штамм вируса гриппа a/teal/chany/7119/08/ h15n4-субтипа для получения антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа птиц A/teal/Chany/7119/2008 Н15N4-субтипа для получения антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-563.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа H15N4-субтипа и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа H15-субтипа в РТГА, как компонентов панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа A (H1-H16) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), а также выявления антител к вирусу гриппа H15-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА.

Обоснование уровня техники

Субтип вируса гриппа H15 был обнаружен у птиц семейств буревестниковые (Procellariidae) и утиные (Anatidae). Данный субтип образует отдельную филогенетическую линию, генетически наиболее близкую к Н7-субтипам вируса гриппа. В ходе изучения выделенных вирусов гриппа на территории Австралии, С.Rohm et al., 1996 установили принадлежность данных изолятов к новому, на тот момент ранее не обнаруженному субтипу гемагглютинина H15. При сравнении аминокислотных последовательностей гемагглютинина данного субтипа с ранее известными субтипами, была обнаружена более чем 30% разница аминокислотного состава. Кроме того, ген гемагглютинина H15 субтипа содержит 30-нуклеотидную инсерцию, находящуюся в глобулярной головке молекулы (Characterization of a Novel Influenza Hemagglutinin, H15: Criteria for Determination of Influenza A Subtypes / C. Rohm [et al.] // Virology. - 1996. - № 217. - P.508-516).

Ранее вирусы с субтипом H15 были выделены на территории Австралии в 1979 и 1983 годах от буревестника, пеганки и дикой утки. Вирус H15-субтипа никогда не выделялся на территории Западного полушария и относился к субтипам, циркулирующим только в Восточном полушарии, аналогично субтипу вируса Н14. Данные о выделении вируса Н15-субтипа и характеризации на территории России отсутствуют. Однако это не исключает возможности его появления, поэтому существует необходимость готовности его диагностики.

Все вышеупомянутые ссылки содержат информацию об исследовании свойств штаммов вируса гриппа Н15-субтипа. Однако в этих работах нет сведений об использовании свойств указанных штаммов в диагностических препаратах, в том числе с использованием метода РТГА. Вместе с тем описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенами от современных вариантов вируса гриппа Н15-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа Н15-субтипа, в качестве компонентов диагностических тест-систем.

Таким образом, задача по разработке средств диагностики вируса гриппа Н15-субтипа в области медицины, ветеринарии и экологии является актуальной и в настоящее время не решена.

В международной базе данных Genbank по состоянию на 10 января 2012 информация о вирусе гриппа H15N4-субтипа отсутствует. В базе данных есть информация о следующих штаммах вируса Н15-субтипа:

A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983(H15N2)

A/Australian shelduck/Western Australia/1762/1979(H15N9)

A/She/WA/2576/79(H15N6)

A/duck/Australia/341/1983(H15N8)

A/shearWater/Australia/2576/1979(H15N9)

A/wedge-tailed shearwater/Western Australia/2327/1983(H15N9)

Все они были выделены на территории Австралии около 30 лет назад.

Предлагаемый штамм вируса гриппа Н15-субтипа выделен на территории России и является единственным в мире. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.

За рубежом для РТГА используются следующие референс-штаммы (Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-22.):

A/Duck/Australia/341/83 (H15N8);

A/shearwater/West Australia/2576/79 (H15N9).

Однако по причине быстрой изменчивости антигенных свойств вируса гриппа А крайне необходимо постоянно отслеживать их изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н15-субтипа в России в РТГА не существует.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма-продуцента вируса гриппа птиц H15N4-субтипа, который обладал бы более высоким антигенным сродством к современным вариантом вируса гриппа H15 и был бы пригоден для получения поликлональной сыворотки для определения принадлежности вируса гриппа к Н15-субтипу.

Указанный технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/teal/Chany/7119/2008 Н15N4-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационным номером V-563.

Характеристика штамма

Штамм был выделен от чирка (Anas sp.) на территории Новосибирской области. Принадлежность к Н15N4-субтипу определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (Н1-Н16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105P.; Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P.193-198.). Принадлежность гемагглютинина штамма к Н15-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (574 н.о.). Обладает 90% и 89% идентичностью нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА со штаммами A/shearwater/Australia/2576/1979(H15N9) и A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983(H15N2) соответственно.

Для длительного хранения штамм A/teal/Chany/7119/2008 необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 5 лет при хранении на -70°С. Ранее показано, что одним из способов, обеспечивающих длительное хранение жизнеспособности вирусов, является получение лиофилизированных культур (А.Ю.Селезнева, 1978). Для хранения пулы штаммов необходимо разливать в стеклянные ампулы объемом 3-5 мл и лиофильно высушивать (Селезнева, А.Ю. Выживаемость вируса гриппа при длительном хранении / А.Ю.Селезнева // Вопросы вирусологии. - 1978. - № 6. - С.738-739.).

Антиген штамма A/teal/Chany/7119/2008 Н15N4-субтипа также можно длительно хранить в лиофилизированном состоянии (см. выше). Для использования его необходимо разводить фосфатно-солевым (рН 7,2) буфером соответствующего объема.

При использовании разведенного готового антигена штамма в течение одной недели, допускается его хранение в холодильнике при температуре +4°С.

Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма. Нуклеотидные последовательности задепонированны в базу данных GenBank под номерами CY098537, CY098538, CY098539, CY098540, CY098541, CY098542, CY098543, CY098544.

Кроме того, проведен филогенетический анализ гена гемагглютинина методом ближайших соседей с бутстреп анализом (500 повторов). На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево гена гемагглютинина H15-субтипа. Как видно из дендрограммы, исследуемый изолят образует отдельную линию и не входит в субкладу с равее выделенными вирусами H15-субтипа. Данный результат может свидетельствовать о значительном генетическом отличии A/teal/Chany/7119/2008 Н15N4-субтипа от остальных вирусов Н15-субтипа.

На фиг.1 приведено филогенетическое дерево гена гемагглютинина (НА) Н15-субтипа.

Анализ показывает актуальность и целесообразность использования штамма A/teal/Chany/7119/2008 Н15N4-субтипа для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа Н15-субтипа. Он может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н15-субтипа и диагностики вновь выделяемых изолятов.

Культивирование вируса осуществляют в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) при температуре 37°С.

При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов данного штамма инфекционный титр достигал 5,43 lg EID50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/teal/Chany/7119/2008 H15N4.

В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.

Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на основе заявляемого штамма A/teal/Chany/7119/2008 вируса гриппа H15N4-субтипа.

Четырем 8-недельным курам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/teal/Chany/7119/2008. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.

После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.

Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл.1). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА 1/40 (WHO, 2009). Таким образом, при заражении кур получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к Н15-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/teal/Chany/7119/2008.

Таблица 1
Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4).
Животное	Титр сыворотки до инфицирования	Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования
1	1/10	1/320
2	1/10	1/320
3	1/10	1/640
4	1/10	1/640

Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе заявляемого штамма вируса гриппа A/teal/Chany/7119/2008 Н15N4-субтипа.

Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% -пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы 3 пассажа на РКЭ. Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7°С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.

Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа H15-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н15-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (табл.1).