Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии

Классы МПК:A61K31/409  содержащие четыре таких кольца, например производные порфина, билирубин, биливердин
C07D487/22 в которых конденсированная система содержит четыре или более гетероциклических кольца
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):, , , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU),
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России") (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-02-17
публикация патента:

Изобретение относится к четвертичным аммониевым солям мезо-тетра[1- (4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина общей формулы

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218

где фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 , фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 . Эти соединения обладают высокой фотоиндуцированной активностью и могут применяться для фотодинамической терапии злокачественных новообразований в качестве фотосенсибилизатора. 3 ил.

Рисунки к патенту РФ 2476218

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218

Изобретение относится к медицине, а именно к фотосенсибилизаторам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и ряда других патологических состояний.

Метод ФДТ основан на применении природных или синтетических фотосенсибилизаторов (ФС), которые обладают способностью к избирательному накоплению (тропностью) в опухолевой ткани. При облучении светом определенной длины волны ФС переходит в активированное состояние, которое инициирует образование цитотоксических агентов - синглетного кислорода (1O2) и свободных радикалов, вызывающих разрушение структурных элементов опухолевой ткани.

Успешное применение метода ФДТ для лечения злокачественных новообразований стимулирует поиск новых ФС с улучшенными свойствами. Наиболее перспективны для ФДТ ФС с максимумом поглощения в красном и ближнем инфракрасном диапазоне (650-800 нм), так называемом «терапевтическом окне», где собственное поглощение биологической ткани минимально, что обеспечивает возможность более глубокого проникновения излучения в ткань и, как следствие, высокую эффективность терапии (Bonnett R. J. Heterocyclic Chem. 2002 V.39. P.455-470).

Среди них следует отметить ФС на основе хлоринов (дигидропорфиринов), характеризующиеся интенсивной длинноволновой полосой в области 660 нм, например, водорастворимые моно-L-аспартилхлорин е6 и другие различные формы хлорина е6, в частности, отечественные препараты Фотодитазин, Радахлорин и белорусский Фотолон (Чан Тхи Хай Иен, Г.В.Раменская, Н.А.Оборотова. Росс. Биотерапевт. Ж. 2009. Вып.4. С.99-104), а также синтетические хлорины - 5,10,15,20-тетракис(м-гидроксифенил)хлорин (Темопорфин, m-THPC, Фоскан) и производные бензопорфирина (Бензопорфирин монокислота, кольцо А).

Перспективными ФС являются производные фталоцианина. Так, препарат Фотосенс на основе сульфированного фталоцианина алюминия имеет длинноволновый максимум поглощения при фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 max=675 нм с высоким коэффициентом молярной экстинкции фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 (свыше 100000), высокий квантовый выход флуоресценции (Патент РФ № 2220722, A61K 31/409, 2004 г.). Однако Фотосенс обладает недостаточно высокой селективностью накопления в опухолевых клетках, длительным сохранением в тканях, что приводит к фототоксичности кожи.

Перспективными ФС для ФДТ являются бактериохлорины (тетрагидропорфирины), поглощающие в наиболее оптимальном диапазоне «терапевтического окна» - 740-820 нм в зависимости от строения. Проблемой здесь является поиск устойчивых при хранении производных бактериохлорина, поскольку при гидрировании порфиринового кольца одновременно со спектральным смещением уменьшается стабильность молекулы в реакциях окисления. Одним из способов решения этой проблемы является использование металлических комплексов. Так, тукад, палладиевое производное бактериохлорина (Tookad, Израиль-ФРГ-Франция) с максимумом поглощения при 760 нм, разрешен для лечения простаты.

Задачей предлагаемого изобретения является синтез ФС, характеризующихся поглощением в ближнем инфракрасном диапазоне спектра, высокой тропностью к опухолевой ткани и обладающих высокой фотоиндуцированной активностью.

Для решения поставленной задачи синтезирован ФС, представляющий собой положительно заряженные бактериохлорины - соли четвертичных аммониевых оснований на основе мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина, октабромидов мезо-тетра [1-(4'-пиридиниобутил)-3-пиридил]бактериохлорина (3-Ру4ВС(ВuРу)4Вr8, соединение 1), мезо-тетра[1-(4'-(диметилэтаноламмониобутил)-3-пиридил]бактериохлорина (3-Py4BC(BuDMAE)4Br8, соединение 2), общей формулы:

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218

где фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ,фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218

Октабромиды 1 и 2 синтезированы взаимодействием мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина тетрабромида с избытком сухого пиридина или диметиламиноэтанола, соответственно, в кипящем метаноле в течение 4,5 ч в инертной атмосфере. Исходный мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид получен при кипячении мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина с избытком 1,4-дибромбутана в нитрометане в инертной атмосфере.

