способ получения липидов
Классы МПК: | C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них C12P7/64 жиры; жирные масла; воски эфирного типа; высшие жирные кислоты, те содержащие не менее семи атомов углерода в непрерывной цепи, связанной с карбоксильной группой; окисленные масла или жиры C12R1/645 грибы |
Автор(ы): | Сергеева Яна Эдуардовна (RU), Ивашечкин Алексей Александрович (RU), Алехин Александр Иванович (RU), Андриянова Диана Алексеевна (RU), Мысякина Ирина Сергеевна (RU), Гальченко Валерий Федорович (RU), Галанина Людмила Алексеевна (RU), Феофилова Елена Петровна (RU), Лунин Валерий Васильевич (RU) |
Патентообладатель(и): | ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2011-02-11 публикация патента:
27.11.2012 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Выращивают споры мицелиальных грибов рода Cunninghamella на сусло-агаре при температуре 27-28°С в течение 5-6 суток. В слой сусло-агара дополнительно добавляют 0,2% трегалозы. Смывают споры и выдерживают 20-30 минут в стерильной водопроводной воде при слабом встряхивании. Смытые споры в качестве посевного материала ферментируют в течение 90-96 часов при температуре 29±0,5°С на питательной среде, содержащей глюкозу, нитрат аммония, сульфат магния семиводный, дигидрофосфат калия, дрожжевой экстракт и 0,1-0,2% D-глюкозамина или 0,11-0,15% N-ацетил-В-глюкозамина. Отделяют полученную биомассу и лиофилизируют. Извлекают липиды встряхиванием на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1. Предлагаемый способ позволяет повысить выход липидов до 54%. 8 пр.
Формула изобретения
Способ получения липидов, включающий выращивание спор мицелиальных грибов рода Cunninghamella на сусло-агаре при температуре 27-28°С, смыв спор и выдержку 20-30 мин при слабом встряхивании, использование смытых спор как посевного материала, который ферментируют на питательной среде, содержащей глюкозу, нитрат аммония, сульфат магния семиводный, дигидрофосфат калия, дрожжевой экстракт, с последующим отделением биомассы и извлечением липидов, отличающийся тем, что при выращивании спор в слой сусло-агара добавляют 0,2% трегалозы, выращивание ведут в течение 5-6 суток, собранные споры выдерживают в стерильной водопроводной воде, а процесс ферментации осуществляют в течение 90-96 ч при температуре 29±0,5°С, причем в питательную среду вносят 0,1-0,2% D-глюкозамина или 0,11-0,15% N-ацетил-D-глюкозамина, а полученную биомассу после отделения лиофилизируют, и извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения липидной фракции из биомассы мицелиальных грибов для использования ее в дальнейшем преимущественно в качестве биодизельного топлива при производстве лекарственных препаратов, в пищевой промышленности и т.д.
В последнее десятилетие в качестве продуцентов липидов для биодизеля используют автотрофные и гетеротрофные водоросли, бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы
Лучше всего требованиям современных биотехнологических производств липидов соответствуют мицелиальные грибы: эти организмы обладают одной из наибольших скоростей накопления биомассы.
- Процесс культивирования грибов лучше отработан с биотехнологической точки зрения, нежели выращивание водорослей, и способен к большему масштабированию, чем выращивание растений.
- Выход продукта не зависит от сезонных колебаний температуры и величины посевных площадей, возможно круглогодичное получение продукта.
- Имеется возможность варьирования ацильных цепей липидов при помощи изменения параметров среды и других факторов.
- Наиболее олеогенные виды, в частности мукоровые грибы, не образуют в составе липидов полиненасыщенные жирные кислоты, и в данном случае преобладающими жирными кислотами являются пальмитиновая, линолевая и олеиновая.
- Остающиеся после извлечения липидов из мицелиальных грибов клеточные стенки содержат полисахариды, в частности хитин, хитозан, гетерополисахариды.
Известен способ получения липидов с использованием мицелиальных (мукоровых) грибов (Авторское свидетельство 1613492, МПК C12P 7/64, публ. 1990 г.), включающий глубинное культивирование микроскопического гриба Cunninghamella japonica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сточные воды производства оливкового масла, после выращивания спор гриба на сусло-агаре в течение 7 суток.
Недостатком этого способа является то, что получают плохо очищенные липиды, которые нельзя использовать как биодизельное топливо и при получении лекарственных препаратов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения липидов (Прикладная биохимия и микробиология. Сергеева Я.Э. и др. Липиды мицелиальных грибов как основа получения биодизельного топлива, 2008, Т. 44, № 5, с.576-586), включающий использование в качестве посевного материала 7-суточные споры штаммов мукоровых грибов рода Cunninghamella, выращенные на сусло-агаре, культивирование на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 5% глюкозы, в качестве источника азота NH4NO3 - 0,12%, дрожжевой экстракт - 0,1%, КH2PO4 - 0,1%, MgSO 4×7H2O - 0,025%.
К навеске влажной биомассы гриба (влагосодержание 80-85%) добавляли смесь растворителей хлороформ-метанол и гомогенизировали в течение 2-5 минут при комнатной температуре. Далее полученный гомогенат перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут, отфильтровывали и твердый остаток подвергали повторной экстракции дважды. К объединенному фильтрату добавляли воду. Водно-метанольную и хлороформенную фазу разделяли путем отстаивания в делительной воронке. Хлороформенный слой, содержащий липиды, сушили над слоем безводного сульфата натрия, концентрировали на роторном испарителе и доводили до постоянного веса.
