частично ненасыщенным или ненасыщенным неароматическим стабильным 3-14-, предпочтительно 5-10-членным моно-, би- или полициклическим кольцам, в которых, по меньшей мере, один атом кольца является гетероатомом. Обычно гетероатомы включают без ограничения атомы кислорода, азота, серы, селена и фосфора. Предпочтительные гетероатомы являются кислородом, азотом и серой.

Пригодные гетероциклы также раскрыты в книге The Handbook of Chemistry and Physics, 76th Edition, CRC Press, Inc., 1995-1996, p.2-25 to 2-26, содержание которой включено в этот документ путем отсылки.

Предпочтительные неароматические гетероциклические группы включают, но не ограничены только ими, пирролидинил, пиразолидинил, имидазолидинил, оксиранил, тетрагидрофуранил, диоксоланил, тетрагидропиранил, диоксанил, пиперидил, пиперазинил, морфолинил, пиранил, имидазолинил, пирролинил, пиразолинил, тиазолидинил, тетрагидротиопиранил, дитианил, тиоморфолинил, дигидропиранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридил, дигидропиридил, тетрагидропиримидинил, дигидротиопиранил, азепанил, а также конденсированные системы, образующиеся в результате конденсации с фенильной группой.

Используемый в этом документе термин «гетероарильные» или ароматические гетероциклы относится к 5-14-, предпочтительно 5-10-членному ароматическому моно-, би- или полициклическому гетероциклу. Примеры включают пирролил, пиридил, пиразолил, тиенил, пиримидинил, пиразинил, тетразолил, индолил, хинолинил, пуринил, имидазолил, тиенил, тиазолил, бензотиазолил, фуранил, бензофуранил, 1,2,4-тиадиазолил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, изохинолил, бензотиенил, изобензофурил, карбазолил, бензимидозалил, изоксазолил, пиридил-N-оксид, а также конденсированные системы, образующиеся в результате конденсации с фенильной группой.

Термин «карбоксиалкил» означает группу НООС-алкил-, в которой алкильная группа была определена в этом документе. Предпочтительные группы включают карбоксиметил и карбоксиэтил.

Термины «алкил», «циклоалкил», «алкенил», «алкинил», «арил», «гетероарил», «гетероцикл» и т.п.также относятся к соответствующему «алкилену», «циклоалкилену», «алкенилену», «алкинилену», «арилену», «гетероарилену», «гетероциклену» и т.п., которые образованы путем удаления двух атомов водорода.

Используемый в этом документе термин «пациент» относится или к животному, такому как животное, полезное в целях разведения, объединения и защиты, или предпочтительно к человеку или ребенку, который поражен или рискует быть пораженным одной или несколькими болезнями и состояниями, описанными в этом документе.

Используемый в этом документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству соединения настоящего изобретения, которое эффективно для профилактики, уменьшения, устранения, лечения и контролирования симптомов описанных в этом документе заболеваний и состояний. Термин «контролирование» относится ко всем процессам, в которых может быть замедлено, прервано, подавлено или остановлено прогрессирование заболеваний и состояний, описанных в этом документе, но не указывает в обязательном порядке на полное прекращение всех симптомов заболевания и состояния, и включает профилактическое лечение.

Используемый в этом документе термин «фармацевтически приемлемый» относится к тем соединениям, материалам, эксципиентам, композициям или лекарственным формам, которые в рамках вынесенного медицинского заключения являются пригодными для контакта с тканями людей или животных и не вызывают избыточную токсичность, раздражение, аллергический ответ или другие проблемные осложнения, соизмеримые с допустимым соотношением польза/риск.

Используемый в этом документе термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к производным раскрытых соединений, в которых исходное соединение модифицируют путем создания их солей с кислотой или основанием. Фармацевтически приемлемые соли включают общепринятые нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли исходного соединения, образуемые, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, такие общепринятые нетоксичные соли включают соли неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, серная, сульфамовая, фосфорная, азотная кислота и т.п.; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, винная, лимонная, метансульфоновая, бензолсульфоновая, глюкуроновая, глутаминовая, бензойная, салициловая, толуолсульфоновая, щавелевая, фумаровая, малеиновая, молочная кислота и т.п. Кроме того, соли, полученные путем добавления кислот или оснований, включают соли аммония, такие как соли трометамина, меглумина, эполамина и т.п., соли металлов, таких как натрий, калий, кальций, цинк или магний.

Фармацевтически приемлемые соли настоящего изобретения можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основную или кислотную функциональную группу, с помощью традиционных химических методов. Обычно такие соли можно получать с помощью реакции свободных кислотных или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в водном или органическом растворителе или в смеси двух этих растворителей. Обычно предпочтительными являются неводные среды, например, диэтиловый эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Список пригодных солей представлен в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p.1418, содержание которого включено в этот документ путем отсыпки.

Соединения с общей формулой (I), имеющие геометрические изомеры, региоизомеры и стереоизомеры, также являются частью изобретения.

В соответствии со следующей целью настоящее изобретение также относится к способу получения соединений, имеющих формулу (I).

Соединения и способ настоящего изобретения могут быть выполнены различными путями, хорошо известными специалистам в этой области техники. Соединения могут быть синтезированы, например, путем применения или адаптирования методов, описанных ниже, или их вариаций, что очевидно для специалистов в этой области техники. Подходящие модификации и замещения очевидны и хорошо известны или их легко найти в научной литературе специалистам в этой области техники.

В частности, такие методы можно найти в книге R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1999.

Следует понимать, что соединения настоящего изобретения могут содержать один или несколько ассиметрично замещенных атомов углерода и их можно получить в оптически активной форме или в форме рацематов. Таким образом, предположены все хиральные, диастереомерные, рацемические формы, изомерные формы структуры, если только специально не указана специфическая стереохимия или изомерная форма. В этой области техники хорошо известно, каким образом изготовить и получить в чистом виде такие оптически активные формы. Например, смеси стереоизомеров можно разделить с помощью стандартных методов, включающих, но не ограниченных только ими, разделение рацемических форм, обычную, обратнофазовую и хиральную хроматографию, образование предпочтительной соли, перекристаллизацию и т.п., или хиральный синтез как из хиральных исходных веществ, так и с помощью запланированного синтеза целевых хиральных центров.

Кроме того, способ изобретения может приводить к образованию нескольких региоизомеров, все из которых включены в настоящее изобретение. Региоизомеры обычно получают в чистом виде с помощью хроматографии.

Соединения настоящего изобретения можно получать с помощью широкого спектра синтетических способов. Реагенты и исходные вещества доступны в продаже или могут быть легко синтезированы с помощью методов, хорошо известных специалистами среднего звена в этой области техники. Все заместители, если это не указано специальным образом, были определены в этом документе ранее.

В реакциях, описанных ниже, может возникнуть необходимость защитить реакционно-способные функциональные группы, например, гидрокси, амино, имино, тио или карбоксигруппы, если они необходимы в полученном продукте, чтобы предотвратить их нежелательное участие в реакциях. Можно использовать общепринятые защитные группы в соответствии со стандартной практикой, для примеров смотри T.W. Greene and Р. G. М. Wuts in Protective Группы in Organic Chemistry, 3 rd ed., John Wiley and Sons, 1999; J. F. W. McOmie in Protective Группы in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973.

Некоторые реакции можно проводить в присутствии основания. Не существует специального ограничения относительно природы основания, применяемого в этой реакции, и для этого можно использовать любое основание, обычно применяемое в реакциях этого типа, при условии, что оно не обладает неблагоприятным эффектом на другие части молекулы. Примеры пригодных оснований включают: гидроксид натрия, карбонат калия, триэтиламин, гидриды щелочных металлов, например, гидрид натрия и гидрид калия; алкиллитиевые соединения, например, метилпитий и бутиллитий; и алкокоиды щелочных металлов, например, метоксид натрия и этоксид натрия.

Обычно реакции проводят в подходящем растворителе. Можно использовать различные растворители, при условии, что они не обладают неблагоприятным эффектом на реакцию или участвующие реагенты. Примеры подходящих растворителей включают: углеводороды, которые могут быть ароматическими, алифатическими или циклоалифатическими углеводородами, такими как гексан, циклогексан, бензол, толуол и ксилол; амиды, такие как диметилформамид; спирты, такие как этанол и метанол, и простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран.

Реакции могут протекать в широком диапазоне температур. Обычно считают удобным проводить реакцию при температуре от 0°С до 150°С (более предпочтительно примерно от комнатной температуры до 100°С). Время, необходимое для реакции, также может широко меняться, в зависимости от многих факторов, в частности, от температуры реакции и природы реагентов. Однако если реакцию проводят в предпочтительных условиях, указанных выше, обычно будет достаточным время от 3 часов до 20 часов.

Полученное таким образом соединение можно извлечь из реакционной среды с помощью традиционных методов. Например, соединения можно извлечь с помощью отгонки растворителя из реакционной среды или, при необходимости, после отгонки растворителя из реакционной среды, поместив остаток в воду с последующей экстракцией с помощью органического растворителя, не смешивающегося с водой, и отгонки растворителя из экстракта. Кроме того, при желании продукт можно дополнительно очистить с помощью различных хорошо известных методов, таких как перекристаллизация, переосаждение или различные методы хроматографии, в частности, колоночная хроматография или препаративная тонкослойная хроматография.

Способ получения соединения изобретения, имеющего формулу (I), является следующей целью настоящего изобретения.

В соответствии с первым аспектом соединения изобретения формулы (I) можно получить путем взаимодействия соответствующих соединений, имеющих формулы (II) и (III):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

где R3, R4, R5, R6, Т, U, V, W, X, Ru, Rv, Rw определяют таким же образом, что и в формуле (I).

