фармацевтическая композиция, содержащая анти-cd6 моноклональное антитело, пригодная для диагностики и лечения ревматоидного артрита

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, подходящая для лечения ревматоидного артрита, содержащая в качестве действующего начала моноклональное антитело, которое распознает дифференцировочный антиген CD6 лейкоцитов человека, продуцируемое секретирующей гибридомой IOR-T1A с депозитарным № ECACC 96112640, и подходящий наполнитель.

2. Способ применения фармацевтической композиции по п.1, в котором пациенту вводят композицию в виде инъекций в пределах дозировок от 0,05 до 1 мг/кг веса тела.

3. Применение моноклонального антитела, как определено в п.1, для получения лекарственного препарата для лечения ревматоидного артрита.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение связано с лекарственными препаратами для людей и, в особенности, с созданием фармацевтических композиций, содержащих гуманизированное моноклональное антитело, распознающее дифференцировочный антиген CD6 лейкоцитов, и, в частности, с терапевтическими составами, которые содержат гуманизированное моноклональное антитело, распознающее дифференцировочный антиген CD6 лейкоцитов, которое способно вызывать продолжительный терапевтический эффект у пациентов с ревматоидным артритом.

Описание предшествующего уровня техники

Для лечения аутоиммунных заболеваний и, в частности, ревматоидного артрита (РА) существуют различные стратегии, связанные с их известными иммунопатологическими механизмами (Smolen, J. S. et al. (2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:473; Feldmann, M. et al. (2005) Nature 435:612). Однако на сегодняшний день для ревматоидного артрита не существует способа лечения, который при кратковременном применении вызывал бы продолжительный клинический ответ (Garber, K. (2005) Nature Biotechnology 23(11): 1323).

На сегодняшний день для лечения пациентов с аутоиммунными заболеваниями и, в частности, для терапии пациентов с ревматоидным артритом, известно несколько видов биотерапии (лечения с использованием биологически активных препаратов), хотя их клинический эффект в качестве монотерапии весьма ограничен (Olsen, NJ. et al. (2004) N Engl J Med 350:2167). Более того, комбинированная терапия биологическими агентами с метотрексатом может вызывать клиническую ремиссию у 30-40% пациентов с ревматоидным артритом, но, несмотря на лечение, заболевание остается достаточно активным у большинства пациентов, а полная ремиссия встречается редко (Pincus, T. et al. (1999) Ann Intem Med 131:768; Olsen, NJ. et al. (2004) N Engl J Med 350:2167). Кроме того, для таких подходов были описаны множественные и тяжелые осложнения (O'Dell, J. R. (2004) N Engl J Med 350:2591).

Моноклональные антитела (мАТ) представляют собой биологические агенты, используемые для лечения аутоиммунных заболеваний (Feldmann, M. et al. (2005) Nature 435:612). В частности, моноклональные антитела, способные истощать аутореактивные клетки, представляют терапевтический интерес, обусловленный гипотезой, что для получения терапевтического эффекта у пациентов с аутоиммунным заболеванием, таким как ревматоидный артрит, требуется длительное истощение лимфоцитов (Edwards, J.C. et al. (2004) N Engl J Med 350:2572; Stohl, W. et al. (2006) Clinical Immunology 121:1; Browning, J. L. (2006) Nature Reviews Drug Discovery 5:564). Вызываемая истощением лимфоцитов иммуносупрессия является общим механизмом терапевтического действия некоторых методов лечения аутоиммунных заболеваний (Kahan, B.D. (2003) Nature Reviews Immunology 3:831). Однако терапевтические эффекты являются ограниченными и сопровождаются тяжелыми осложнениями (Edwards, J.C. et al. (2004) N Engl J Med 350:2572; Hale, D.A. (2004) Current Opinion Immunology 16:565; Goldblatt, F. et al. (2005) Clinical and Experimental Immunology 140:195).

Поэтому лучшее понимание молекул и механизмов, вовлеченных в физиопатологию аутоиммунных заболеваний и, в частности, ревматоидного артрита, должно привести к открытию новых терапевтических мишеней, которые являются предполагаемым «переключателем» от удаления аутореактивных клеток к индукции или восстановлению толерантности и иммунорегуляции у пациента (Taylor, P. C. et al. (2004) Current Opinion Pharmacology 4:368; Feldmann, M. et al. (2005) Nature 435:612).

На сегодняшний день дифференцировочный антиген CD6 лейкоцитов является мало известной и слабо описанной молекулой. CD6 представляет собой поверхностный гликопротеин, экспрессируемый преимущественно в Т-лимфоцитах и в минорной субпопуляции В-лимфоцитов периферической крови здоровых индивидуумов. Однако сведения о происхождении и функциональных характеристиках этих клеток очень ограничены. В основном полагают, что CD6 в этих клетках является рецептором, выполняющим костимулирующие функции, но механизм остается неизвестным (Aruffo, A. et al. (1997) Immunol Today 18(10):498; Patel, D.D. (2000) J Biol Regul Homeost Agents 2000 14(3):234). Его экспрессия в зрелых тимоцитах ассоциирована с процессом созревания лимфоцитов в этом лимфоидном органе (Singer, N.G. et al. (2002) Int Immunol. 14(6):585).