На Фиг.1 приведен 1Н ЯМР спектр соединения 1 в CD3OD в области ароматических протонов.

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 Синглет фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 -пиррольных протонов расположен при 8,27 м.
Сигналы протонов пиридиниевых колец наблюдаются при 8,16 м. д. (Н-31), 8,53 м. д. (Н-5), 8,62 м. д. (Н-41), 9,17 м. д. (Н-6, Н-2 1), 9,42 м. д. (Н-4), 9,84 м. д. (Н-2).

Данные фотосенсибилизаторы (1 и 2) легко растворимы в воде и водно-солевых растворах при комнатной температуре. Они стабильны в водных многокомпонентных растворах в течение 1 месяца при варьировании концентраций от 2 до 45 мкМ в темновых условиях (в спектрах поглощения фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 max 763 нм у соединения 1, 762 нм у соединения 2 и в спектрах флуоресценции - фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 max 771 нм). Следует отметить, что в дистиллированной воде красители характеризовались меньшей устойчивостью (отмечено снижение интенсивности поглощения в максимуме на 15-20% за время наблюдения). На Фиг.2 приведены спектры поглощения раствора соединения 1 (14,2 мкМ) в 0,9% растворе NaCl и дистиллированной воде сразу после растворения (черная линия - спектры совпадают) и через месяц хранения раствора при +4°C в 0,9% растворе NaCl (синяя линия) и в дистиллированной воде (красная линия).

Фотосенсибилизаторы обладают способностью генерировать синглетный кислород в водно-солевом растворе с квантовым выходом фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 (1О2)=0,30÷0,34. В бесклеточной среде красители подвержены фотовыцветанию, что сопровождалось снижением интенсивности флуоресценции в максимуме без изменения формы спектра.

Для оценки фотосенсибилизирующих свойств было проведено исследование способности соединения 1 к фотоиндуцированной генерации синглетного кислорода в растворе. Установлено, что исследуемое соединение в мономерном состоянии обладает средним квантовым выходом генерации синглетного кислорода фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 (1O2)=0,32±0,02. В подтверждение генерации именно 1O2 показано, что реакция обесцвечивания 4-нитрозо-N,N-диметиланилина в присутствии гистидина, лежащая в основе определения 1O2, полностью подавляется азидом натрия, известным тушителем 1O 2.

Красители обладали фототоксичностью in vitro в отношении опухолевых клеток человека различного эпителиального происхождения: эпидермоидной карциномы гортаноглотки (НЕр2), аденокарциномы легкого (А549) и карциномы толстой кишки (НТ29) при варьировании концентрации раствора красителя от 0,15 до 40 мкМ, времени инкубации до светового воздействия 0,5-6 часов и плотности энергии 2-10 Дж/см2.

Настоящее изобретение характеризуется следующими примерами:

Пример 1

мезо-Тетра[1-(4'-пиридиниобутил)-3-пиридил]бактериохлорин октабромид (1). мезо-Тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид (0,09 г, 0,06 ммоль) растворяют в 4 мл метанола и добавляют 1 мл сухого пиридина. Реакционную массу перемешивают при кипячении в течение 4,5 ч в инертной атмосфере. После охлаждения до комнатной температуры реакционную массу упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 5 мл метанола, добавляют 50 мл бензола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают бензолом. Получают 0,093 г (85,3%) соединения 1. ЭСП, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 макс, нм (lg фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ), метанол: 761 (5,04), 516 (4,70), 421 (4,11), 374 (4,93), 349 (4,95). ЭСП, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 макс, нм (lg фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ), вода: 763 (5,02), 518 (4,71), 419 (4,34), 374 (4,95), 351 (4,97). ЭСП, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 макс, нм (lg фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ), PBS (pH 7,4): 760 (4,96), 694 (3,89), 515 (4,61), 416 (4,35), 372 (4,91), 348 (4,93). Спектр 1H ЯМР (CD 3OD), фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 , м.д.: 2,34-2,42 (м, 16Н, СН2), 4,09-4,38 (м, 8Н, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 -Н), 5,02-5,04 (м, 8Н, СН2), 8,14-8,18 (м, 8Н, m-Н (Ру)), 8,27 (с, 4Н, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 -Н), 8,50-8,56 (м, 4Н, Н-5 (Ру)), 8,60-8,64 (м, 4Н, n-Н (Ру)), 9,16-9,18 (м, 12Н, Н-6 (Ру), о-Н (Ру)), 9,42 (д, 4Н, Н-4 (Ру)), 9,83-9,85 (м, 4Н, Н-2 (Ру)).