Обычно реакцию проводят в органическом протонном растворителе, таком как спирт (предпочтительно в этаноле), в присутствии кислоты, такой как уксусная кислота.

Альтернативно и/или совокупно соединения формулы (I), можно получить из соответствующего соединения формулы (I'):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

где R3, R4, R5, R6, Hetl, Т, U, V, W, X, Ru, Rv, Rw определяют таким же образом, что и в формуле (I),

где каждая из групп Ru', Rv', Rw' аналогична группам Ru, Rv, Rw или является предшествующей группой, соответствующей Ru, Rv, Rw, которая с помощью одной или нескольких стадий обеспечивает превращение предшествующей группы в желаемую группу Ru, Rv или Rw.

В соответствии с настоящим изобретением выражение «предшествующая группа» функциональной группы относится к любой группе, которая может с помощью одной или нескольких реакций привести к желаемой функциональной группе с помощью одного или нескольких подходящих реагентов. Такие реакции включают снятие защитных групп, а также обычное присоединение, замещение или реакции функционализации.

Соединения формулы (I') можно получить из соответствующих соединений, имеющих формулы (II) и (III), как было обсуждено выше.

Соединения формулы (I), могут, в частности, быть получены из соединений формулы (I'), раскрытых в ЕР 05292612.8.

Указанные выше реакции могут быть проведены специалистами путем применения или адаптирования способов, проиллюстрированных в примерах, приведенных ниже.

Кроме того, способ изобретения может также включать дополнительную стадию получения соединения формулы (I). Ее могут проводить специалисты в этой области техники с помощью любого из известных общепринятых методов, таких как способы извлечения, описанные выше.

Исходные продукты (II) и (III) доступны в продаже или могут быть получены путем применения или адаптирования известных методов или методов, описанных в примерах.

Синтез также можно проводить в одном сосуде в поликомпонентной реакции.

В соответствии со следующей целью настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим соединение формулы (I), которое определено ниже:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

где:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 в зависимости от ситуации представляет собой или одинарную, или двойную связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 в зависимости от ситуации обозначает или отсутствие связи, или одинарную связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 представляет собой 5-7-членный гетероцикл, предпочтительно гетероарил,

включающий от 1 до 5 гетероатомов, необязательно замещенных одним или несколькими заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из Н, CN, =O, Hal, Alk, OAlk, ОН, NRCN, C(CN)=C(OH)(OAlk), SR, NRR', C(O)NRR', гетероцикла, арила, гетероарила, где Alk, арил, гетероарил, гетероцикл необязательно замещены Hal, NRR', CN, ОН, CF3, арилом, гетероарилом, OAlk;

где новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 иновые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 конденсированы вместе с помощью Т и X;

Y представляет собой N-OR1, NR'1, CR2R'2;

R1 представляет собой Н, алкил, алкенил, алкоксиалкил, арилоксиалкил, арилалкил, алкоксикарбонилалкил, карбоксиалкил;

R'1 представляет собой Н, алкил, арил или арилалкил;

Каждая из R2, R'2 является одной и той же или разными группами и их независимо выбирают из Н, алкила, арила или арилалкила;

Т, U, V, W, Х являются одинаковыми или разными и их выбирают из С, N, О, S.

Ru, Rv, Rw являются одинаковыми или разными и их выбирают из группы, состоящей из Н, CN, =O, Hal, Alk, OAlk, OH, NRCN, C(CN)=C(OH)(OAlk), SR, NRR', C(O)NRR', гетероцикла, арила, гетероарила, циклоалкила, где Alk, арил, гетероарил, гетероцикл, циклоалкил необязательно замещены Hal, NRR', CN, ОН, CF3, арилом, гетероарилом, OAlk.

Каждая из R3, R4, R5, R6 является одной и той же или разными группами и их независимо выбирают из группы, состоящей из Н, OAlk, Alk, Hal, NRR', CN, ОН, OCF3 , CF3, арила, гетероарила;

Каждая из R и R' является одной и той же или разными группами и их независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Alk, где Alk необязательно замещен Hal, NRR', CN, ОН, CF3, арилом, гетероарилом;

или к его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или гидратированным солям, или к полиморфным кристаллическим структурам этих соединений, или к их оптическим изомерам, рацематам, диастереомерам или энантиомерам, или к их геометрическим изомерам (Е и Z), или к их смесям.

Предпочтительно Т, U, V, W, Х являются С или N.

Другие предпочтительные воплощения формулы (I) те же, что были определены выше относительно соединений изобретения.

Предпочтительные соединения для терапевтического применения в соответствии с изобретением выбирают из группы, состоящей из:

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1-метил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 3-бутил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1-бутил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-децил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(2-метокси-этил)-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b] флуорен-9-она О-(3-фенокси-пропил)-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-этил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-этил-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-бензил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-бензил-оксима

- [1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-илиден] -фенил-амина

- этилового эфира (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-уксусной кислоты

- (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-ацетата лития,

или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратированных солей, или полиморфных кристаллических структур этих соединений или их оптических изомеров, рацематов, диастереомеров или энантиомеров, или их региоизомеров, геометрических изомеров (Е и Z), или их смесей.

Наиболее предпочтительные соединения для терапевтического применения в соответствии с изобретением, в частности, выбирают из группы, состоящей из:

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b] флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 3-бутил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-децил-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(2-метокси-этил)-оксима

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(3-фенокси-пропил)-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-этил-оксима

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима

- этилового эфира (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-уксусной кислоты

- (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-ацетата лития,

или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратированных солей, или полиморфных кристаллических структур этих соединений или их оптических изомеров, рацематов, диастереомеров или энантиомеров, или их региоизомеров, геометрических изомеров (Е и Z), или их смесей.

В соответствии с еще одной целью настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I), как было определено выше в отношении фармацевтической композиции, для получения лекарственного средства для ингибирования цистеиновой протеазы.

Соединения изобретения полезны для ингибирования цистеиновых протеаз, в частности, ферментов деубиквитинилирования (таких как USPs и UCHs), каспаз, катепсинов (в частности, катепсинов В, D, K, S и т.п.), кальпаинов, а также вирусных, бактериальных или паразитарных цистеиновых протеаз, у пациентов, нуждающихся в этом.

Соединения изобретения, в частности, полезны для лечения и/или профилактики рака и метастазирования, конкретнее, для лечения и/или профилактики рака простаты и/или колоректального рака, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, тугоухости, нарушений, связанных со старением, воспалительных нарушений, артрита, остеопороза, гепатита, печеночной недостаточности, ишемии сердца и сердечной недостаточности, инсульта, атеросклероза, почечной недостаточности, диабета, катаракты; острых и латентных вирусных инфекций вирусом простого герпеса 1, вирусом Энштейна-Барра, коронавирусом SARS, риновирусами, вирусом полиомиелита, вирусом гепатита А, вирусом гепатита С, аденовирусами и т.п.; бактериальных и грибковых инфекций патогенными агентами, принадлежащими к видам Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Clostidium sp., Aspergillus sp. и т.п.; протозойных инфекций видами, принадлежащими Trypanosoma sp., Plasmodium sp., Leishmania sp., Trichomonas sp., Entamoeba sp., Giardia sp., Toxoplasma sp., Cryptosporidium sp. и т.п.; инфекций плоскими или круглыми червями, относящимися к видам Fasciola sp., Schistosoma sp., Onchocerca sp., Ascaris sp., Taenia sp., Caenorhabitis sp., Toxocara sp., Haemonchus sp., Ancylostoma sp., Trichuris sp., Trichinella sp., Strongyloides sp., Brugia sp. и т.п.; а также иммунологических, иммунорегуляторных нарушений или нарушений презентации антигенов.

Настоящее изобретение также относится к соответствующим способам лечения, включающим введение соединения изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом пациенту, который в этом нуждается.

Установление тех субъектов, которые нуждаются в лечении описанных в этом документе заболеваний и состояний, находится в компетенции и соответствует знаниям специалиста в этой области техники. Ветеринар и врач-терапевт, сведущие в этой области техники, могут легко установить, используя клинические тесты, медицинское обследование, медицинский/семейный анамнез или биологические и диагностические тесты, тех субъектов, которые нуждаются в таком лечении.

Терапевтически эффективное количество может быть легко определено лечащим диагностом, специализирующимся в этой области техники, путем использования общепринятых методов и изучения результатов, полученных в аналогичных условиях. При определении терапевтически эффективного количества лечащий диагност принимает во внимание несколько факторов, которые включают без ограничения: видовую принадлежность субъекта; его размер, возраст и общее состояние здоровья; имеющееся специфическое заболевание; степень поражения или тяжесть заболевания; реакцию индивидуума; вводимое специфическое соединение; способ введения; характеристику биологической усвояемости вводимого лекарственного препарата; выбранную схему дозирования; применение сопутствующего лечения и другие важные условия.

Количество соединения формулы (I), которое необходимо для того, чтобы достичь желаемого биологического эффекта, будет зависеть от множества факторов, включающих химические параметры (например, гидрофобность) применяемого соединения, эффективность соединения, тип заболевания, видовую принадлежность пациента, состояние заболевания у пациента, способ введения, биологическую усвояемость соединения при выбранном способе введения, все факторы, которые определяют требуемые дозировки, доставку и режим введения.

Термины "фармацевтически" или "фармацевтически приемлемые" относятся к молекулярным объектам и композициям, которые в соответствующих обстоятельствах не вызывают вредной, аллергической или другой неблагоприятной реакции при введении животному или человеку.

