противотуберкулезная композиция и способ ее получения

Формула изобретения

1. Противотуберкулезная композиция в виде наночастиц размером 20-80 нм, включающая соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения (73-94%), мальтозу и противотуберкулезное средство, выбранное из рифамицина, протионамида, рифабутина и рифапентина, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	19-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	67-78
Противотуберкулезное средство	1-10

2. Композиция по п.1, содержащая в качестве соли жирной кислоты олеат натрия.

3. Способ получения противотуберкулезной композиции по п.1, заключающийся в том, что соль жирной кислоты мальтозу и противотуберкулезное средство эмульгируют в воде, добавляют фосфатидилхолин и полученную суспензию подвергают несколькими циклами (1-10) гомогенизации под высоким давлением 800-1500 бар при температуре 40-45°C с последующей лиофилизацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается лекарственной композиции противотуберкулезных препаратов с фосфолипидной транспортной системой и способа ее получения.

В настоящее время противотуберкулезные препараты делят на основные и резервные. К основным препаратам относят изониазид, рифампицин, пиразинамид, стрептомицин и этамбутол.

Резервные препараты включают этионамид, протионамид, антибиотики - циклосерин, капреомицин, канамицин, амикацин, рифабутин, пара-аминосалициловую кислоту (ПАСК); в ту же группу входят фторхинилоны - ломефлоксацин, ципрофлоксацин и офлаксоцин.

Основные препараты, особенно в виде комбинаций, применяют преимущественно при впервые выявленном туберкулезе (обычно назначают комбинацию изониазида и рифампицина с другими основными препаратами). К резервным препаратам прибегают при недостаточной эффективности предшествующей химиотерапии, развитии устойчивости микобактерий, плохой переносимости ранее использовавшихся препаратов.

Основные препараты высокоэффективны, но к ним у микобактерий относительно быстро (через 3-4 месяца) вырабатывается резистентность. Значительно медленнее развивается устойчивость при одновременном применении разных препаратов. Поэтому основным принципом современного лечения туберкулеза является комбинированная двухэтапная химиотерапия.

Вместе с тем необходимо учитывать, что действие противотуберкулезных препаратов сопровождается обычно побочными эффектами, выраженность которых может возрастать при их совместном применении.

Протионамид относится к резервным препаратам. Быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), С_мах составляет 2-3 ч; легко проникает в ткани, частично метаболизируется, выводится с мочой и фекалиями.

Рифабутин (Микобутин) - резервный препарат. Является полусинтетическим антибиотиком, действует на разные виды микобактерий, в т.ч. микобактерии туберкулеза. Практически нерастворим в воде.

Быстро и полностью всасывается из ЖКТ, С_мах составляет 2-4 ч. Т ½ - 35-40 ч. Хорошо проникает в органы и ткани (наивысшая концентрация в легких).

Рифампицин относится к основным препаратам. Является полусинтетическим антибиотиком широкого спектра действия. Активен в отношении микобактерий туберкулеза и лепры, влияет на грамположительные (особенно стафилококки) и грамотрицательные (менингококки, гонококки) бактерии, а также на возбудителей бруцеллеза, легионеллеза, сыпного тифа и трахомы. Эффективен при приеме внутрь, имеет широкий спектр антибактериального действия.

Хорошо и быстро всасывается в ЖКТ, при приеме внутрь С_мах составляет 2,0-2,5 ч. Легко проникает в ткани и жидкости организма и обнаруживается в терапевтических концентрациях в плевральном экссудате, мокроте, содержимом каверн, костной ткани; небольшая концентрация создается в тканях печени и почек; выводится с желчью и мочой.

Рифапентин (Рифапекс) - антибиотик класса рифамицинов, обладающий более высокой ингибирующей активностью в отношении Mycobacterium tuberculosis и имеющий более длительный период полувыведения, по сравнению с рифампицином - препаратом основой терапии туберкулеза (ТБ). Одновременно с Рифапентином назначают резервные препараты - изониазид, этамбутол, пиразинамид. Рифапентин - один из наиболее перспективных препаратов, режим комбинированной терапии на основе рифапентина может представлять собой значительное клиническое преимущество для пациентов с ТБ, восприимчивым к лекарственной терапии, позволяя сократить курс лечения.

Все вышеперечисленные препараты применяются в лекарственных формах для приема внутрь (капсулы, таблетки или драже) и только рифампицин используется также в инъекционной форме.