Недостатками данного способа является нестабильность ферментации, недостаточно высокая всхожесть спор продуцента, отсутствие синхронности в их прорастании, что отрицательно влияет на выход липидов. Кроме того, извлечение липидов из влажной биомассы уменьшает их выход.
Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, увеличение выхода и получение более очищенных липидов, уменьшение их стоимости, возможность вторичного использования отходов этого производства за счет оптимизации процесса путем синхронизации и увеличения скорости прорастания спор посевного материала, стабильности ферментации и сокращения их срока.
Поставленная задача достигается тем, что в способе получения липидов, включающем выращивание спор мицелиальных грибов рода Cunninghamella на сусло-агаре при температуре 27-28°С, смыв спор и выдержку 20-30 минут при слабом встряхивании, использование смытых спор как посевного материала, который ферментируют на питательной среде, содержащей глюкозу, нитрат аммония, сульфат магния семиводный, дигидрофосфат калия, дрожжевой экстракт, с последующим отделением биомассы и извлечением липидов предложено при выращивании спор в слой сусло-агара добавлять 0,2% трегалозы. При этом выращивание ведут в течение 5-6 суток, а собранные споры выдерживают в стерильной водопроводной воде. Процесс ферментации осуществляют в течение 90-96 часов при температуре 29±0,5°С, причем в питательную среду вносят 0,1-0,2% D-глюкозамина или 0,11-0,15% N-ацетил-D-глюкозамина, а полученную биомассу после отделения лиофилизируют. Извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1.
Способ осуществляется следующим образом.
При получении липидов можно использовать штаммы грибов семейства Cunninghamellaceae: C.japonica BKM F-1204 (-), C.echinulata BKM F-470 (-), BKM F-626 (-), ВКМ F-657 (-), C.homothallica BKM F-930. Штаммы С.japonica выращивают в пробирках на скошенном слое сусло-агара с добавлением 0,2% трегалозы в течение 5-6 суток при температуре 27-28°С, смывают споры стерильной водопроводной водой и получают посевной материал. Такие споры содержат наибольшее количество липидов (до 6%), и выросший из них мицелий образует наибольшее количество липидов - около 50%. Полученные споры инкубируют в течение 20-30 минут на качалке. Такая предварительная инкубация спорового материала обусловлена тем, что на голодной среде, в данном случае воде, происходит более быстрое прорастание спор и образование ростовых трубок, что способствует сокращению первой ростовой фазы и ускоряет дальнейшее образование липидов.
Далее для ферментации посевные споры в количестве 106 клеток в 1 мл среды вносят в питательную среду. Среда содержит в мас.%: глюкозу - 5, нитрат аммония - 0,12, сульфат магния семиводный - 0,025, дигидрофосфат калия - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,1, D-глюкозамин - 0,1-0,2% или N-ацетил-D-глюкозамин - 0,11-0,15%. Процесс ферментации ведут в течение 90-96 часов. Температуру в термостате поддерживают на уровне 29±0,5°С.
Полученную биомассу после отделения лиофилизируют в лиофильной сушке по стандартной методике и, при необходимости, измельчают. Извлечение липидов проводят путем встряхивания на качалке (или мешалке) лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1, полученного опытным путем. Выход липидов составляет до 54%.
Примеры конкретного выполнения способа получения липидов.
Пример 1.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что штамм Cunninghamella japonica BKM F-1204(-) выращивают для получения посевного материала в пробирках на скошенном слое сусло-агара с добавлением 0,2% трегалозы в течение 5 суток при температуре 27°С. Споры смывают с агаризованной среды водопроводной стерильной водой и инкубируют в течение 30 минут на качалке при той же температуре. Далее посевные споры вносят в ферментационную среду предлагаемого состава с добавлением 0,1% D-глюкозамина, ферментацию ведут в течение 96 часов. Полученную биомассу лиофилизируют. Извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1. Выход липидов составил 53,17%.
Пример 2.
То же, что в примере 1, но используют 0,2% D-глюкозамина. Выход липидов составляет 55,20%.
Пример 3.
То же, что в примере 1, но вместо 0,1% D-глюкозамина вносили 0,11% N-ацетил-D-глюкозамина. Выход липидов составил 52,80%.
Пример 4.
То же, что в примере 3, но используют 0,15% N-ацетил-D-глюкозамина. Выход липидов составил 54,60%.
Пример 5. То же, что в примере 1, но используют штамм С.echinulata ВКМ F-470(-). Выход липидов составляет 49,00%.
Пример 6.
То же, что в примере 1, но используют штамм С.echinulata BKM F-626 (-). Выход липидов составляет 48,50%.
Пример 7.
То же, что в примере 1, но используют штамм С.echinulata BKM F-657(-). Выход липидов составляет 49,80%.
Пример 8.
То же, что в примере 1, но используют штамм C.homothallica BKM F-930. Выход липидов составляет 47,00%.
Предлагаемый способ позволяет повысить выход липидов, достичь их более высокой очистки и понизить их стоимость за счет активации и синхронизации прорастания посевного материала, сокращения и стандартизации процесса ферментации.
Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
Класс C12P7/64 жиры; жирные масла; воски эфирного типа; высшие жирные кислоты, те содержащие не менее семи атомов углерода в непрерывной цепи, связанной с карбоксильной группой; окисленные масла или жиры