Используемый в этом документе термин "фармацевтически приемлемый эксципиент" включает любые носители, разбавители, вспомогательные вещества или среды, такие как консервирующие или антиоксидантные средства, наполнители, дезинтегрирующие средства, увлажняющие средства, эмульгирующие средства, суспендирующие средства, растворители, диспергент, оболочки, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие поглощение и т.п. Применение такой среды и средств в качестве фармацевтически активных веществ хорошо известно в этой области техники. За исключением тех случаев, когда какая-либо общепринятая среда или средство несовместимо с активным ингредиентом, предполагают их применение в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции в качестве пригодных терапевтических комбинаций.

В контексте изобретения, используемые в этом документе термины "терапия" или "лечение" означают обратное развитие, облегчение, подавление прогрессирования или профилактику нарушения или состояния, по отношению к которому применяют этот термин, или одного или нескольких симптомов такого нарушения или состояния.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения/лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением, эффективное для профилактики или лечения патологического состояния, для которого необходимо ингибирование активной цистеиновой протеазы, вовлеченной в патогенез этого состояния.

В соответствии с изобретением термин "пациент" или "пациент, нуждающийся в нем" относится к животному или человеку, который поражен или вероятно будет поражен патологическим состоянием, в патогенез которого вовлечена активная цистеиновая протеаза. Предпочтительно пациентом является человек.

В общих чертах, соединения этого изобретения могут быть предоставлены в водных растворах физиологических буферов, содержащих от 0,1 до 10% масс/об соединения для парентерального введения. Обычная доза варьирует от 1 мкг/кг до 0,1 г/кг массы тела в день; предпочтительная доза варьирует от 0,01 мг/кг до 10 мг/кг массы тела в день или является эквивалентной дозой у детей. По-видимому, предпочтительная доза лекарственного средства для введения зависит от таких параметров, как тип и степень прогрессирования заболевания или нарушения, от общего состояния здоровья определенного пациента, относительной биологической эффективности выбранного соединения, композиции соединения, пути введения (внутривенный, внутримышечный путь или др.), фармакокинетических свойств соединения при выбранном пути доставки и скорости (болюс или непрерывная инфузия) и режим введения (число повторов за определенный промежуток времени).

Соединения настоящего изобретения также можно вводить в виде единичных лекарственных форм, где термин "единичная доза" означает одну единственную дозу, которую можно вводить пациенту и с которой можно легко манипулировать и которую можно легко упаковывать, сохраняя физически и химически стабильной единичную дозу, включающую или активное соединение само по себе, или фармацевтически приемлемую композицию, как описано далее. По существу, обычная общая дневная доза варьирует от 0,01 до 100 мг/кг массы тела. В качестве общего указания единичные дозы для людей варьируют от 1 мг до 3000 мг в день. Предпочтительно единичная доза варьирует от 1 до 500 мг, которые вводят от одного до шести раз в день и еще более предпочтительно от 10 мг до 500 мг, которые вводят один раз в день. Соединения, предоставляемые в этом документе, могут быть составлены в фармацевтические композиции путем смешивания с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Такие композиции с единичными дозами могут быть получены для применения с помощью перорального введения, в частности, в форме таблеток, простых капсул или мягких гелевых капсул; или с помощью интраназального введения, в частности в форме порошков, назальных капель или аэрозолей; или с помощью кожного введения, например, местно в виде мазей, кремов, лосьонов, гелей или аэрозолей или с помощью трансдермальных пластырей.

Композиции обычно можно вводить в виде единичной лекарственной формы и можно получать любым из методов, хорошо известных в области фармацевтики, например, как описано в справочнике Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed.; Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000.

Предпочтительные композиции включают фармацевтические композиции, в которых соединение настоящего изобретения составлено для перорального или парентерального введения.

Для перорального введения таблетки, пилюли, порошки, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать один или несколько ингредиентов, представленных ниже, или соединений сходного типа: связующее средство, такое как микрокристаллическая целлюлоза или трагакант; разбавитель, такой как крахмал или лактоза; дезинтегрирующее средство, такое как крахмал или производные целлюлозы; смазывающее средство, такое как стеарат магния; скользящее средство, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята или метилсалицилат. Капсулы могут быть в форме твердой капсулы или мягкой капсулы, которые в основном делают из смеси желатинов, необязательно смешанных с пластификаторами, а также в виде облатки. Кроме того, единичные лекарственные формы могут содержать различные другие вещества, которые модифицируют физическую форму дозировочной единицы, например, оболочку из сахара, шеллака или кишечнорастворимых веществ. Другие пероральные лекарственные формы, сироп или эликсир, могут содержать подсластители, консерванты, пигменты, окрашивающие средства и ароматизаторы. Кроме того, активные соединения могут быть включены в препараты и композиции с быстрым, модифицированным или замедленным высвобождением, и где такие композиции с замедленным высвобождением предпочтительно являются бимодальными. Предпочтительные таблетки содержат лактозу, кукурузный крахмал, силикат магния, кроскармелозу натрия, повидон, стеарат магния или тальк в любых комбинациях.

Жидкие препараты для парентерального введения включают стерильные водные и неводные растворы, суспензии и эмульсии. Жидкие композиции могут также включать связующие средства, буферы, консерванты, хелатирующие средства, подсластитель, ароматизирующие и окрашивающие средства и т.п. Неводные растворители включают спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают смеси спиртов и воду, забуференные среды и солевой раствор. В частности, биосовместимый, биодеградируемый лактидный полимер, лактид/гликолидный сополимер или полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые сополимеры могут быть полезными эксципиентами для контролирования высвобождения активных соединений. Внутривенные среды могут включать жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители, например, на основе декстрозы в растворе Рингера и т.п. Другие потенциально полезные парентеральные системы высвобождения для этих активных соединений включают частицы сополимера этилен-винилацетата, осмотические системы закачивания, имплантируемые системы инфузии и липосомы.

Альтернативные способы введения включают композиции для ингаляции, которые включают такие средства, как сухой порошок, аэрозоль или капли. Они могут быть водными растворами, содержащими, например, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, гликохолат и дезоксихолат, или масляными растворами для введения в форме назальных капель, или гелями для интраназального введения. Композиции для буккального введения включают, например, леденцы или пастилки, и могут также включать ароматизированную основу, такую как сахароза или акация, и другие эксципиенты, такие как гликохолат. Композиции, пригодные для ректального введения, предпочтительно существуют в виде суппозиториев для однократного применения, с носителем на твердой основе, таким как масло какао, и могут включать салицилат. Композиции для местного нанесения на кожу предпочтительно имеют форму мази, крема, лосьона, пасты, геля, распыляемого раствора, аэрозоля или масла. Носители, которые могут быть использованы, включают вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты или их комбинации. Композиции, пригодные для трансдермального введения, могут находиться в виде пластырей, состоящих из разделяемых элементов, и могут быть липофильными эмульсиями или забуференными водными растворами, растворенными и/или диспергированными в полимере или связующем средстве.

Изобретение далее будет проиллюстрировано в примерах, приведенных ниже, которые не ограничивают раскрытие изобретения.

Типичные соединения изобретения суммированы в таблице, приведенной ниже:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Осуществление изобретения

Экспериментальная часть

Типичные соединения изобретения могут быть синтезированы в соответствии со следующими способами:

Основной способ А: синтез пентааза-циклопента|[b]флуорен-9-она:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Смесь R1-замещенного (1,2,4)-триазол-3,4-диамина (8,8 ммоль) и нингидрина (1,57 г, 8,8 ммоль) в EtOH (10 мл) и АсОН (1,5 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 2-16 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в EtOAc, промывали насыщенным K2CO 3 и солевым раствором. Органическую фазу сушили над Na 2SO4, фильтровали и растворители удаляли с помощью выпаривания при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью следующих стадий: флэш-хроматография на силикагеле (толуол/МеОН от 95:5 до 8:2 или CH2Cl2/EtOAc от 9:1 до 1:1) для очистки смеси региоизомеров, затем флэш-хроматография на нейтральной окиси алюминия (марка II) (CH2Cl 2/EtOAc от 7:3 до CH2Cl2/MeOH 1:1+5% НСООН или АсОН) для разделения региоизомеров.

1-Метил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-он(1b/A)

Получен в соответствии с основным способом А с выходом 13% в виде твердого вещества желтого цвета.

1Н NMR (300 MHz, DMSO d6): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,23 (d, 1H), 8,02 (m, 2H), 7,89 (ddd, 1H), 2,72 (s, 3H). ESI+MS: рассчитано для C12H7 N5O: 237,22; найдено: 238,2 (МН+).

3-Метил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-он(1b/В)

Получен в соответствии с основным способом А с выходом 30% в виде твердого вещества желтого цвета.

1Н NMR (300 MHz, DMSO d6): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,16 (d, 1H), 8,05-7,95 (m, 2H), 7,85 (ddd, 1H), 2,77 (s, 3H). ESI+MS: рассчитано для C12H 7N5O: 237,22; найдено: 238,2 (МН+ ).

Основной способ B: синтез пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Получение диаминотриазолов происходит в соответствии с методом, описанным в Eur. J. Med. Chem.-Chim. Ther. 1986, 27, 235.

Смесь диаминогуанидина гидрохлорида (1 г, 8 ммоль) в избытке (10 г) подходящей карбоновой кислоты перемешивали и нагревали при 120-130°С в течение 12-24 часов. Раствор охлаждали до комнатной температуры и добавляли 37%-ную HCl (10 мл). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2-3 часов и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт промывали Et2O (×3) и использовали без дальнейшей очистки.

Для конденсации неочищенного продукта диаминотриазола и нингидрина смотри основной способ А.

1-Бутил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-он(1f/A)

Получен в соответствии с основным способом В с выходом 6% в виде твердого вещества желтого цвета.

