синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при призводстве кисломолочных продуктов

Формула изобретения

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов, имеют нуклеотидные последовательности:

Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'

Bill 2R 5'-с cca gca tgg agt cgg cgg-3'.

2. Способ выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов, включающий проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, праймеры имеют нуклеотидную последовательность

Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'18

Bill 2R 5'-с cca gca tgg agt cgg cgg-3'19,

а в случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Bifidobacterium longum subspecies longum.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum.

Одним из способов выявления Bifidobacterium, кроме микробиологического, является ПЦР-метод с использованием праймеров lm26 и lm3, позволяющий синтезировать сегмент 16S rRNA размером в 1,35 кb., позволяющий различать бифидобактерии от других бактерий (Р.Kaufman, A.Pfefferkorn, M.Teuber and L.Meile / Identification and Quantification of Bifidobacterium Species Isolated from Food with Genus-Specific 16S rRNA-Targeted Probes by Colony Hybridization and PCR // Appl. and Environ. Microbiol. - Apr. 1997. - Vol.63, No.4. - P.1268-1273

К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род - это Bifidobacterium, невозможна дифференциация на виды и подвиды.

Другим решением данного способа является синтез с помощью ПЦР генов 16S rRNA при использовании праймеров, подобранных на основе последовательностей 16S rRNA пяти видов Bifidobacterium: bifidum, adolescentis, infantis, breve и longum. Можно выявлять не только род, но и вид данных бактерий (Dong X, Cheng G, Jian W. / Simultaneous identification of five Bifidobacterium species isolated from human beings using multiple PCR primers // Syst Appl Microbiol. - 2000. - Oct. - vol.23(3). - P.386-390) с учетом точечных мутаций характерных для рода и видов Bifidobacterium species (T. Matsuki, К. Watanabe, J. Fujimoto, Y. Kado, T. Takada / Quantitative PCR with 16S rRNA-Gene-Targeted Species-Specific Primers for Analysis of Human Intestinal Bifidobacteria // Appl. and Environ. Microbiol. - Jan. 2004. - vol.70. - No. 1. - P.167-173).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род и вид Bifidobacterium и невозможна дифференциация на подвиды.

Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и способов выявления Bifidobacterium longum subspecies longum при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидные последовательности:

Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3'

Bill 2R 5'-сccagcatggagtcggcgg-3'.

Задача решается тем, что в способе выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, включающем проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидную последовательность

Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3'

Bill 2R 5'-сccagcatggagtcggcgg-3',

а в случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Bifidobacterium longum subspecies longum.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов

Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена BLLJ1840 glycosyi hydrolase, характерного для Bifidobacterium longum subspecies longum, при анализе полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства специфического фрагмента ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum с ДНК различных штаммов этой бактерии. Олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента с содержанием оснований GC не менее 50% и не образовывать димеры.

Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.

Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.

Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum.

Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов

Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Выделение ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum.

Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Bifidobacterium longum subspecies longum, выращенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.

При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 100 мкл культуры добавляют к 400 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (250-300 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.

Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции.

Состав реакционной смеси. Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-НСl рН 8,9; 160 мМ (NH)₄SO ₄; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, по 0,25 мкМ каждого праймера; 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.

Температурный режим проведения ПЦР. Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 56°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.

Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.

Электрофорез ампликонов проводят в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).

Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 40 мА в течение 25-30 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 в/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».

В качестве маркера используют ДНК pBLSK, гидролизованную MspI (на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п.).

Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 447 нуклеотидных пар.

Пример 3. Определение специфичности ПЦР.

Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами Bill 1F и Bill 2R представлены в таблице 1, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.

Таблица 1
№ п/п	Наименование культуры	ПЦР с праймерами Bill 1F и Bill 2R
1	Staphylococcus albus	Отрицательно
2	Staphylococcus aureus	Отрицательно
3	Streptococcus epidermitis	Отрицательно
4	Streptococcus pyogenes	Отрицательно
5	Escherihia coli	Отрицательно
6	Proteus vulgaris	Отрицательно
7	Streptococcus termophilus 28-2. Коллекция ВНИИМС, Углич	Отрицательно
8	Lactococcus lactis subsp.lactis C9182. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Отрицательно
9	Lactococcus lactis subsp.cremoris 3M-5. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Отрицательно
10	Bifidobacter. longum subsp.longum 3-1. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
11	Bifidobacter. longum subsp.longum S-3. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
12	Bifidobacter. longum subsp.longum KS-3. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
13	Bifidobacter. longum subsp.longum T4. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
14	Bifidobacter. longum subsp.longum ST. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
15	Bifidobacter. longum subsp.longum KST. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
16	Bifidobact. Long. subsp.longum MC-2H. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
17	Bifidobac. Long. subsp.longum MC42M. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
18	Дистиллированная вода	Отрицательно

Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longums, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование.

Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью вышеназванных референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F.

Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum, обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum, используемых в заквасочных культурах молокоперерабатывающей промышленности.