В основном, все противотуберкулезные препараты являются плохо растворимыми соединениями с ограниченной биодоступностью. Использование этих препаратов длительно в больших дозах, преимущественно в комбинированных схемах лечения из-за лекарственной резистентности и создает предпосылки поиска новых и усовершенствование известных лекарственных препаратов [1, 2].

Известна оригинальная технология, позволяющая получить фосфолипидную транспортную наносистему с размером частиц менее 30 нм, и показана принципиальная возможность получения лекарственных композиций, в которых активная субстанция снабжается транспортной наносистемой на основе растительных фосфолипидов (патент РФ № 2391966). Показано, что в результате такого встраивания изменяется фармакокинетика лекарственных субстанций при введении в организм, увеличивается их биодоступность и терапевтическая эффективность.

Наличие углеводородной области в фосфолипидных структурах, в том числе в мицеллах и липосомах, позволяет гидрофобным соединениям включаться в нее. На этом принципе может быть основано включение в фосфолипидные наночастицы ряда лекарственных субстанций, обладающих амфипатическими, липофильными и гидрофобными свойствами.

Известна стабильная при хранении наносистема с размером частиц от 10 до 30 нм, включающая фосфатидилхолин и мальтозу, предназначенная для включения в фосфолипидные наночастицы лекарственных средств (патент РФ № 2391966).

Благодаря своей химической структуре, вышеуказанная фосфолипидная транспортная наносистема способна служить переносчиком как растворимых, так и нерастворимых в биологических жидкостях (гидрофобных) биоактивных препаратов, но, к сожалению, далеко не все лекарственные субстанции из-за своих физико-химических свойств и химической структуры могут встраиваться в транспортную систему, полученную на основе фосфатидилхолдина.

Целью изобретения является разработка противотуберкулезной композиции, на основе лекарственных субстанций, обладающих плохой растворимостью, низкой биодоступностью, ярко выраженными побочными эффектами, лишенной указанных недостатков.

В соответствии с изобретением описывается противотуберкулезная композиция в вид наночастиц размером 20-80 нм, включающая соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения (73-97%), мальтозу и противотуберкулезное средство, выбранное из рифимицина, протионамида, рифабутина и рифапентина при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфатидилхолин	19-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	67-78
Противотуберкулезое средство	1-10

В качестве солей жирной кислоты предпочтительно используется олеиновая.

Описывается также способ получения противотуберкулезной композиции в виде наночастиц размером 20-80 нм, включающей соль жирной кислоты, фосфатидилхолин растительного происхождения (73-97%), мальтозу и противотуберкулезное средство, выбранное из рифимицина, протионамида, рифабутина и рифапентина, при следующем соотношении компонентов мас.%:

Фосфатидилхолин	19-25
Соль жирной кислоты	1,5-10
Мальтоза	67-78
Противотуберкулезное средство	1-10,

заключающийся в том, что соль жирной кислоты, мальтозу и противотуберкулезное средство эмульгируют в воде, добавляют фосфатидилхолин и полученную суспензию подвергают несколькими циклами (1-10) гомогенизации под высоким давлением 800-1500 бар при температуре 40-45°C с последующей лиофилизацией.

Примеры.

Получение композиций противотуберкулезных препаратов, встроенных в наночастицы из фосфолипида и олеата натрия

1,0 г мальтозы моногидрата растворяют в 150 мл деионизованной воды. К полученному раствору добавляют фосфолипид и размешивают блендером до однородности. Объем раствора доводят водой до 200 мл. При постоянном перемешивании добавляют в сухом виде последовательно 0,02 г субстанции рифампицина и 0,02 г олеата натрия.

Полученную выше грубую эмульсию обрабатывают ультразвуком на ультразвуковой бане в течение 1 мин с последующим нагревом до 42-45°C. После обработки ультразвуком грубую эмульсию гомогенизируют на микрофлюидайзере в течение 5 мин (7 циклов по 0,7 мин) при давлении 1000 атм; температура продукта на выходе поддерживается в пределах 40-45°C. pH наноэмульсии, полученной в результате микрофлюодизации, доводят до значения 7,3-7,4 раствором 1М HCl. Затем продукт фильтруют через предфильтр из стекловолокна и мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат разливают во флаконы по 10 мл. Продукт высушивают методом лиофилизации.

Лиофильно высушенный порошок растворяют (регидратируют) в 10,0 мл дистиллированной воды. Определяют основные физико-химические характеристики препарата: светопропускание при длине волны 660 нм, средний размер частиц по полимодальному распределению, содержание встроенной субстанции и pH.