Молекула CD6 представляет терапевтический интерес, и было заявлено, что механизм действия моноклональных антител к CD6 основан на их способности ингибировать и модулировать связывание CD6 с его лигандом, называемым ALCAM (молекула адгезии активированных лейкоцитов) (Патент США 6372215). Поэтому эти антитела считали пригодными для лечения аутоиммунных заболеваний, но на основе этой заявки по существу не было опубликовано данных об их терапевтическом применении у пациентов.

Молекулу CD6 распознает мышиное моноклональное антитело ior-t1. Терапевтические составы этого мышиного моноклонального антитела обладают терапевтическим действием при псориазе (Montero, E. et al. (1999) Autoimmunity 29(2): 155). Впоследствии, с помощью генно-инженерных методов (патент № 0699755, Европейский патентный бюллетень) была получена гуманизированная версия этого мышиного моноклонального антитела к CD6 человека, названная Th1 (EP 0807125 A2).

Новизна этого изобретения основана на создании терапевтических составов, содержащих анти-CD6 моноклональные антитела, для их применения у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и, в частности, у пациентов с ревматоидным артритом. Как ни удивительно, у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и, в частности, у пациентов с ревматоидным артритом, болезнь которых имела затяжной характер и находилась в активной фазе, введение гуманизированного моноклонального антитела T1h в качестве монотерапевтического средства в течение 6 недель вызывало продолжительный терапевтический эффект, длящийся месяцами после прекращения лечения без значительных осложнений. Этот эффект не был связан с истощением CD6+ клеток, поскольку восстановление этой клеточной популяции до нормального объема не препятствует стойкому выздоровлению. Гуманизированное антитело T1h не ингибирует связывание CD6 с ALCAM, эффект, который ранее был заявлен как отвечающий за лечебное действие в этой терапевтической модели, что указывает на возможную связь с альтернативным механизмом. Кроме того, воздействие T1h может сенсибилизировать аутоиммунные клетки к действию противовоспалительных агентов, стероидов или химиотерапевтических препаратов, таких как метотрексат, что может позволить комбинированное применение гуманизированного моноклонального антитела T1h с другими лекарственными препаратами или другими биопрепаратами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение связано с терапевтическими составами моноклональных антител, которые распознают антиген CD6 человека, эффективными для лечения пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Более конкретно, настоящее изобретение включает в себя применение фармацевтических композиций, содержащих гуманизированное моноклональное антитело T1h, которое распознает дифференцировочный антиген CD6 лейкоцитов человека, и их применение для диагностики и лечения ревматоидного артрита.

Объектом настоящего изобретения является терапевтический состав, содержащий гуманизированное моноклональное антитело T1h, которое вызывает продолжительный терапевтический эффект у пациентов с ревматоидным артритом в результате распознавания молекулы CD6. Термин «гуманизированное моноклональное антитело» относится к моноклональному антителу, полученному методами генной инженерии, как описано в патенте № 0699755 (Европейский патентный бюллетень).

1. Создание фармацевтических композиций, содержащих гуманизированное моноклональное антитело T1h к CD6 человека.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит гуманизированное моноклональное антитело T1h, которое распознает дифференцировочный антиген CD6 лейкоцитов человека. Гуманизированное моноклональное антитело T1h к CD6 человека получают из секретирующей гибридомы IOR-T1A с депозитарным № ЕСАСС 96112640, как описано в EP 0807125 A2. Дополнительно, эта композиция содержит в качестве подходящего наполнителя физиологический буферный раствор, аналогичный другим растворам, используемым в составах с моноклональными антителами для внутривенного применения, как описано в EP 0807125. Композицию по настоящему изобретению вводят путем инъекций в диапазоне дозировок от 0,05 до 1 мг/кг веса тела.

2. Характеристика терапевтического эффекта фармацевтических композиций, содержащих гуманизированное моноклональное антитело T1h к CD6 человека.

Пациентам с ревматоидным артритом, который диагностировали по стандартным критериям, и болезнь которых находилась в активной фазе, устойчивой к обычным методам лечения, таким как противовоспалительные препараты, стероиды или химиотерапевтические агенты (например, метотрексату), вводили гуманизированное моноклональное антитело T1h в виде монотерапевтического средства или в сочетании с противовоспалительными препаратами, стероидами, химиотерапевтическими агентами (например, метотрексатом) или моноклональными антителами, специфичными к поверхностным молекулам Т- и В-лимфоцитов (например, CD20), или цитокинами (например, фактором некроза опухолей альфа). Гуманизированное моноклональное антитело T1h можно вводить в виде парентерального раствора в пределах дозировок в соответствии с весом тела пациента, с различной частотой введения, которая может включать в себя ежедневное, еженедельное введение или введение через более продолжительные интервалы времени. Терапевтический эффект оценивали по снижению клинической активности заболевания по стандартным критериям перед лечением, в течение и после окончания лечения.

