ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами

Классы МПК:A61K31/728 гиалуроновая кислота
C08B37/08 хитин; хондроитинсульфат; гиалуроновая кислота; их производные
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Общество с ограниченной ответственностью Инновационный Центр Института Нефтехимии и Катализа "ИНКИ" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2011-01-12
публикация патента:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином структуры, как определено в формуле изобретения, с содержанием 20-50% остатков новокаина. Конъюгат растворим в воде, обладает амфотерными свойствами и не содержит побочных O-ацилизомочевин. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к новым химическим веществам, а именно к модифицированной гиалуроновой кислоте, которая может быть использована в косметической, пищевой индустрии, в фармакологии, ветеринарной практике и фармацевтической промышленности.

Гиалуроновая кислота (ГК) - гетерополисахарид линейного строения, относится к классу кислых гликозаминогликанов, находится в соединительных тканях животных и человека и состоит из звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина. Молекулярная масса ГК 10 4-2×106 Да.

конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351

На основе ГК выпускаются следующие фармакопейные препараты. Высокомолекулярная ГК (М=106 Да) входит в состав гелей «Provisk» (Швеция) и «Healon» (Канада), применяющихся в офтальмохирургии при операциях экстракции катаракты, является действующим веществом в пленках «Seprafilm» для предупреждения спаечной болезни брюшины. Низкомолекулярной ГК пропитывают салфетки «Гиаплюс», предназначенные для лечения ожоговой болезни. Для лечения трофических язв и угрей применяют цинковую соль ГК (лекарственное средство «Куриозин» (в виде раствора и геля), а препарат «Цистистат» предназначается для восстановления поврежденной слизистой оболочки мочевого пузыря при интерстициальном цистите. ГК является составным компонентом косметических шампуней, кремов и тоников для стимуляции роста волос. Запатентовано также применение ГК в лечении герпеса, псориаза, а также для изготовления суппозиториев различного назначения [Понеделькина И.Ю., Лукина B.C., Одиноков В.Н. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация (обзор) // Биоорг. химия. 2008. Т.34. № 1. С.5-28].

ГК является отрицательно заряженным полиэлектролитом. Введение в структуру ГК групп с противоположным зарядом придает молекулам ГК амфотерные свойства, при этом усиливаются внутри- и межмолекулярное взаимодействие макромолекул. ГК приобретает способность образовывать гидрогели, обладающие влагоудерживающими свойствами. Также полиамфолиты на основе ГК могут применяться как носители для других молекул, например, ДНК [Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Mamyama A. Synthesis of novel polyampholyte comb-type copolymers consisting of a poly(L-lysine) backbone and hyaluronic acid side chains for a DNA carrier // Bioconjug Chem. 1998. V.9. № 4. P.476-81].

Среди известных синтезированных ранее производных ГК амфотерными по структуре являются конъюгаты ГК с карбодиимидами различного строения [Vercruysse K.P., Prestwich G.D. Hyauronate derivatives in drug delivery // Therapeutic Drug Carrier Systems. 1998. V. 15. № 5. P.513-555], с гидразидом изоникотиновой кислоты [Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. Уфа, 2007. 110 С.(www.anrb.ru/ink, диссер. совет)] и гексаметилендиамином [Yeom J., Bhang S., Kim B-S., Seo M.S., Hwang E.J., Cho I.H., Park J.K., Hahn S.K. Effect of cross-linking reagents for hyaluronic acid hydrogel dermal fillers on tissue augmentation and regeneration // Bioconjugate Chem. 2010. V.21, P. 240-247]. Амфотерные свойства этих конъюгатов не исследованы.

Одним из способов получения ГК с амфотерными свойствами является ковалентное связывание ГК с конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 -диэтиламиноэтиловым эфиром пара-аминобензойной кислоты (новокаином). Новокаин относится к классу местноанестезирующих препаратов. Кроме анестезирующего действия, новокаин при непосредственном введении в ток крови оказывает общее влияние на организм: уменьшает образование ацетилхолина и понижает чувствительность периферических холинорецепторов, проявляет блокирующее влияние на вегетативные ганглии, ослабляет спазмы гладкой мускулатуры, возбудимость мышцы сердца и моторных зон коры большого мозга [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг. 1997. Т.2. С.590]. В организме новокаин относительно быстро гидролизуется, образуя п-аминобензойную кислоту (витамин Hi) и диэтиламиноэтанол (оказывает умеренное сосудорасширяющее действие), которые сами являются фармакологически-активными веществами.