1Н NMR (300 MHz, DMSO d6): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,23 (d, 1H), 8,02 (m, 2H), 7,89 (ddd, 1H), 3,10 (dd, 2H), 1,81 (m, 2H), 1,42 (m, 2H), 0,94 (t, 3H). ESI+ MS: рассчитано для C15H13N5O: 279.30; найдено: 280.2 (МН+).

3-Бутил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-он(1f/B)

Получен в соответствии с основным способом В с выходом 10% в виде твердого вещества желтого цвета.

1H NMR (300 MHz, DMSO d6): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,16 (d, 1H), 7,99 (m, 2H), 7,85 (dd, 1H), 3,16 (dd, 2H), 1,87 (m, 2H), 1,44 (m, 2H), 0,96 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C15H13N5O: 279,30; найдено: 280,3 (МН+).

1-Этил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-он (1g/A)

Получен в соответствии с основным способом В с выходом 48% в виде твердого вещества желтого цвета.

1H NMR (300 MHz, CDCl3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,21 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,90 (ddd, 1H), 7,77 (ddd, 1H), 3,21 (q, 2H), 1,49 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C13H9N5O: 251,25; найдено: 252,1 (МН+).

3-Этил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-он (1g/B)

Получен в соответствии с основным способом В с выходом 32% в виде твердого вещества желтого цвета.

1Н NMR (300 MHz, CDCl3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,12 (d, 1H), 8,02 (d, 1H), 7,88 (ddd, 1H), 7,75 (ddd, 1H), 3,25 (q, 2H), 1,53 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C13H9N5O: 251,25; найдено: 252,1 (МН+).

Основной способ Е: синтез производных O-алкилоксимов пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она: новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Суспензию 1 (1 ммоль), O-алкил-гидроксиламина гидрохлорида (3 ммоль) и молекулярного сита в пиридине (10 мл) нагревали до 60°С в течение 2-12 часов. Нерастворимый остаток фильтровали, растворитель выпаривали и неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (CH2Cl 2/ацетон 85:15 или толуол/МеОН 9:1, или уайт-спирит/EtOAc 1:1).

3-Метил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксим(5a)

Получен в соответствии с основным способом Е из 1b/В с выходом 55% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 2:1. 1Н NMR (300 MHz, DMSO d 6) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,43 (m, 1Н), 8,16 (m, 1H), 7,81 (m, 2H), 4,34 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 8,05 (m, 1H), 7,92 (m, 1H), 7,72 (m, 2H), 4,30 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), ESI+MS: рассчитано для C 13H10N6O: 266,26; найдено: 267,1 (МН+).

3-Метил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксим(5b)

Получен в соответствии с основным способом Е из 1b/В с выходом 65% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 1:1. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,02 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,75-7,56 (m, 2H), 6,26-6,08 (m, 1H), 5,50 (dd, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,05 (d, 2H), 2,86 (s, 3H), 8,49 (m, 1H), 8,13 (m, 1H), 7,77-7,56 (m, 2H), 6,26-6,08 (m, 1H), 5,50 (dd, 1H), 5,39 (d, 1H), 5,12 (d, 2H), 2,86 (s, 3H), ESI+MS: рассчитано для C15H12 N6O: 292,30; найдено: 293,1 (МН+).

1-Метил-1,2,3a,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксим (5с)

Получен в соответствии с основным способом Е из 1b/А с выходом 76% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 7:3. 1Н NMR (300 MHz, CDCl3 ) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,16 (m, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,77-7,60 (m, 2H), 6,26-6,08 (m, 1H), 5,54 (ddt, 1H), 5,37 (ddt, 1H), 5,04 (ddd, 2H), 2,84 (s, 3H), 8,49 (m, 1H), 8,26 (m, 1H), 7,77-7,60 (m, 2H), 6,26-6,08 (m, 1H), 5,49 (ddt, 1H), 5,40 (ddt, 1H), 5,09 (ddd, 2H), 2,88 (s, 3H), ESI+MS: рассчитано для C15H 12N6O: 292,30; найдено: 293,1 (МН+ ).

3-Бутил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксим (5d)

Получен в соответствии с основным способом Е из 1f/B с выходом 93% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 6:4. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,42 (m, 1H), 8,06 (m, 1H), 7,64 (m, 2H), 6,19-6,00 (m, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,31 (m, 1H), 5,03 (ddd, 2H), 3,17 (dd, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,43 (m, 2H), 0,93 (t, 3H), 7,96 (m, 1H), 7,87 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 6,19-6,00 (m, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,26 (m, 1H), 4,97 (ddd, 2H), 3,17 (dd, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,43 (m, 2H), 0,93 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C18 H18N6O: 334,38; найдено: 335,1 (МН +).

1-Бутил-1,2,3a,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксим(5е)

Получен в соответствии с основным способом Е из 1f/A с выходом 95% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 1:1. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,45 (m, 1H), 8,22 (m, 1H), 7,69 (m, 2H), 6,22-6,02 (m, 1H), 5,45 (m, 1H), 5,35 (m, 1H), 5,05 (ddd, 2H), 3,21 (dd, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 0,95 (t, 3H), 8,12 (m, 1H), 7,91 (m, 1H), 7,62 (m, 2H), 6,22-6,02 (m, 1H), 5,49 (m, 1H), 5,32 (m, 1H), 4,99 (ddd, 2H), 3,18 (dd, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 0,95 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C18 H18N6O: 334,38; найдено: 335,2 (МН +).

Синтез 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима и/или его соответствующего региоизомерного тетразола (6):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Соединение было получено в соответствии с основным способом Е из смеси региоизомеров 6:4 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она (полученного из нингидрина и тетразол-1,5-диамина) с выходом 89% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z и региоизомеров. 1Н NMR (300 MHz, CDCl3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,47 (m, 1Н), 8,22 (m, 1H), 7,84-7,58 (m, 2H), 6,23-6,03 (m, 1H), 5,46 (m, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,13 (ddd, 2H), 8,19 (m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,84-7,58 (m, 2H), 6,23-6,03 (m, 1H), 5,46 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 5,06 (m, 2H), ESI+MS: рассчитано для C13H9N7O: 279,26; найдено: 280,2 (МН+).

Синтез 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она оксима и/или его соответствующего региоизомерного тетразола (7):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Соединение было получено в соответствии с основным способом Е из смеси региоизомеров 6:4 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она (полученного из нингидрина и тетразол-1,5-диамина) с выходом 44% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z и региоизомеров. 1Н NMR (300 MHz, CDCl3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 13,87 (bs, 1H), 8,59 (m, 1H), 8,14 (m, 1H), 7,78-7,52 (m, 2H), 13,69 (bs, 1H), 8,05 (d, 1H), 7,91 (d, 1H), 7,78-7,52 (m, 2H), ESI+MS: рассчитано для C10H 5N7O: 239,20; найдено: 240,1 (МН+ ).

Основной способ F: синтез О-алкилоксима гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Смесь 7 (48 мг, 0,20 ммоль), алкилбромида (0,6 ммоль) и K2CO3 (55 мг, 0,4 ммоль) в DMF (2 мл) перемешивали при комнатой температуре в течение 16 часов, затем растворитель выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии (CH 2Cl2 в различной смеси с МеОН или петролейным эфиром).

1,2,3a,4,10-Гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-децил-оксим и/или его соответствующий региоизомерный тетразол (8a)

Получен в соответствии с основным способом F с выходом 53% в виде твердого вещества желто-зеленого цвета как смесь E/Z и региоизомеров. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,39 (m, 1Н), 8,24 and 8,15 (m, 1H), 7,78-7,63 (m, 2H), 4,61-4,47 (m, 2H), 1,82 (m, 2H), 1,47-1,06 (m, 14H), 0,75 (m, 3H), ESI+MS: рассчитано для C20H25 N7O: 379,47; найдено: 380,2 (МН+).

1,2,3,3a,4,10-Гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(2-метокси-этил)-оксим и/или его соответствующий региоизомерный тетразол_(8b)

Получен в соответствии с основным способом F с выходом 29% в виде твердого вещества светло-коричневого цвета как смесь E/Z и региоизомеров. 1Н NMR (300 MHz, DMSO d6 ) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,49 (m, 1H), 8,27 (m, 1H), 7,83-7,66 (m, 2H), 4,73 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,40 (s, 3H), 8,49 (m, 1H), 8,19 (m, 1H), 7,83-7,66 (m, 2H), 4,73 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,41 (s, 3H), ESI+MS: рассчитано для C13H11 N7O2: 297,28; найдено: 298,0 (МН+ ).

1,2,3,3a,4,10-Гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(3-фенокси-пропил)-оксим и/или его соответствующий региоизомерный тетразол (8c)

Получен в соответствии с основным способом F с выходом 42% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z и региоизомеров. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,41 (m, 1H), 8,15 (m, 1H), 7,76-7,58 (m, 2H), 7,18 (m, 2H), 6,83 (m, 3H), 4,87-4,70 (m, 2H), 4,18-4,07 (m, 2H), 2,42-2,27 (m, 2H), 8,26 (m, 1H), 7,89 (d, 1H), 7,76-7,58 (m, 2H), 7,18 (m, 2H), 6,83 (m, 3H), 4,87-4,70 (m, 2H), 4,18-4,07 (m, 2H), 2,42-2,27 (m, 2H), ESI+MS: рассчитано для C19 H15N7O2: 373,38; найдено: 374,1 (МН+).

Основной способ K: синтез производных O-алкилоксима этилпентааза-циклопента[b]флуорен-9-она:

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Суспензию 1g/А или 1g/B (1 ммоль), O-алкил-гидроксиламингидрохлорида (2 ммоль) и молекулярного сита в пиридине (10 мл) нагревали до 60°С в течение 2-3 часов. Нерастворимый остаток фильтровали, растворитель выпаривали и неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле.