Аналогичным образом получают композиции на основе протионамида, рифабутина и рифапентина (табл.1).

Таблица 1
Название активной субстанции/производитель	Количество загружено, г	Получено
Активная субстанция	Фосфолипи ды	Олеат натрия	Мальтоза	Встроено активной субстанции, мг	Размер частиц, нм
Рифампицин/Sandoz Pvt.Ltd.	0,02	0,25	0,02	1,0	14,3	21,4
Протионамид/Guangxi Gulin Pharm.Fac.t	0,02	0,25	0,02	1,0	13,4	42,0
Рифабутин/Sandoz Pvt.Ltd.	0,02	0,25	0,02	1,0	19,2	47,1
Рифапентин/Nanjing Foreign Economic&Trade Development CO., LTD.	0,02	0,25	0,02	1,0	19,0	39,1

Полученные по вышеописанной методике препараты водорастворимы, могут применяться перорально, а при соблюдении асептических условий их получения - внутривенно.

Использование олеата натрия не только делает более универсальной для встраивания фосфолипидную систему, но и оказывает дополнительный лечебный противотуберкулезный эффект [3].

Изучена эффективность протионамида и рифампицина, встроенных в липосомы, в условиях монотерапии экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей, вызванного лекарственно-чувствительным штаммом М.tuberculosis Erdman. Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно и подкожно в дозах, сопоставимых с исходными субстанциями протионамида (12,5 мг/кг) или рифампицина (10 мг/кг). Лечение во всех подопытных группах начинали на третий день после заражения. Продолжительность курса лечения - 6 недель.

Выявлены протективные и терапевтические свойства противотуберкулезных препаратов, включенных в фосфолипидные наночастицы, что документировано отсутствием гибели подопытных животных в течение всего периода лечения и ослаблением тяжести течения экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей. При этом средний суммарный показатель пораженности при использовании протионамида, встроенного в наночастицы, уменьшился до 55, 43 и 55, 52 (соответственно при подкожном и внутрижелудочном введении) против 62, 31 - при назначении исходной субстанции. При лечении зараженных мышей рифампицином, встроенным в фосфолипидные наночастицы, средний суммарный показатель пораженности при подкожном пути введения составил 8,6, при внутрижелудочном - 1,60 (для исходной субстанции - 9,06). Установлена зависимость лечебного эффекта от пути введения исследуемых веществ: протионамид, встроенный в наночастицы, наиболее отчетливое действие оказал при подкожном введении, рифампицин - внутрижелудочном. При оптимальном пути введения прирост эффективности лечения составил для протионамида, встроенного в наночастицы, +13,62%, для рифампицина +34,66%.

Проведенные экспериментальные исследования острой токсичности разработанных препаратов на основе транспортной системы - протионамида, рифампицина и рифабутина показали, что эти препараты малотоксичны и не оказывают негативного воздействия на внутренние органы при внутривенном введении.

Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволили отнести:

- препарат рифампицина, встроенного в фосфолипидные наночастицы, при внутривенном введении к IV-V классам малотоксичных - практически нетоксичных веществ;

- препарат протионамида на основе наночастиц при внутривенном введении к V классу практически нетоксичных веществ;

- препарат рифабутина, встроенного в фосфолипидные наночастицы, при внутривенном введении к IV-V классам малотоксичных - практически нетоксичных лкарственных веществ.

Исследования острой токсичности препарата Рифампицин, встроенного в фосфолипидные наночастицы, были проведены в сравнении с препаратом-аналогом «Рифампицин-Ферейн^®, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,15 г» производства ЗАО «Брынцалов-А». Показано, что препарат рифампицина на основе наночастиц, на 25-30% менее токсичен, чем зарегистрированный препарат-аналог (табл.2).

Острая токсичность при внутривенном введении

Таблица 2
N п/п	Наименование препарата	Степень токсичности по Hodge Sterner	ЛД50, мг/кг	ЛД16, мг/кг	ЛД84, мг/кг
Самцы/самки
1.	Рифампицин	IV-V	710±50/710±50	550±30/550±30	900±90/900±90
2.	Рифампицин-Феррейн®		590±40/530±30	430±30/400±20	710±80/680±60
3.	Протионамид	V	1263±55/1198±33	1085±64/996±30	1471±91/1442±38
4.	Рифабутин	IV-V	750±50/710±40	630±60/540±50	910±100/870±70

Было также проведено экспериментальное сравнительное изучение общей токсичности и раздражающих свойств препаратов рифампицина, протионамида и рифабутина, встроенных в фосфолипидные наночастицы, в сравнении с соответствующими субстанциями при внутрижелудочном введении.