Конъюгаты гликозаминогликанов (ГАГ) (хондроитин-сульфатов, гепарина и окисленной по первичной гидроксигруппе гиалуроновой кислоты) с новокаином являются известными [1-8, см. ниже ссылки]. Они были получены реакцией ГАГ с новокаином в присутствии конденсирующего реагента водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) и содержали (в зависимости от соотношения реагентов), по данным ЯМР-спектроскопического анализа, 33-38% остатков новокаина (в расчете на 100 дисахаридных звеньев) в модифицированном хондроитинсульфате, 66-90% - в модифицированном гепарине, 60% - в окисленной ГК (схема 1). Ссылки 1-8:

1. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина B.C., Тюмкина Т.В., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Химическая модификация гепарина // Биоорг. химия. 2006. Т.32. № 5. С.524-529;

2. Понеделькина И.Ю., Лукина Е.С., Одиноков В.Н. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация (обзор) // Биоорг. химия. 2008. Т.34. № 1. С.5-28;

3. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина Е.С., Джемилев У.М. Конъюгация хондроитинсульфатов с аминами // Биоорг. химия. 2008. Т.34. № 5. С.704-710;

4. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н. Лукина Е.С., Суфиярова Р.Ш. Парфенова Т.И., Башкатов С.А., Сибагатуллин Н.Г., Джемилев У.М. // Пат. РФ № 2283320. Опубл. 10.09.2006. БИ № 25;

5. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н. Лукина Е.С.Сибагатуллин Н.Г., Суфияров И.Ф., Серик Е.М., Джемилев У.М. // Пат. РФ № 2298406. Опубл. 10.05.2007. БИ № 13;

6. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина Е.С., Джемилев У.М., Иванова О.В, Саитгалина Э.А. // Пат. РФ № 2318830. Опубл. 10.03.2008. БИ № 7;

7. Понеделькина И.Ю., Саитгалина Э.А., Лукина Е.С., Одиноков В.Н., Джемилев У.М. // Патент РФ № 2350625. Опубл. 27.03.2009. БИ № 9;

8. Понеделькина И.Ю., Суфияров И.Ф., Лукина Е.С., Саитгалина Э.А., Одиноков В.Н., Джемилев У.М. // Пат. РФ № 2343932. Опубл. 20.01.2009. БИ № 2.

Схема 1

конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351

Кроме остатков новокаина, конъюгаты хондроитинсульфатов из пупочных канатиков новорожденных содержали 3% O-ацилизомочевин (продуктов присоединения КДИ по карбокси-группам), конъюгаты гепарина -3-10%, конъюгаты дерматансульфата из кожи свиньи - 32%.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является конъюгат ГК, содержащий, в зависимости от соотношения реагентов, 10-53% остатков новокаина и 18-36% уреидных остатков (O-ацилизомочевин) [Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. Уфа, 2007. 110 С. (www.anrb.ru/ink. диссер. совет)] (рис.1). Он был получен согласно схеме 1 и при большом содержании O-ацилизомочевин практически не растворялся в воде.

Главным недостатком упоминаемого конъюгата является наличие в его составе побочных продуктов присоединения карбодиимида (рис.1), вследствие чего растворимость соединения практически сводилась к минимуму.

Рис.1.

конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351

Задачей предлагаемого изобретения является получение обладающего амфотерными свойствами водорастворимого конъюгата ГК с новокаином, не содержащего побочных продуктов. Это достигается следующим образом. Реакцию ГК с новокаином проводят в присутствии КДИ и N-гидроксибензотриазола (HOBt) как добавки, препятствующей образованию побочных O-ацилизомочевин. Синтез осуществляют в водной среде (рН 4.7-4.8) при комнатной температуре в течение 30-60 мин при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1-2:0.5-2:0.75-2 и получают водорастворимые продукты с 20-50% остатков новокаина, не содержащие O-ацилизомочевин (схема 2). Следует отметить, что HOBt применяется в пептидном синтезе и иногда используется в карбодиимидном синтезе некоторых производных ГК (в 1-5-кратном избытке по отношению к СООН-группе субстрата) [Kurisawa М., Chung J.E., Yang Y.Y., Gaoa Sh.J., Uyama H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering // Chem. Commun. 2005. P. 4312-4314; Bulpitt P., Aeschlimann D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V.47. P.152-169; Crescenzi V., Francescangeli A., Taglienti A., Capitani D., Mannina L. Synthesis and partial characterization of hydrogels obtained via glutaraldehyde crosslinked of acetylated chitosan and of hyaluronan derivatives // Biomacromolecules. 2003. V.4. P.1045-1054; Crescenzi V., Francescangeli A., Taglienti A. New gelatin-based hydrogels via enzymatic net working // Biomacromolecules. 2002. V.3. P.1384-1391].

Схема 2

конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351

Все образцы конъюгатов ГК с 20-50% остатков новокаина проявляли свойства полиамфолитов [Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Maruyama A. // Bioconjug. Chem. 1998. V.9. № 4. P.476-481.], т.е. измеренная при 500 нм мутность их водных растворов (при концентрации 4 мг/мл) изменялась при варьировании рН от 2 до 11. Максимальное поглощение растворов образцов наблюдалось при рН 2-5.5 (табл.1).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 0.1 г (0.25 ммоль) ГК, 0.07 г (0.25 ммоль) новокаина, 0.016 г (0.125 ммоль) HOBt помещают в стеклянную емкость объемом 100 см3, оборудованную магнитной мешалкой. Затем добавляют 25 мл дистиллированной воды. Все компоненты перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Доводят раствор до рН 4.75 с помощью 0.1 М NaOH, прибавляют 0.036 г (0.19 ммоль) водорастворимого КДИ и интенсивно перемешивают реакционную массу в течение 0.5 ч, поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 М НСl. Далее к охлажденной до 0-5°С реакционной массе добавляют 0.1 М NaOH (до рН 7), 3-5 мл насыщенного раствора NaCl и 75 мл этилового спирта. Образовавшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-5 мин. Полученный осадок растворяют в 15 мл 6% NaCl и добавляют 45 мл этилового спирта. Вновь образовавшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-5 мин, промывают этиловым спиртом, затем диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. Таким образом получают модифицированную ГК с новокаином со степенью замещения карбоксильных групп полимера 20% мол. (схема 2).

Для получения конъюгатов с новокаином использовали ГК с молекулярной массой от 40 кДа [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Вахрушева B.C., Голикова М.Т., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами // Биоорган. химия. 2005 г. Т. 31. № 1. С.90-95]) и выше.

Конверсию карбоксильных групп ГК в амидные определяли по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии, используя интегральные интенсивности характеристических сигналов протонов остатков новокаина (сигнал с конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 1.4 м.д. (т, J=14.1 и 7.0 H2, NCF2 CH3)) по отношению к интенсивности сигнала метильных протонов ацетамидной группы ГК в области 5 2 м.д. в качестве внутреннего стандарта. Спектры 1H-ЯМР и 13 С-ЯМР регистрировали для растворов в D2O на спектрометре Bruker АМХ-400 (рабочая частота для 1Н-ЯМР - 400 МГц), в качестве стандарта использовали ацетон. Спектры в видимой области (500 нм) получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».

Амфотерные свойства конъюгата ГК с 20% остатков новокаина в зависимости от рН (от 2 до 11) исследовали по методике, приведенной в работе Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Maruyama A. // Bioconjug. Chem. 1998. V.9. № 4. P.476-481. Готовили несколько растворов образца с концентрацией 4 мг/мл, рН каждого раствора доводили до нужного значения и измеряли поглощение (мутность) при 500 нм. Максимальное поглощение растворов образцов наблюдалось при рН 2-5.5.