1-Этил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксим(10а)

Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3) из 1g/A с количественным выходом в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 7:3. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,47 (m, 1Н), 8,27 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,66 (m, 1H), 4,41 (s, 3H), 3,28 (q, 2H), 1,55 (t, 3H) and 8,17 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,63 (m, 1H), 4,37 (s, 3H), 3,25 (q, 2H), 1,55 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C14 H12N6O: 280,29; найдено: 281,1 (МН +).

3-Этил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксим (10b) Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3) из 1g/B с количественным выходом в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 7:3. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,50 (m, 1H), 8,17 (m, 1H), 7,63 (m, 2H), 4,45 (s, 3H), 3,30 (q, 2H), 1,57 (t, 3H) and 8,07 (d, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,68 (ddd, 1H), 7,64 (ddd, 1H), 4,41 (s, 3H), 3,29 (q, 2H), 1,59 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C14H12 N6O: 280,29; найдено: 281,1 (МН+).

1-Этил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-этил-оксим (10c) Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH 2Cl2/EtOAc/MeOH 70:25:5) из 1g/A с количественным выходом в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 6:4. 1Н NMR (300 MHz, CDCl3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,17 (m, 1Н), 7,96 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,65 (ddd, 1H), 4,60 (q, 2H), 3,26 (q, 2H), 1,55 (t, 3H), 1,55 (t, 3H) and 8,47 (m, 1H), 8,27 (m, 1H); 7,72 (m, 1H), 7,63 (ddd, 1H), 4,66 (q, 2H), 3,30 (q, 2H), 1,54 (t, 3H), 1,51 (t, 3H), ESI+ MS: рассчитано для C15H14N6O: 294,32; найдено: 295,1 (МН+).

3-Этил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-этил-оксим (10d)

Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 70:25:5) из 1g/B с количественным выходом в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 1:1. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,49 (m, 1H), 8,13 (m, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,62 (m, 1H), 4,69 (q, 2H), 3,27 (q, 2H), 1,58-1,48 (m, 6H), and 8,03 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,62 (m, 1H), 4,62 (q, 2H), 3,27 (q, 2H), 1,58-1,48 (m, 6H), ESI+MS: рассчитано для C15H14N6O: 294,32; найдено: 295,1 (МН+).

1-Этил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-аллил-оксим (10e)

Получен в соответствии о основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:16:4) из 1g/A с количественным выходом в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 6:4. 1Н NMR (300 MHz, CDCl3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,17 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,65 (m, 2H), 6,26-6,07 (m, 1H), 5,54 (m, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,04 (ddd, 2H), 3,26 (m, 2H), 1,54 (m, 3H) and 8,49 (d, 1H), 8,27 (d, 1H), 7,73 (m, 2H), 6,26-6,07 (m, 1H), 5,49 (m, 1H), 5,40 (m, 1H), 5,09 (ddd, 2H), 3,26 (m, 2H), 1,54 (m, 3H), ESI+MS: рассчитано для C16 H14N6O: 306,33; найдено: 307,1 (МН +).

3-Этил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-аллил-оксим (10f)

Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3) из 1g/B с выходом 96% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 65:35. 1Н NMR (300 MHz, CDCl 3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,50 (m, 1H), 8,14 (m, 1H), 7,71 (m, 1H), 7,65 (m, 1H), 6,26-6,09 (m, 1H), 5,53 (m, 1H), 5,39 (m, 1H), 5,12 (ddd, 2H), 3,27 (q, 2H), 1,55 (t, 3H) and 8,04 (m, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,71 (m, 1H), 7,61 (m, 1H), 6,26-6,09 (m, 1H), 5,47 (m, 1H), 5,36 (m, 1H), 5,106 (ddd, 2H), 3,27 (q, 2H), 1,56 (t, 3H), ESI +MS: рассчитано для C16H14N6 O: 306,33; найдено: 307,2 (МН+).

1-Этил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-бензил-оксим (10g) Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3) из 1g/A с выходом 86% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 65:35. 1Н NMR (300 MHz, CDCl3 ): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,16 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,65 (m, 1H), 7,52 (m, 2H), 7,41 (m, 3H), 5,58 (s, 2H), 3,21 (q, 2H), 1,49 (t, 3H) and 8,43 (m, 1H), 8,26 (m, 1Н), 7,70 (m, 1H), 7,65 (m, 1H), 7,52 (m, 2H), 7,41 (m, 3H), H), 5,62 (s, 2H), 3,29 (q, 2H), 1,56 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C20 H16N6O: 356,39; найдено: 357,1 (МН +).

3-Этил-1,2,3a,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-бензил-оксим (10h)

Получен в соответствии с основным способом К (элюент: CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:17:3) из 1g/B с выходом 99% в виде твердого вещества желтого цвета как смесь E/Z 6:4. 1H NMR (300 MHz, CDCl 3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,44 (m, 1H), 8,13 (m, 1H), 7,67 (m, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,52 (m, 2H), 7,46-7,29 (m, 3H), 5,64 (s, 2H), 3,62 (q, 2H), 1,55 (t, 3H) and 8,01 (m, 1H), 7,92 (m, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,65 (m, 1H), 7,52 (m, 2H), 7,41 (m, 3H), 5,59 (s, 2H), 3,29 (q, 2H), 1,56 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C20 H16N6O: 356,39; найдено: 357,1 (МН +).

Синтез [1-этил-2,3,4,10,10a-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-илиден]-фенил-амина(11):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

К суспензии 1g/A (200 мг, 0,79 ммоль) и молекулярного сита в толуоле (4 мл) добавляли анилин (72 мкл, 0,79 ммоль). Смесь перемешивали при 130°С в течение 4 часов, затем растворитель выпаривали и неочищенный продукт очищали с помощью флэш-хроматографии (CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80:18:2), получая 11 (231 мг, 90%) в виде твердого вещества оранжевого цвета при соотношении диастереоизомеров 1:1.

1H NMR (300 MHz, CDCl3): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 8,28 (d, 1H), 7,70 (ddd, 1H), 7,56-7,26 (m, 6H), 6,91 (d, 1H), 3,34 (q, 2H), 1,58 (t, 3H) and 8,22 (m, 2H), 7,81 (m, 2H), 7,47 (m, 1H), 7,07 (m, 4H), 2,80 (q, 2H), 1,21 (t, 3H), ESI+MS: рассчитано для C19H14 N6: 326,36; найдено: 327,2 (МН+).

Этиловый эфир (1,2,3a,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-уксусной кислоты и/или его соответствующей региозомерный тетразол (12)

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Смесь оксима 7 (560 мг, 2,34 ммоль) и карбоната цезия (1,54 г, 4,68 ммоль) перемешивали в DMF (12 мл) в течение 5 минут. По каплям добавляли этилбромацетат (1,2 г, 7,02 ммоль) и после добавления сильно окрашенную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Растворитель выпаривали и неочищенный продукт растворяли в дихлорметане. После фильтрования через слой кремнезема, выпаривания, перекристаллизации с циклогексан/этилацетатом и измельчения в порошок с помощью циклогексана получили 717 мг (94%) соединения 12 в виде порошка зеленого цвета.

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 (ppm) = 1,28 (m, 3Н); 4,21 (m, 2Н); 5,28 (m, 2Н); 7,70-8,60 (m, 4H), LC-MS (ES): m/z = 651 (2M+H+), 326 (M+H +).

(1,2,3,3a,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)ацетат лития и/или его соответствующий региоизомерный тетразол (13)

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

Раствор сложного эфира 12 (700 мг; 2,15 ммоль) и LiOH (451 мг, 10,75 ммоль) в 12 мл метанола перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Сильно окрашенную смесь охлаждали до -20°С и через 1 час полученный осадок фильтровали и промывали холодным метанолом, чтобы получить 380 мг (59%) соединения 13 в виде твердого вещества зеленого цвета. 1Н-NMR (400 MHz, D2O) (смесь изомеров): новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 (ppm) = 4,8 (s, 2Н); 7,40-8,40 (m, 4H), LC-MS (ES): m/z = 296 (M-H+).

Типичные цистеиновые протеазы

Анализ активности USP5

USP5 разводили в буфере USP (50 мМ Tris-HCl; 0,5 мМ EDTA; 5 мМ DTT; 0,01%-ный Triton X-100; бычий сывороточный альбумин 0,05 мг/мл рН 7,6). Запасные растворы соединений (100 мМ) хранили при -20°С в DMSO. Соединения анализировали при следующих конечных концентрациях: 100 мкМ; 33,3 мкМ; 11,1 мкМ; 3,7 мкМ; 1,23 мкМ; 412 нМ; 137 нМ; 45,7 нМ; 15,2 нМ; 5 нМ.

Реакции проводили в двух повторах в 96-луночных планшетах Black LJL (HE microplates; Molecular Devices; конечный объем реакции - 20 мкл). Концентрация субстрата для USP5 составляла 400 нМ Ub-AMC (Boston Biochem). Концентрации фермента (USP5) в анализах специфичности была равна 300 пМ. Концентрации устанавливали таким образом, чтобы проводить анализ специфичности, измеряя начальные скорости при фиксированных концентрации субстратов. Соединения проинкубировали с ферментами в течение 30 минут при 25°С. Реакции начинали добавлением субстрата в планшеты, содержащие ферменты (+/- соединения), разведенные в буфере для анализа. Реакционные смеси инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Реакции останавливали добавлением уксусной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ). Считывание показателей проводили на ридере Pherastar Fluorescent Reader (BMG). новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 эмиссии - 380 нМ; новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 , возбуждения - =460 нМ. Данные (средние значения +/- стандартное отклонение) анализировали как % от контроля (проба без соединения) и строили график зависимости процентной доли от логарифма концентрации соединения, используя программу GraphPad (Prism). Данные аппроксимировали к сигмоидальной модели (переменная крутизна).