Пример 2

мeзo-Teтpa[1-(4'-диметилэтаноламмониобутил)-3-пиридил]бактериохлорин октабромид (2). Тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид (0,09 г, 0,06 ммоль) растворяют в 4 мл метанола и добавляют 1 мл диметилэтаноламина. Реакционную массу перемешивают при кипячении в течение 4,5 ч в инертной атмосфере. Выделение соединения 2 проводят по методике, описанной для соединения 1. Получают 0,09 г (80,9%) соединения 2. ЭСП, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 макс, нм (lg фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ), метанол: 763 (4,93), 516 (4,64), 422 (4,44), 373 (4,87), 350 (4,89). ЭСП, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 макс, нм (lg фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ), вода: 763 (4,90), 518 (4,55), 419 (4.41), 374 (4,83), 351 (4,85). Спектр 1H ЯМР (CD3OD), фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 , м.д.: 2,09-2,13 (м, 8Н, СН2), 2,34-2,37 (м, 8Н, СН2), 3,24 (с, 24Н, СН3), 3,53-3,59 (м, 8Н, CH2), 3,63-3,66 (м, 8Н, СН2), 3,99-4,04 (м, 8Н, СН2), 4,10-4,38 (м, 12Н, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 -Н, ОН), 5,03-5,06 (м, 8Н, СН2), 8,27 (с, 4Н, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 -Н), 9,50-9,53 (м, 4Н, Н-5 (Ру)), 9,18-9,23 (м, 4Н, Н-6 (Ру)), 9,44 (д, 4Н, Н-4(Ру)),9,86 (с, 4Н, Н-2(Ру)).

Пример 3

Определение фотостабильности соединения 1.

Фотостабильность соединения 1 изучали в насыщенном воздухом водном растворе при равномерном облучении непрерывным Nd3+-YAG лазером (длина волны генерации 532 нм, мощность 0,82 мВт) в течение 30 мин. Фотодеградацию 1 регистрировали через каждые 10 мин по уменьшению поглощения в максимуме длинноволновой Q-полосы. Квантовый выход фотообесцвечивания (фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ф) определяли по тангенсу угла наклона графика зависимости числа фотообесцвеченных молекул в растворе N мол, определяемого по формуле (1), от числа поглощенных квантов Nкв, определяемого по формуле (2).

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ,

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 ,

где D0 и D - поглощение в максимуме Q - полосы фотосенсибилизатора до и после облучения. С0 - концентрация фотосенсибилизатора в растворе до облучения; NА - число Авогадро, I - мощность на образце, фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 - длина волны облучающего света, Dфотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 - оптическая плотность облучаемого раствора на длине волны лазера, t - время облучения в секундах, с - скорость света, h - постоянная Планка, V - объем раствора в кювете.

Измеренная линейная зависимость количества фотообесцвеченных молекул от числа поглощенных квантов характеризуется тангенсом угла наклона 9,5×10-4, который численно равен квантовому выходу фотообесцвечивания фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 . Согласно величине фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 фотообесцвечивание фотосенсибилизатора 1 происходит после поглощения около 1000 квантов света на молекулу, т.е. по фотостабильности он сравним с другими производными бактериохлорина - мезо-тетра(1-метил-3-пиридил)бактериохлорин тетратозилата и мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромида, для которых фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 соответственно равны 18,5×10-4 и 8,7×10 -4.

Пример 4.

Накопление и внутриклеточная локализация соединения 1 в клетках карциномы легкого человека (культура клеток А549).

Изучение внутриклеточной локализации красителя в клетках проведено с применением метода конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ). Концентрация фотосенсибилизатора в среде варьировалась от 0,5 до 10 мкМ, время инкубации составляло 1-6 часов. Возбуждение флуоресценции проводили Nd3+-YAG лазером с длиной волны генерации 532 нм. Выявлено, что краситель проникает в клетки и накапливается в цитоплазме (диффузное распределение, а также концентрирование в гранулах), но не проникает в ядро. При изучении внутриклеточной кинетики показано, что максимальное накопление соединения 1 в цитоплазме клеток А549 наблюдается после 4 часов инкубации (Фиг3).

Анализ внутриклеточных спектров показал, что в цитоплазме клеток соединение 1 присутствует в различных состояниях, описываемых спектрами с максимумами флуоресценции 771, 773, 776 и 780 нм, отличными от спектра в PBS или в воде. С целью выяснения причин этих изменений было проведено исследование влияния микроокружения на флуоресценцию соединения 1.

