сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство к лигандам, и его применение

Классы МПК:C07K14/47 из млекопитающих
C07K17/02 пептиды, иммобилизованные на или в органическом носителе
C07K19/00 Гибридные пептиды
C12N1/15 модифицированные введением чужеродного генетического материала
C12N1/19 модифицированные введением чужеродного генетического материала
C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала
C12N5/10 клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом
C12N15/09 метод рекомбинантных ДНК
G01N33/15 медицинских препаратов
G01N33/50 химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания
C07K14/705 рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы
Автор(ы):
Патентообладатель(и):Фармаком ЛЛС (JP),
НИППОН ЧЕМИФАР КО., ЛТД. (JP)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-05-22
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к исследованию рецептору, сопряженному с G-белком, и может быть использовано в медицине. Получен белковый комплекс, обладающий сродством GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L к лиганду, включающий GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L и полипептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1. Связывание указанного рецептора, сопряженного с G-белком, с полипептидом изменяет сродство к лиганду рецептора. Также предложены методы скрининга агонистов или антагонистов рецептора, сопряженного с G-белком, с использованием трансформанта, в котором экспрессируется указанный измененный рецептор, сопряженный с G-белком. Заявленное изобретение обеспечивает проведение анализа функции многих предполагаемых рецепторов, сопряженных с G-белком, структура которых еще не известна. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 4 пр. сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035

Рисунки к патенту РФ 2468035

сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035

Область техники

Настоящее изобретение относится к рецепторам, сопряженным с G-белком (GPCRs), которые характеризуются измененным сродством к лигандам, и применению указанных рецепторов. В частности, настоящее изобретение относится к GPCRs, сродство к лигандам которых изменено в результате образования комплекса с определенным белком, и их применению.

Уровень техники

Многие реакции в живых организмах вызваны проникновением в клетку внеклеточной информации и распространению информации по клетке. Мембранные рецепторы служат медиаторами, через которые внеклеточная информация передается в клетки. Хорошо известно, что GPCRs, имеющие 7 трансмембранных доменов, являются одним из основных типов связанных с мембраной рецепторов.

Когда лиганд (например, аминокислота, пептид или амид) связывается с GPCR, GPCR передает информацию в клетку через тримерный G-белок. G-белки, сопряженные с GPCRs, подразделяют на Gs, Gi, Gq и другие, которые активируют/инактивируют различные эффекторные пути (например, сигнальный путь цАМФ, сигнальный путь цГМФ и сигнальный путь фосфолипазы С), соответственно. Например, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргический рецептор главным образом сопряжен с Gq-белком для активации системы фосфолипазы С, что приводит к образованию диацилглицерола и инозитолтрифосфата, таким образом повышая внутриклеточную концентрацию Са2+. сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 2-адренергический рецептор главным образом сопряжен с Gi-белком для подавления аденилатциклазной системы, что, таким образом, снижает уровень цАМФ. Кроме того, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -адренергический рецептор главным образом сопряжен с Gs-белком для активации аденилатциклазной системы, что, таким образом, приводит к повышению уровня цАМФ.

GPCRs повсеместно встречаются и функционируют в нашем организме. Например, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргические рецепторы представлены в периферических кровеносных сосудах, предстательной железе и обеспечивают сокращения. Также известно, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргические рецепторы функционируют в центральной нервной системе, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -адренергические рецепторы в сердце и жировой ткани играют важную роль для регуляции частоты сердечных сокращений и расщепления жиров.

Известно, что GPCRs и зависимые от них системы передачи сигналов не только контролируют физиологический гомеостаз в нашем теле, но и определяют патофизиологическое состояние при различных заболеваниях. Поэтому для того, чтобы лечить такие заболевания, очень важно определить конкретные GPCRs, связанные с определенными заболеваниями, и затем разработать специфичные в отношении GPCRs лекарственные средства (например, агонисты или антагонисты).

Не патентная литература 1

Muramatsu, I. et al. Br. J. Pharmacol., 99: 197 (1990)

He патентная литература 2

Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 (1995)

He патентная литература 3

Morishima, S. et al. J. Urol. 177: 377-381 (2007)

He патентная литература 4

Molenaar, P. and Parsonage, W.A.Trends Pharmacol. Sci., 26: 368-375 (2005)

Не патентная литература 5

Samaha, A.N. et al., J. Neurosci. 27: 2979-2986 (2007)