Клонирование и очистка USP7

cDNA, кодирующую USP7, получали с помощью PCR-амплификации из плацентарной mRNA. cDNA USP7 субклонировали с помощью PCR в бакуловирусный экспрессионный вектор (pFastBac-HT; Invitrogen). cDNA, кодирующую мутированный USP7, создавали с помощью мутагенной PCR. Соответствующий белок кодирует замещение цистеина на аланин в положении 223. Последовательности устанавливали с помощью секвенирования полной открытой рамки считывания. Бакмиды, кодирующие USP7, создавали в результате транспозиции в DH10bac. Соответствующими бакмидами трансфицировали клетки насекомых (Sf9). Вирусы выделяли из супернатантов культур и дважды амплифицировали. Клетки насекомых (Sf9 или High Five; Invitrogen) инфицировали в течение 72 часов. Собирали суммарные лизаты клеток и лизировали их в буфере для лизиса (Tris-HCl 50 мМ рН 7,6; 0,75%-ный NP40; 500 мМ NaCl; 10%-ный глицерин; 1 мМ DTT; 10 мМ имидазол; смесь ингибиторов протеаз; AEBSF 20 мкг/мл; апротинин 10 мкг/мл). Белки подвергали аффинной очистке на металло-аффинных смолах (Talon Metal affinity resin; BD Biosciences). Связавшиеся материалы интенсивно промывали буфером для промывания (50 мМ натрия фосфат, рН 7,0; 300 мМ NaCl; 10 мМ имидазол; 0,5%-ный Triton Х-100; 10%-ный глицерин) и элюировали из смолы 250 мМ имидазолсодержащим буфером для промывания. Белки диализовали в буфере для диализа (20 мМ Tris-HCl, рН 7,6; NaCl 200 мМ; DTT 1 мМ; EDTA 1 мМ; 10%-ный глицерин). Очистку белков анализировали с помощью 4-12% NuPAGE (Invitrogen).

Анализ активности USP7

USP7 разводили в буфере USP (50 мМ Tris-HCl; 0,5 мМ EDTA; 5 мМ DTT; 0,01%-ный Triton Х-100; бычий сывороточный альбумин 0,05 мг/мл рН 7,6). Запасные растворы соединений (100 мМ) хранили при -20°С в DMSO. Соединения анализировали при следующих конечных концентрациях: 100 мкМ; 33,3 мкМ; 11,1 мкМ; 3,7 мкМ; 1,23 мкМ; 412 нМ; 137 нМ; 45,7 нМ; 15,2 нМ; 5 нМ.

Реакции проводили в двух повторах в 96-луночных планшетах Black LJL (НЕ microplates; Molecular Devices; конечный объем реакции - 20 мкл). Концентрация субстрата для USP7 составляла 400 нМ Ub-AMC (Chem. Biol., 2003, 10, р.837-846) (Boston Biochem). Концентрации фермента (USP7) в анализах специфичности была равна 152 пМ. Концентрации устанавливали таким образом, чтобы проводить анализ специфичности, измеряя начальные скорости при фиксированных концентрации субстратов. Соединения проинкубировали с ферментами в течение 30 минут при 25°С. Реакции начинали добавлением субстрата в планшеты, содержащие ферменты (+/- соединения), разведенные в буфере для анализа. Реакционные смеси инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Реакции останавливали добавлением уксусной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ). Считывание показателей проводили на ридере Pherastar Fluorescent Reader (BMG). новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 эмиссии - 380 нМ; новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 возбуждения - =460 нМ. Данные (средние значения +/- стандартное отклонение) анализировали как % от контроля (проба без соединения) и строили график зависимости процентной доли от логарифма концентрации соединения, используя программу GraphPad (Prism). Данные аппроксимировали к сигмоидальной модели (переменная крутизна).

Клонирование и очистка USP8

cDNA, кодирующую USP8, получали с помощью PCR-амплификации из плацентарной mRNA. cDNA USP8 субклонировали с помощью PCR в бакуловирусный экспрессионный вектор (pFastBac-HT; Invitrogen). cDNA, кодирующую мутированный USP8, создавали с помощью мутагенной PCR. Соответствующий белок кодирует замещение цистеина на аланин в положении 786. Последовательности устанавливали с помощью секвенирования полной открытой рамки считывания. Бакмиды, кодирующие USP7, создавали в результате транспозиции в DH10bac. Соответствующими бакмидами трансфицировали клетки насекомых (Sf9). Вирусы выделяли из супернатантов культур и дважды амплифицировали. Клетки насекомых (Sf9 или High Five; Invitrogen) инфицировали в течение 72 часов. Собирали суммарные лизаты клеток и лизировали их в буфере для лизиса (Tris-HCl 50 мМ рН 7,6; 0,75%-ный NP40; 500 мМ NaCl; 10%-ный глицерин; 1 мМ DTT; 10 мМ имидазол; смесь ингибиторов протеаз; AEBSF 20 мкг/мл; апротинин 10 мкг/мл). Белки подвергали аффинной очистке на металло-аффинных смолах (Talon Metal affinity resin; BD Biosciences). Связавшиеся материалы интенсивно промывали буфером для промывания (50 мМ натрия фосфат, рН 7,0; 300 мМ NaCl; 10 мМ имидазол; 0,5%-ный Triton X-100; 10%-ный глицерин) и элюировали из смолы 250 мМ имидазолсодержащим буфером для промывания. Белки диализовали в буфере для диализа (20 мМ Tris-HCl, pH 7,6; NaCl 200 мМ; DTT 1 мМ; EDTA 1 мМ; 10%-ный глицерин).

Очистку белков анализировали с помощью 4-12% NuPAGE (Invitrogen).

Анализ активности USP8

USP8 разводили в буфере USP (50 мМ Tris-HCl; 0,5 мМ EDTA; 5 мМ DTT; 0,01%-ный Triton Х-100; бычий сывороточный альбумин 0,05 мг/мл pH 8,8). Запасные растворы соединений (100 мМ) хранили при -20°С в DMSO. Соединения анализировали при следующих конечных концентрациях: 100 мкМ; 33,3 мкМ; 11,1 мкМ; 3,7 мкМ; 1,23 мкМ; 412 нМ; 137 нМ; 45,7 нМ; 15,2 нМ; 5 нМ.

Реакции проводили в двух повторах в 96-луночных планшетах Black LJL (НЕ microplates; Molecular Devices; конечный объем реакции - 20 мкл). Концентрация субстрата для USP8 составляла 400 нМ Ub-AMC (Boston Biochem). Концентрации фермента (USP8) в анализах специфичности была равна 630 пМ. Концентрации устанавливали таким образом, чтобы проводить анализ специфичности, измеряя начальные скорости при фиксированных концентрации субстратов. Соединения проинкубировали с ферментами в течение 30 минут при 25°С. Реакции начинали добавлением субстрата в планшеты, содержащие ферменты (+/- соединения), разведенные в буфере для анализа. Реакционные смеси инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Реакции останавливали добавлением уксусной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ). Считывание показателей проводили на ридере Pherastar Fluorescent Reader (BMG). новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 эмиссии - 380 нМ; новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 возбуждения - =460 нМ. Данные (средние значения +/- стандартное отклонение) анализировали как % от контроля (проба без соединения) и строили график зависимости процентной доли от логарифма концентрации соединения, используя программу GraphPad (Prism). Данные аппроксимировали к сигмоидальной модели (переменная крутизна).

Анализ активности UCH-L3

Uch-L3 разводили в буфере USP (50 мМ Tris-HCl; 0,5 мМ EDTA; 5 мМ DTT; 0,01%-ный Triton Х-100; бычий сывороточный альбумин 0,05 мг/мл pH 7,6). Запасные растворы соединений (100 мМ) хранили при -20°С в DMSO. Соединения анализировали при следующих конечных концентрациях: 100 мкМ; 33,3 мкМ; 11,1 мкМ; 3,7 мкМ; 1,23 мкМ; 412 нМ; 137 нМ; 45,7 нМ; 15,2 нМ; 5 нМ.

Реакции проводили в двух повторах в 96-луночных планшетах Black LJL (НЕ microplates; Molecular Devices; конечный объем реакции - 20 мкл). Концентрация субстрата для Uch-L3 составляла 400 нМ Ub-AMC (Boston Biochem). Концентрации фермента (Uch-L3) в анализах специфичности была равна 13 пМ. Концентрации устанавливали таким образом, чтобы проводить анализ специфичности, измеряя начальные скорости при фиксированных концентрации субстратов. Соединения проинкубировали с ферментами в течение 30 минут при 25°С. Реакции начинали добавлением субстрата в планшеты, содержащие ферменты (+/- соединения), разведенные в буфере для анализа. Реакционные смеси инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Реакции останавливали добавлением уксусной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ). Считывание показателей проводили на ридере Pherastar Fluorescent Reader (BMG). новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 эмиссии - 380 нМ; %, возбуждения - =460 нМ. Данные (средние значения +/- стандартное отклонение) анализировали как % от контроля (проба без соединения) и строили график зависимости процентной доли от логарифма концентрации соединения, используя программу GraphPad (Prism). Данные аппроксимировали к сигмоидальной модели (переменная крутизна).

Анализ активности каспазы 3

Каспазу 3 разводили в буфере для каспазы 3 (100 мМ Hepes pH 7,5; 10%-ная сахароза; 0.1%-ный CHAPS). Запасные растворы соединений (100 мМ) хранили при

-20°С в DMSO. Соединения анализировали при следующих конечных концентрациях: 100 мкМ; 33,3 мкМ; 11,1 мкМ; 3,7 мкМ; 1,23 мкМ; 412 нМ; 137 нМ; 45,7 нМ; 15,2 нМ; 5 нМ.

