способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

Формула изобретения

Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий взаимодействие антигенов с антителами, с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса, отличающийся тем, что в реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи и после внесения испытуемых проб сывороток по 0,10-0,12 мл планшеты инкубируют 1,5-2 ч при 36-37°С, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл общего антивидового иммуноферментного конъюгата, состоящего из меченных ферментом антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота и проводят учет результатов реакции.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к разработке способа выявления антител против вирусов, вызывающих желудочно-кишечные инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Ведущую роль в этиологии диареи у молодняка с/х животных играют рота-, коронавирусы, вирус диареи-болезни слизистых, в меньшей степени другие инфекционные агенты. Указанные болезни широко распространены как в Российской Федерации, так и за рубежом и наносят животноводческим хозяйствам ощутимый экономический ущерб, складывающийся из потерь от гибели, особенно, в раннем возрасте, средств, затрачиваемых на лечение больных и недополучении продукции от переболевших животных. Ежегодно половина потерь молодняка приходится на желудочно-кишечные заболевания в раннем возрасте.

В связи с вышеизложенным проблема диагностики и борьбы с данными инфекциями является актуальной. С большой эффективностью решить проблему диагностики позволяет высокочувствительный метод иммуноферментного анализа.

Известен способ исследования сывороток крови на наличие антител к возбудителю вирусной диареи методом ИФА при эпизоотологическом обследовании животноводческих хозяйств [1].

Известен также способ серодиагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом, для чего в лунки полистиролового планшета вносят специфический антиген по 0,1 мл и сорбируют его на поверхности лунок. На следующем этапе в лунки микропанели вносят контрольные и испытуемые сыворотки по 0,1 мл и инкубируют в течение 1,5-2 ч при 37°C. Несвязавшиеся антитела удаляют многократным промыванием, затем добавляют в каждую лунку антивидовой иммуноферментный конъюгат в объеме 0,1 мл в рабочем разведении. В положительных случаях конъюгат связывается с фиксированными на сенсибилизированной поверхности антителами, образуя комплекс антиген-антитело-конъюгат. Избыток конъюгата удаляют промыванием и вносят во все лунки субстратный индикаторный раствор, который меняет окраску по принципу окислительно-восстановительной реакции, пропорционально количеству конъюгированного с антителами фермента. Количество фермента пропорционально количеству антител, связавшихся с фиксированным на поверхности лунок антигеном [2]. (Прототип).

В задачу наших исследований входило - разработать чувствительный, эффективный способ серодиагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и значительно сократить время на постановку диагноза за счет одновременного исследования сыворотки на наличие антител к этим возбудителям. Литературные данные по использованию ИФА-теста для исследования сывороток крови на наличие антител к рота-, коронавирусам крупного рогатого скота отсутствуют.

Сущность предложенного способа состоит в следующем. В лунки одного планшета с предварительно сорбированными ротавирусным, коронавирусным, диарейным антигенами автоматической пипеткой вносят испытуемую пробу сыворотки крови по 0,10-0,12 мл в лунки с различными антигенами, инкубируют 1,5-2 часа при температуре 37-38°C, планшет отмывают, вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из меченных ферментом антител к глобулинам сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют при тех же условиях, планшет отмывают и после добавления субстратной смеси проводят одновременный учет результатов реакции на рота-, коронавирусный энтерит, вирусную диарею крупного рогатого скота.

Пример 1

На первом этапе реакции во все лунки планшета автоматической пипеткой вносят по 0,1 мл 0,01М фосфатно-буферного раствора. В первые лунки рядов с нанесенными антигенами ротавируса, коронавируса, вируса диареи вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки, пипетируют и по 0,1 мл переносят в следующую лунку и т.д. Для контроля реакции параллельно вносят по 0,1 мл специфических гомологичных сывороток и также титруют их как пробу. Таким же образом вносят и титруют отрицательную сыворотку. Планшет инкубируют в термостате 1,5 часа при 36°C, затем отмывают его от несвязавшихся антител. В отмытые лунки планшета вносят по 0,1 мл антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубируют в термостате при 36°C 1,5 часа и вновь трижды отмывают фосфатно-буферным раствором с твином-20. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Результат реакции учитывают через 30 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета:

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

При исследовании 97 проб сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям хозяйств антитела к ротавирусу выявлены у 54 животных, к коронавирусу антитела обнаружены у 47, а к вирусу диареи - у 21 животного, что составило 55,6%, 48,4%, 21,6% соответственно.

Пример 2.

Реакцию проводят аналогично примеру 1, но сыворотку, коньюгат и субстратную смесь вносят в объеме 0,12 мл и планшеты инкубируют при 37°C в течение 2-х часов. Получены аналогичные результаты, что и в примере 1.

Предложенный способ не имеет отечественных аналогов. Позволяет при проведении диагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом ИФА значительно сократить время на постановку реакции и получить более достоверные результаты при учете реакции, так как исследования на эти инфекции осуществляются одновременно на одном планшете с предварительно сорбированными антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи крупного рогатого скота с использованием общего иммуноферментного конъюгата при одних и тех же условиях. Кроме того, отсутствуют литературные данные об использовании антительной иммуноферментной диагностики при рота-, коронавирусных энтеритах крупного рогатого скота.

Предложенный способ для серологической диагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи КРС методом иммуноферментного анализа испытан комиссионно в сентябре 2009 года и апробирован в нескольких ветеринарных лабораториях с положительным результатом (ФГУ Центральная научно-методическая ветлаборатория 2010 г., ГУ Курская областная ветлаборатория 2010 г., Тверская межобластная ветлаборатория 2011 г.)

На основании полученных в ходе проверки результатов комиссия сделала выводы о том, что способ чувствителен и позволяет выявлять указанные специфические антитела в исследуемых сыворотках в значительно более короткие сроки.

Предложенный способ найдет применение при обследовании крупного рогатого скота в неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям хозяйствах с целью диагностики рота-, коронавирусных энтеритов, вирусной диареи КРС. Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов исследования позволяют в короткие сроки проводить массовые обследования животных с целью определения распространения этих инфекций. Сокращение времени на диагностику весьма существенно для неблагополучных по этим инфекциям хозяйствам, поскольку ускоренная постановка диагноза позволяет приступить к своевременному лечению и проведению профилактических мероприятий и, тем самым, оздоровить и сохранить поголовье скота.

Данную тест-систему можно использовать при оценке иммунного статуса поголовья, для контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин.

Источники информации

1. Ветеринария, 4, 2004, с.20

2. Ветеринария, 5, 2005, с.17-20.