Спектр с максимумом 771 нм наиболее близок к спектру 1 в комплексах с БСА и ЧСА, спектр с максимумом 773 - к спектру 1 в комплексах с глобулинами, спектр с максимумом 776 нм - в комплексах с нуклеиновыми кислотами.

Исследована кинетика накопления соединения 1 в клетках А549. Обнаружено, что в клетках соединение 1 накапливается довольно медленно: насыщение внутриклеточного накопления наблюдается только после 4 ч инкубации.

Пример 5.

Фотоиндуцированная активность соединения 1 в отношении клеток карциномы легкого человека (культура клеток А549). Фотосенсибилизатор вносили в культуральную среду в концентрации от 0,3 до 30 мкМ. Время инкубации варьировали от 30 минут до 6 часов. Облучение проводили как в примере 3, уровень ингибирования роста культуры вычисляли по формуле:

ИР (%)=[(Пк о)/Пк]×100%,

где ИР - ингибирование роста культуры, в процентах;

По и П к - число жизнеспособных клеток, выраженное в единицах оптической плотности, соответственно, в опытных (с красителем) и контрольных (без красителя) пробах. Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста культуры на 50% (ИК50).

Показано, что соединение 1 обладало высокой фототоксичностью в отношении клеток культуры А549. Максимальная фотоиндуцированная активность наблюдалась при 4 часах инкубации (ИK50 составляла 1,5±0,07 мкМ), при увеличении временного интервала величина ИК50 изменялась незначительно. Соединение 1 не обладало темновой токсичностью в течение суток наблюдения (ИК50>>20 мкг/мл).

Тестирование фотосенсибилизаторов 1 и 2 in vitro показало, что они проявляют высокую фототоксичность и в отношении опухолевых клеток человека НЕр2. Величина ИК50 составляла 0,67±0,08 мкг/мл и 0,9±0,1 мкг/мл, соответственно. Темновая токсичность отсутствовала.

Таким образом, предложенный ФС обладает всеми свойствами, которые в дальнейшем позволят эффективно применять их для ФДТ злокачественных новообразований.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Четвертичные аммониевые соли мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина общей формулы

фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218

где фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218 , фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии, патент № 2476218

как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2476218

patent-2476218.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K31/409  содержащие четыре таких кольца, например производные порфина, билирубин, биливердин

Патенты РФ в классе A61K31/409:
фотосенсибилизатор и способ его получения -  патент 2523380 (20.07.2014)
способ фотодинамической терапии больных с опухолевыми метастатическими плевритами -  патент 2514107 (27.04.2014)
способ получения хлоринов и их фармацевтические применения -  патент 2513483 (20.04.2014)
способ антимикробной фотодинамической терапии острых воспалительных заболеваний гортаноглотки или их гнойных осложнений -  патент 2511545 (10.04.2014)
способ повышения резистентности организма млекопитающих при радиационном поражении -  патент 2508100 (27.02.2014)
способ лечения поражений, ассоциированных с воздействием алкилирующих веществ -  патент 2506083 (10.02.2014)
способ комплексного лечения острых эпидидимоорхитов, вызванных грамположительной и грамотрицательной микрофлорой -  патент 2495692 (20.10.2013)
способ лечения дистрофических заболеваний вульвы -  патент 2482893 (27.05.2013)
фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии -  патент 2479585 (20.04.2013)
карборанилпорферины и их применение -  патент 2477161 (10.03.2013)

Класс C07D487/22 в которых конденсированная система содержит четыре или более гетероциклических кольца

Патенты РФ в классе C07D487/22:
способ получения хлоринов и их фармацевтические применения -  патент 2513483 (20.04.2014)
металлокомплексы тетра-(4-трет-бутил-5-нитро)фталоцианина -  патент 2507229 (20.02.2014)
способ получения метилфеофорбида (а) -  патент 2490273 (20.08.2013)
способ получения безметальных тетраазахлоринов -  патент 2479586 (20.04.2013)
фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии -  патент 2479585 (20.04.2013)
карборанилпорферины и их применение -  патент 2477161 (10.03.2013)
гетерогенный сенсибилизатор и способ фотообеззараживания воды от вирусного загрязнения -  патент 2470051 (20.12.2012)
ингибитор pim1-киназы 6-[(4-метил-1-1-пиперазинил)метил]-индоло[1',7':1,2,3]пирроло[3',4':6,7]азепино[4,5-b]индол-1,3(2н, 10н)-дион, способ его получения и применение -  патент 2466132 (10.11.2012)
способ получения фосфонометилзамещенных фталоцианинов -  патент 2465908 (10.11.2012)
способ получения натриевой соли окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта -  патент 2464021 (20.10.2012)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

Патенты РФ в классе A61P35/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)

Наверх