Реакции проводили в двух повторах в 96-луночных планшетах Black LJL (HE microplates; Molecular Devices; конечный объем реакции - 20 мкл). Концентрация субстрата для анализа специфичности каспазы 3 составляла 500 нМ (Ac-DEVD-AMC; Promega). Концентрации фермента (каспаза 3) в анализах специфичности была равна 3,2 нМ. Концентрации устанавливали таким образом, чтобы проводить анализ специфичности, измеряя начальные скорости при фиксированных концентрации субстратов. Соединения проинкубировали с ферментами в течение 30 минут при 25°С. Реакции начинали добавлением субстрата в планшеты, содержащие ферменты (+/-соединения), разведенные в буфере для анализа. Реакционные смеси инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Реакции останавливали добавлением уксусной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ). Считывание показателей проводили на ридере Pherastar Fluorescent Reader (BMG). новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 эмиссии 380 нМ; новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 возбуждения = 460 нМ. Данные (средние значения +/- стандартное отклонение) анализировали как % от контроля (проба без соединения) и строили график зависимости процентной доли от логарифма концентрации соединения, используя программу GraphPad (Prism). Данные аппроксимировали к сигмоидальной модели (переменная крутизна).

Анализ активности катепсина В

Катепсин В разводили в буфере для катепсина В (20 мМ Tris-HCl pH 6,8; 1 мМ EDTA; 1 мМ DTT). Запасные растворы соединений (100 мМ) хранили при -20°С в DMSO.

Соединения анализировали при следующих конечных концентрациях: 100 мкМ; 33,3 мкМ; 11,1 мкМ; 3,7 мкМ; 1,23 мкМ; 412 нМ; 137 нМ; 45,7 нМ; 15,2 нМ; 5 нМ. Реакции проводили в двух повторах в 96-луночных планшетах Black LJL (HE microplates; Molecular Devices; конечный объем реакции - 20 мкл). Концентрация субстрата для анализа специфичности катепсина В составляла 36 мкМ (z-RR-AMC; Calbiochem). Концентрации фермента (катепсина В) в анализах специфичности была равна 3,6 нМ. Концентрации устанавливали таким образом, чтобы проводить анализ специфичности, измеряя начальные скорости при фиксированных концентрации субстратов. Соединения проинкубировали с ферментами в течение 30 минут при 25°С. Реакции начинали добавлением субстрата в планшеты, содержащие ферменты (+/- соединения), разведенные в буфере для анализа. Реакционные смеси инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Реакции останавливали добавлением уксусной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ). Считывание показателей проводили на ридере Pherastar Fluorescent Reader (BMG). новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 эмиссии 380 нМ; новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 возбуждения = 460 нМ. Данные (средние значения +/- стандартное отклонение) анализировали как % от контроля (проба без соединения) и строили график зависимости процентной доли от логарифма концентрации соединения, используя программу GraphPad (Prism). Данные аппроксимировали к сигмоидальной модели (переменная крутизна).

Методы определения жизнеспособности и пролиферации клеток

Анализ жизнеспособности и пролиферации клеток НСТ116

Колоректальные опухолевые клетки НСТ116 получали из АТСС (American Type Culture Collection) и поддерживали в среде Me Coy's 5A, содержащей 10%-ную FBS, 3 мМ глутамин и 1%-ный пенициллин/стрептомицин. Клетки инкубировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO2.

Жизнеспособность клеток анализировали с помощью метода MTS в 96-луночных планшетах для культур клеток (CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) представляет собой МТТ-производное тетразолия, которое восстанавливается в метаболически активных клетках в растворимый, проникающий в клетки формазан. Количество формазана, определяемое по его поглощению при 492 нм, пропорционально числу живых метаболически активных клеток.

Высевали 103 клеток НСТ116 на лунку. Через 24 часа среду заменяли и клетки обрабатывали в тройных повторах следующими концентрациями каждого соединения: 10 мкМ - 3,33 мкМ - 1,11 мкМ - 370 нМ - 123 нМ - 41 нМ - 14 нМ и 5 нМ. Соединения разводили в 100%-ном ДМСО, конечная концентрация которого в клетках поддерживалась на уровне 0,5%.

Клетки инкубировали с соединением в течение 72 часов, и их жизнеспособность затем анализировали после добавления MTS в течение 2 часов. Поглощение при 492 нм измеряли непосредственно в 96-луночных планшетах для культур клеток. Концентрации GJ50 (ингибирование роста на 50%) для каждого соединения рассчитывали с помощью сигмоидальной аппроксимации переменной крутизны (Prism 4.0, Graphpad Softwares). Значения представляют собой среднее из 3 независимых экспериментов.

Анализ жизнеспособности и пролиферации клеток РС3

Опухолевые клетки простаты РС-3 получали из АТСС и поддерживали в среде F-12K, содержащей 7%-ную FBS и 1%-ный пенициллин/стрептомицин. Клетки инкубировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO2.

Жизнеспособность клеток анализировали с помощью метода MTS в 96-луночных планшетах для культур клеток (CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) представляет собой МТТ-производное тетразолия, которое восстанавливается в метаболически активных клетках в растворимый, проникающий в клетки формазан. Количество формазана, определяемое по его поглощению при 492 нм, пропорционально числу живых метаболически активных клеток.

Высевали 2×103 клеток РС3 на лунку. Через 24 часа среду заменяли и клетки обрабатывали в тройных повторах следующими концентрациями каждого соединения: 10 мкМ - 3,33 мкМ - 1,11 мкМ - 370 нМ - 123 нМ - 41 нМ - 14 нМ и 5 нМ. Соединения разводили в 100%-ном ДМСО, конечная концентрация которого в клетках поддерживалась на уровне 0,5%.

Клетки инкубировали с соединением в течение 72 часов и их жизнеспособность затем анализировали после добавления MTS в течение 2 часов. Поглощение при 492 нм измеряли непосредственно в 96-луночных планшетах для культур клеток. Концентрации GI50 (ингибирование роста на 50%) для каждого соединения рассчитывали с помощью сигмоидальной аппроксимации переменной крутизны (Prism 4.0, Graphpad Softwares). Значения представляют собой среднее из 3 независимых экспериментов.

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

(I)

где

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 в зависимости от ситуации представляет собой или одинарную, или двойную связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 в зависимости от ситуации обозначает или отсутствие связи, или одинарную связь;

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 представляет собой новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 , новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 или новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 ,

где новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 и новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349 конденсированы вместе с помощью Т и X, где Т и Х определены в вышеуказанных структурных фрагментах;

V представляет собой N;

U и W являются одинаковыми или разными и представляют собой С или N, причем один из них обязательно представляет собой N;

R3, R4, R5 и R6 представляют собой Н;

Rv отсутствует;

Ru и Rw отсутствуют или представляют собой (С1-12 )алкил;

Y представляет собой N-OR1, NR'1, где

R1 представляет собой Н, (С1-12)алкил, (С 2-12)алкенил, (С1-12)алкокси(С1-12 )алкил, фенилокси(С1-12)алкил, фенил(С1-12 )алкил, (C1-12)алкоксикарбонил(С1-12)алкил или карбокси(С1-12)алкил и

R'1 представляет собой фенил,

или его фармацевтически приемлемые соли, или их диастереомеры, или их региоизомеры, или их смеси.

2. Соединение формулы (I) по п.1, где, по меньшей мере, одну из групп Ru, Rw выбирают из (C1-12)Alk.

3. Соединение формулы (I) по п.1 формулы (Ia):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

где R3, R4, R5, R6, Y, Т, U, V, W, X, Ru определяют так же, как в предшествующих пунктах.

4. Соединение по п.1, выбираемое из группы, состоящей из:

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима,

- 3-метил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима,

- 1-метил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима,

- 3-бутил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима,

- 1-бутил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима,

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-аллил-оксима,

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она оксима,

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-децил-оксима,

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(2-метокси-этил)-оксима,

- 1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-(3-фенокси-пропил)-оксима,

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-метил-оксима,

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-метил-оксима,

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-этил-оксима,

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она О-этил-оксима,

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима,

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-аллил-оксима,

- 1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-бензил-оксима,

- 3-этил-1,2,3а,4,10-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-она O-бензил-оксима,

- [1-этил-2,3,4,10,10а-пентааза-циклопента[b]флуорен-9-илиден]-фенил-амина,

- этилового эфира (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-уксусной кислоты,

- (1,2,3,3а,4,10-гексааза-циклопента[b]флуорен-9-илиденаминоокси)-ацетата лития,

или их фармацевтически приемлемых солей, или их диастереомеров, или их региоизомеров, или их смесей.

5. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении цистеиновых протеаз, включающая соединение формулы (I):

новые тетрациклические ингибиторы цистеиновых протеаз, их фармацевтические   композиции и области их терапевтического применения, патент № 2481349

где R3, R4, R5, R6, Y, T, U, V, W, X, Het1, Ru, Rv и Rw определяют так же, как в пп.1-4.

6. Соединение формулы (I), как определено в п.5, для ингибирования одной или нескольких цистеиновых протеаз.

7. Соединение по п.6, где указанные цистеиновые протеазы принадлежат к одной или нескольким группам ферментов деубиквитинилирования, каспаз, катепсинов, кальпаинов, а также цистеиновых протеаз вирусов, бактерий, грибов или паразитов.