Таблица 1.
А (конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 500 нм)А (конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 500 нм)
20.1702 70.1170
3 0.16237.5 0.1168
40.1592 80.1171
5 0.14119 0.1150
5.50.1317 100.1121
6 0.119311 0.1102

Пример 2. Конъюгат ГК с содержанием остатков новокаина 35% мол. получен аналогично Примеру 1, но при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1.5:1.5:1.5.

Таблица 2.
рНА (конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 500 нм) РНА (конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 500 нм)
20.2110 70.1523
3.5 0.20037.5 0.1512
4.50.1932 80.1509
5 0.17349.5 0.1493
5.50.1738 100.1496
6 0.170211 0.1498

Пример 3. Конъюгат ГК с содержанием остатков новокаина 50% мол. получен аналогично Примеру 1, но при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1:2:2.

Таблица 3.
рHА (конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 500 нм)А (конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351 500 нм)
20.2601 70.2421
3.5 0.25457.5 0.2437
40.2567 8.50.2408
5 0.25439 0.2396
5.50.2510 100.2398
6 0.243211 0.2379

Как видно из результатов (табл.1-3), при увеличении степени замещения карбоксильных групп полисахарида на остатки новокаина с 20% до 50% мол. оптическая плотность (мутность) растворов образцов пропорционально увеличивается и максимальное значение имеет при рН 2-5.5. При рН 6-11 значение оптической плотности практически не изменялось.

Водорастворимые конъюгаты ГК с новокаином, обладающие амфотерными свойствами, могут применяться в качестве биоматериала с репаративно-регенеративными свойствами в медицине, носителя для других молекул (как кислот, так и оснований по природе), а также в косметической продукции.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином формулы

конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином с амфотерными свойствами, патент № 2473351

где n=20-50%, m=50-80%,

обладающий амфотерными свойствами.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2473351

patent-2473351.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K31/728 гиалуроновая кислота

Патенты РФ в классе A61K31/728:
вискоэластичный раствор для контрастирования задней гиалоидной мембраны -  патент 2527767 (10.09.2014)
низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты и содержащее его лекарственное средство -  патент 2519781 (20.06.2014)
композиция для лечения цистита -  патент 2519010 (10.06.2014)
композиция для костной пластики (варианты) -  патент 2516921 (20.05.2014)
раствор для получения покрытия на имплантатах и биоматериалах -  патент 2509554 (20.03.2014)
средство для стимуляции роста волос -  патент 2505301 (27.01.2014)
способ комплексной переработки рыбного сырья для получения гиалуроновой кислоты и коллагена -  патент 2501812 (20.12.2013)
новые фармацевтические композиции -  патент 2501566 (20.12.2013)
глазные композиции на основе полисахарида семян тамаринда и гиалуроновой кислоты -  патент 2493855 (27.09.2013)
стерилизуемая путем нагрева инъецируемая композиция, содержащая гиалуроновую кислоту или одну из ее солей, полиолы и лидокаин -  патент 2493815 (27.09.2013)

Класс C08B37/08 хитин; хондроитинсульфат; гиалуроновая кислота; их производные

Патенты РФ в классе C08B37/08:
стабилизатор липосомальных суспензий и способ его получения -  патент 2529179 (27.09.2014)
способ получения нерастворимого в воде серосодержащего биополимера на основе хитозана -  патент 2520493 (27.06.2014)
способ комплексной переработки рыбного сырья для получения гиалуроновой кислоты и коллагена -  патент 2501812 (20.12.2013)
способ получения глюкан-хитозанового комплекса из дрожжевой биомассы отходов пивоваренного производства -  патент 2499836 (27.11.2013)
противоопухолевые средства с бензофенантридиновой структурой и содержащие их препараты -  патент 2492862 (20.09.2013)
имидированный биополимерный адгезив и гидрогель -  патент 2486907 (10.07.2013)
способ получения хитозан-нуклеинового гидролизата -  патент 2483110 (27.05.2013)
способ получения водорастворимых олигомерных гомологов хитозана в гетерогенной системе -  патент 2479590 (20.04.2013)
электрохимический способ очистки хондроитина сульфата -  патент 2478652 (10.04.2013)
способ получения n,s-содержащего полимера на основе хитозана -  патент 2478651 (10.04.2013)


Наверх