3. Характеристика эффекта фармацевтических композиций, содержащих гуманизированное моноклональное антитело T1h, на мононуклеарные клетки периферической крови.

Мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с ревматоидным артритом инкубировали с моноклональными антителами к CD3 или CD6, конъюгированными с биотином или флюорофорами (например, с FITC, PE или PE-Cy5). Связывание биотинилированных антител детектировали с помощью стрептавидина, конъюгированного с PE-Cy5.5. На проточном цитофлуориметре FACScan собирали, по меньшей мере, 10000 живых клеток. Мертвые клетки исключали окрашиванием пропидия иодидом.

4. Характеристика способности фармацевтических композиций, содержащих гуманизированное моноклональное антитело T1h, ингибировать связывание CD6 с его лигандом ALCAM

Клеточную линию HEK-293 эпителия человека, трансфицированную молекулой CD6 человека, инкубировали с насыщенной концентрацией моноклонального антитела T1h к CD6 человека или его изотипического контроля, антитела к CD3 человека, в течение 30 минут при 4°С. Клетки промывали и инкубировали с 0,5 мкг/мл слитого белка rhALCAM-Fc (ALCAM является лигандом CD6) в течение 30 минут при 4°С. Затем образцы окрашивали конъюгированными с FITC антителами к IgG человека в течение 30 минут при 4°С. На проточном цитофлуориметре FACScan собирали десять тысяч живых клеток. Мертвые клетки исключали окрашиванием пропидия иодидом.

ПРИМЕРЫ

Гуманизированное моноклональное антитело T1h к CD6 человека получали из гибридомы IOR-T1A с депозитарным № ЕСАСС 96112640, как описано в EP 0807125 A2.

Пример 1: гуманизированное моноклональное антитело T1h к CD6 человека вызывает продолжительный терапевтический эффект у пациентов с ревматоидным артритом.

Терапевтический эффект гуманизированного моноклонального антитела T1h оценивали или определяли у 13 пациентов с ревматоидным артритом. Пациенты получали дозы гуманизированного моноклонального антитела T1h еженедельно в течение 6 недель в количестве 0,2, 0,4, 0,6 и 0,8 мг/кг веса тела. Терапевтический эффект оценивали по снижению клинической активности заболевания, учитывая число затронутых суставов по стандартным критериям, перед лечением, в течение и после окончания лечения. Каждая кривая представляет средние значения улучшения клинического признака или симптома в процентах на группу пациентов в соответствии с вводимой дозировкой.

Пример 2: лечение гуманизированным моноклональным антителом T1h временно снижает число мононуклеарных клеток периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом.

Проводили анализ мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с ревматоидным артритом, которым проводили лечение гуманизированным моноклональным антителом T1h. Определяли экспрессию молекулы CD3, отличительного маркера Т-лимфоцитов, а также экспрессию молекулы CD6. Лечение гуманизированным моноклональным антителом T1h вызывает временное снижение количества CD3+ и CD6+ лимфоцитов. Однако восстановление их числа до нормальных значений не влияет на стойкое клиническое улучшение заболевания. Исследование проводили с помощью проточной цитофлуориметрии, используя FACScan для анализа образцов. Каждая кривая представляет значения для отдельных пациентов в различных временных точках.

Пример 3: гуманизированное моноклональное антитело T1h не ингибирует связывание CD6 с его лигандом ALCAM

Была проведена оценка способности гуманизированного моноклонального антитела T1h ингибировать связывание ALCAM с клеточной линией НЕК-293 эпителия человека, трансфицированной молекулой CD6 человека. (А) Красная гистограмма: распознавание рекомбинантного белка ALCAM человека, связанного с Fc-фрагментом человека (rhALCAM-Fc), предварительно инкубированного с антителами к CD6 (T1h) или к CD3 (контроль); черная гистограмма: связывание rhALCAM-Fc с необработанными клетками; и серая гистограмма: клетки, меченные конъюгированными с FITC антителами к IgG человека. На фигуре отражены средние значения интенсивности флуоресценции. (В) На точечной диаграмме показано двойное окрашивание: окрашивание rhALCAM-Fc и окрашивание антителами к CD6 или CD3.

Краткое описание фигур.

Фигура 1:

На фигуре 1 показан терапевтический эффект гуманизированного моноклонального антитела T1h на пациентов с ревматоидным артритом, который оценивали по снижению процента опухших и болезненных суставов.

Фигура 2:

На фигуре 2 показана количественная оценка числа лимфоцитов CD3+ и CD6+ в мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с ревматоидным артритом.

Фигура 3:

На фигуре 3 продемонстрировано, что гуманизированное моноклональное антитело T1h не ингибирует связывание CD6 с ALCAM-лигандом.