8. Соединение формулы (I), как определено в п.5, для лечения и/или профилактики рака и метастазирования, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, воспалительных нарушений, сердечно-сосудистых заболеваний, и/или инфекционности, и/или латентности, в частности, для вируса простого герпеса 1, вируса Эпштейна-Бара или коронавируса SARS, нейродегенеративных нарушений, предпочтительно поражения нервных клеток, вызываемого инсультом, повреждения печени и печеночной недостаточности, возникшей в результате острого или хронического инфекционного, ишемического или химического повреждения печени, повреждения почек и почечной недостаточности, возникшей в результате острого или хронического инфекционного, ишемического или химического повреждения почек, повреждения сердца и сердечной недостаточности, возникшей в результате острого или хронического инфекционного, ишемического или химического повреждения сердца, диабета, возникшего в результате острого или хронического аутоиммунного, химического, окислительного или метаболического повреждения инсулиновых бета-клеток панкреатических островков, иммунологических нарушений, заболеваний костей и суставов, остеопороза и артрита, нарушений, связанных со старением, диабета с поздним началом и катаракты, вирусных инфекций и заболеваний, включающих гепатит А, гепатит С, инфекцию и заболевание, вызываемые коронавирусом SARS, риновирусные инфекции и заболевания, аденовирусные инфекции и заболевания, полиомиелит; бактериальных инфекций и заболеваний, включающих стрептококковые инфекции и заболевания, инфекции и заболевания, вызываемые бактериями вида Clostridium sp., стафилококковые инфекции и заболевания; гингивита и периодонтальных заболеваний, грибковых инфекций и заболеваний, протозойных паразитарных инфекций и заболеваний, паразитарных инфекций и заболеваний, вызываемых плоскими червями, паразитарных инфекций и заболеваний, вызываемых круглыми червями.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2481349

patent-2481349.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07D487/04 орто-конденсированные системы

Патенты РФ в классе C07D487/04:
5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-альфа]пиримидинид l-аргининия моногидрат -  патент 2529487 (27.09.2014)
хиназолиноны как ингибиторы пролилгидроксилазы -  патент 2528412 (20.09.2014)
новое производное пиразол-3-карбоксамида, обладающее антагонистической активностью в отношении рецептора 5-нт2в -  патент 2528406 (20.09.2014)
6-замещенные 3-азолилимидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины, проявляющие противоопухолевую активность -  патент 2527258 (27.08.2014)
гетероциклические соединения и способы применения -  патент 2525116 (10.08.2014)
соединения азаазулена -  патент 2524202 (27.07.2014)
замещенные пиразоло[1,5-a]пиримидиновые соединения как ингибиторы трк киназы -  патент 2523544 (20.07.2014)
соли производных тетерагидро-имидазо[1,5-a]пиразина, способы их получения и их медицинское применение -  патент 2523543 (20.07.2014)
замещенные аминоинданы и их аналоги, и их применение в фармацевтике -  патент 2522586 (20.07.2014)
способы и композиции для стимулирования нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов с использованием изотиазолопиримидинонов -  патент 2521333 (27.06.2014)

Класс A61K31/4196  1,2,4-триазолы

Патенты РФ в классе A61K31/4196:
соединения, которые являются ингибиторами erk -  патент 2525389 (10.08.2014)
замещенные аминоинданы и их аналоги, и их применение в фармацевтике -  патент 2522586 (20.07.2014)
соединения, ингибирующие (блокирующие) горький вкус, способы их применения и получения -  патент 2522456 (10.07.2014)
соединения, оказывающие возбуждающее действие на рецептор активатора пролиферации пероксисом подтипа б, способ получения и применение указанных соединений -  патент 2522450 (10.07.2014)
способ лечения больных деструктивными формами туберкулеза легких -  патент 2521197 (27.06.2014)
композиции и способы лечения заболеваний ногтей -  патент 2519664 (20.06.2014)
конъюгаты 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4i')-она с глутатионом и другими пептидами, обладающие противовирусной активностью -  патент 2516936 (20.05.2014)
способ лечения и профилактики осложнений в полости рта, вызванных приемом ингаляционных гормональных препаратов у больных бронхиальной астмой -  патент 2506080 (10.02.2014)
средство для медикаментозной коррекции нарушений нитроксидергической системы -  патент 2505297 (27.01.2014)
соединения, композиции и способы, предназначенные для лечения бета-амилоидных заболеваний и синуклеинопатий -  патент 2501792 (20.12.2013)

Класс A61K31/53  содержащие шестичленные кольца с тремя атомами азота в качестве гетероатомов, например хлоразанил, меламин

Патенты РФ в классе A61K31/53:
замещенные производные 4-аминоциклогексана -  патент 2525236 (10.08.2014)
производные имидазопиридина в качестве ингибиторов рецепторных тирозинкиназ -  патент 2518089 (10.06.2014)
липосомальная композиция и способ ее получения -  патент 2516893 (20.05.2014)
альфа-спиральные миметики и способы, связанные с ними -  патент 2512538 (10.04.2014)
составы, содержащие триазиноны и железо -  патент 2506081 (10.02.2014)
способ приготовления лекарственного средства, содержащего варденафила гидрохлорида тригидрат -  патент 2493849 (27.09.2013)
натриевая соль 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4н)-она дигидрат, обладающая противовирусным действием -  патент 2493158 (20.09.2013)
средство, улучшающее противоопухолевый эффект, содержащее липосомальное средство, содержащее оксалиплатин, и противоопухолевое средство, содержащее липосомальное средство -  патент 2492863 (20.09.2013)
трансдермальное применение триазинов для борьбы с инфекциями кокцидий -  патент 2484825 (20.06.2013)
лекарственные формы с улучшенными фармакокинетическими свойствами -  патент 2481110 (10.05.2013)

Класс A61P25/28 для лечения нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы, например ноотропные агенты, агенты для усиления умственных способностей, для лечения болезни Альцгеймера или других форм слабоумия

Патенты РФ в классе A61P25/28:
внутрижелудочковая доставка ферментов при лизосомных болезнях накопления -  патент 2529830 (27.09.2014)
улучшение памяти у пациентов с оценкой 24-26 баллов по краткой шкале оценки психического статуса -  патент 2529815 (27.09.2014)
новое производное пиразол-3-карбоксамида, обладающее антагонистической активностью в отношении рецептора 5-нт2в -  патент 2528406 (20.09.2014)
6-замещенные изохинолины и изохинолиноны полезные в качестве ингибиторов rho-киназы -  патент 2528229 (10.09.2014)
применение программы противоположной дифференцировки клеток (ппдк) для лечения дегенерировавших органов в патологическом состоянии -  патент 2528084 (10.09.2014)
сублингвальная форма 6-метил-2-этил-3-гидроксипиридина и ее применение в качестве средства, обладающего стимулирующей, анорексигенной, антидепрессивной, анксиолитической, противогипоксической, антиамнестической (ноотропной) и антиалкогольной активностью -  патент 2527342 (27.08.2014)
четырехзамещенные бензолы -  патент 2527177 (27.08.2014)
способ лечения болезни альцгеймера -  патент 2526155 (20.08.2014)
способ повышения фармакологической активности действующего вещества лекарственного средства и фармацевтическая композиция -  патент 2526153 (20.08.2014)
терапевтические агенты 713 -  патент 2526055 (20.08.2014)

Класс A61P33/02 противопротозойные средства, например для лечения лейшманиоза, трихомоноза, токсоплазмоза

Патенты РФ в классе A61P33/02:
способ лечения кокцидиоза птицы -  патент 2526166 (20.08.2014)
протистоцидная активность 2-(4,5-дихлоримидазолил-1)-5 нитропиридина -  патент 2514007 (27.04.2014)
составы, содержащие триазиноны и железо -  патент 2506081 (10.02.2014)
средство для лечения кокцидиозов в ветеринарии -  патент 2502511 (27.12.2013)
способ лечения кокцидиоза (эймериоза) сельскохозяйственных животных и птиц -  патент 2477129 (10.03.2013)
способ лечения и профилактики бабезиоза северных оленей -  патент 2473338 (27.01.2013)
антиэймериозная фармацевтическая композиция на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана -  патент 2473334 (27.01.2013)
композиции средств по уходу за зубами для лечения ксеротомии -  патент 2452465 (10.06.2012)
способ получения препаратов для лечения анаплазмоза крупного рогатого скота -  патент 2410099 (27.01.2011)
имидазопиразины в качестве ингибиторов тирозинкиназ -  патент 2405784 (10.12.2010)

Класс A61P35/04 специально против метастаза

Патенты РФ в классе A61P35/04:
соединения, композиции и способы предупреждения метастазов раковых клеток -  патент 2519123 (10.06.2014)
лечение метастатической стадии рака предстательной железы дегареликсом -  патент 2504394 (20.01.2014)
способ лечения рака предстательной железы антагонистом гонадотропин-высвобождающего гормона (gnrh) дегареликсом -  патент 2504393 (20.01.2014)
антитела против pdgfr для лечения вторичной опухоли кости -  патент 2502523 (27.12.2013)
способ лечения метастазов в печень колоректального рака -  патент 2497517 (10.11.2013)
способ создания биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких льюис с продолжительной циклофосфаниндуцированной лейкопенией у мышей -  патент 2488173 (20.07.2013)
полипептид, селективный по отношению к интегрину v 3, способ его получения, кодирующий его полинуклеотид, композиция, содержащая данный полипептид, и способ лечения и профилактики -  патент 2477727 (20.03.2013)
способ лечения метастазов в печень рака толстой кишки -  патент 2471511 (10.01.2013)
способ лечения метастазов в печень рака желудка и толстой кишки -  патент 2470675 (27.12.2012)
способ лечения метастазов в печень рака толстой кишки -  патент 2465928 (10.11.2012)


Наверх