Результаты, полученные на основании данных токсикометрии, наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данных некропсии, представлены в табл.3.

Острая токсичность при внутрижелудочном введении

Таблица 3
N п/п	Наименование препарата	Степень токсичности по Hodge Sterner	ЛД50, мг/кг
препарат	субстанция	препарат	субстанция
мыши	крысы
1	Рифампицин	IV-V	3650±80	1700±50	5000±300	2425±175
2	Протионамид	V	5100±150	2850±100	8100±200	6800±150
3	Рифабутин	IV-V	2750±80	1700±100	2500±60	1650±50

Результаты исследований подострой токсичности препарата рифампицин, снабженного транспортной системой, при его внутрижелудочном введении один раз в сутки в течение 21 дня в дозах 20 и 600 мг/кг у крыс обоих полов в сравнении с субстанцией в дозах 10 и 300 мг/кг показали, что оба изучаемых препарата не вызывают каких-либо заметных сдвигов жизненных показателей экспериментальных животных. Патоморфологические исследования также не выявили каких-либо изменений внутренних органов, свидетельствующих о негативном побочном действии.

Исследование подострой токсичности препарата и субстанции при их внутрижелудочном введении один раз в сутки в течение 21 дня в эквитоксических дозах у крыс обоих полов показало, что оба изучаемых препарата не вызывают каких-либо заметных сдвигов биохимических показателей крови. Патоморфологические исследования также не выявили каких-либо изменений внутренних органов, свидетельствующих о негативном побочном действии препаратов. По результатам морфологических и гистологических исследований, внутрижелудочное введение изучаемых препаратов не оказывало раздражающего действия на пищевод, желудок и кишечник.

Результаты исследований подострой токсичности препарата рифабутин, снабженного транспортной системой, при его внутрижелудочном введении один раз в сутки в течение 21 дня в дозах 40 и 1000 мг/кг у крыс обоих полов в сравнении с субстанцией в дозах 20 и 500 мг/кг показали, что оба изучаемых препарата не вызывают каких-либо заметных сдвигов жизненных показателей экспериментальных животных. Патоморфологические исследования также не выявили каких-либо изменений внутренних органов, свидетельствующих о негативном побочном действии.

Выявленные негативные тенденции действия изучаемых препаратов в максимальной дозе (угнетение эритро- и лейкопоэза, увеличение времени свертываемости крови, повышение уровня артериального давления, возбудимости центральной нервной системы) носили обратимый характер.

Величины изменений физиологических показателей, вызванные применением препаратов рифампицин, протионамид и рифабутин, включенных в фосфолипидную транспортную систему, сравнивались с аналогичными изменениями в случае применения соответствующих субстанций. Во всех тестах степень изменения показателей, вызванная обоими препаратами в эквитоксических дозах, была практически одинакова: ни в одном случае достоверного различия между препаратом и субстанцией не отмечалось.

Вместе с тем, выявленная эквивалентность наблюдалась при применении рифампицина, включенного в фосфолипидные наночастицы, в дозах, практически в 2 раза превышающих дозы субстанций.

Полученные результаты позволяют утверждать, что препарат рифампицин на основе фософлипидных частиц почти в 2 раза менее токсичен, чем субстанция.

Препарат протионамид, включенный в фосфолипидные наночастицы, почти в 1,2-1,7 раза (в зависимости от вида животных) менее токсичен, чем субстанция.

Препарат рифабутин на основе фосфолипидных наночастиц в 1,5 раза менее токсичен, чем субстанция.

Полученные результаты позволяют сделать вывод об эффективности и снижении токсичности противотуберкулезных препаратов, встроенных в фосфолипидные наночастицы. Учитывая высокую потребность фтизиатрии в разработке эффективных способов лечения больных туберкулезом, вопрос повышения эффективности и снижения токсичности противотуберкулезных препаратов является особенно актуальным.

ЛИТЕРАТУРА

1. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, изд.15, М., Новая волна, 2006, с.857-871.

2. J.van den Boogaard, G.S.Kibiki, E.R.Kisanga, M.J.Boeree and R.E.Aarnoutse. New Drugs against Tuberculosis: Problems, Progress and Evaluation of Agents in Clinical Development. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - 53(3) - p.849-862.

3. RU № 2391966, C1, 20.06.2010.

4. MINAMI K. Bactericidal action of oleic acid for tubercle bacilli. // J. Bacteriol. - 1957. - Vol.73, № 3. - P.338-352.