Краткое описание изобретения

В изучении GPCR произошел значительный прогресс, в результате чего было обнаружено большое количество GPCR. Однако все еще существуют несколько предполагаемых GPCRs, для которых определены фенотипы, но структура которых пока неизвестна. Например, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренергические рецепторы разделяют на три подтипа (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1B и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1D) на основе кодирующих их различных генов. Однако было выдвинуто предположение о существовании в дополнение к классическим сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренергическим рецепторам, дополнительного подтипа (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L) рецепторов, отличающихся по фармакологическому профилю (фенотипу) от классических подтипов. Рецепторы подтипа сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L обладают существенно сниженным сродством к типичному блокатору сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1- рецепторов (празозину) по сравнению с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1B- и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1D-подтипами. сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип обнаруживается только в интактных полосках или сегментах нативных тканей, но не обнаруживается в гомогенатах тканей (см. Не патентная литература 1-3). Дополнительно, известно, что подтипы сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1 адреналинового рецептора (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1H и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L), отличающиеся по фенотипу, кодированы одними и теми же генами (см. Не патентная литература 4). Для этого подтипа известен только фенотип, но не его сущность. Подобное можно также отметить для допаминовых рецепторов, мускариновых рецепторов или эндотелиновых рецепторов (см. Не патентная литература 5 и т.п.). Однако механизмы формирование разных фенотипов продуктами одного и того же гена до сих пор не известны.

Настоящее изобретение было создано с учетом этой проблемы, и целью настоящего изобретения является обеспечить способ анализа функции рецептора, сопряженного с G-белком, структура которого не известна.

Белковый комплекс согласно настоящему изобретению характеризуется связыванием GPCR с: (1) полипептидом, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептидом (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептидом (i), кодируемым полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептидом (i), кодируемым полинуклеотидом, которой способен гибридизоваться в жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептидом (i), кодируемым полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.

Способ получения белкового комплекса согласно настоящему изобретению характеризуется наличием стадии осуществления совместного присутствия GPCR и белка на липидной мембране, при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который способен гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.

Благодаря указанным признакам, настоящее изобретение может изменять сродство GPCR к лиганду. Другими словами, способ получения белкового комплекса согласно настоящему изобретению также может представлять собой способ изменения сродства GPCR к его лигандам.

Липидная мембрана согласно настоящему изобретению характеризуется содержанием белкового комплекса. Способ получения липидной мембраны согласно настоящему изобретению характеризуется стадией осуществления совместного присутствия GPCR и белка на липидной мембране, при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.

Дополнительно, трансформант (трансформированная клетка или организм) согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что он содержит белковый комплекс. Способ получения трансформанта согласно настоящему изобретению характеризуется стадией экспрессии указанного белкового комплекса и предпочтительно включает стадию введения в клетку гена, кодирующего GPCR, и гена, кодирующего полипептид.

Благодаря указанным признакам, настоящее изобретение облегчает анализ функции GPCR с измененным сродством к лиганду.

Способ скрининга агонистов или антагонистов GPCR с измененным сродством к лиганду согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадий: [1] получения белкового комплекса посредством обеспечения совместного присутствия GPCR и полипептида на липидной мембране; и [11] инкубирования указанного белкового комплекса совместно с исследуемым веществом (потенциальным агонистом или антагонистом), при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.

Способ получения трансформанта, экспрессирующего GPCR с измененным сродством к лиганду, согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадии ингибирования экспрессии полипептида в клетке, в которой имеет место экспрессия GPCR, при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным при жестких условиях гибридизации гибридизоваться с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.

Благодаря указанным признакам, настоящее изобретение облегчает анализ функции GPCR с измененным сродством к лиганду и обеспечивает возможность изменения сродства GPCR к лиганду. Таким образом, настоящее изобретение также может рассматриваться как способ изменения сродства GPCR к его лигандам.

Способ получения согласно настоящему изобретению предпочтительно является таким, что полипептид представляет собой эндогенный белок, и стадию подавления экспрессии полипептида осуществляют способом РНК интерференции. Также, указанная клетка может представлять собой трансформант, экспрессирующий экзогенный белок GPCR.

Способ скрининга агонистов или антагонистов GPCR с измененным сродством к лиганду согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадий: [1] подавления экспрессии полипептида в клетке, в которой экспрессируется GPCR; и [11] инкубирования клетки совместно с исследуемым веществом (потенциальным агонистом или антагонистом), при этом полипептид представляет собой (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.

Предпочтительно, способ скрининга согласно настоящему изобретению дополнительно включает стадию измерения внутриклеточной концентрации Са 2+ или стадию измерения метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата.

Согласно настоящему изобретению GPCR, который входит в состав белкового комплекса, предпочтительно представляет собой адренергический рецептор, допаминовый рецептор, мускариновый рецептор или рецептор эндотелина, а указанный адренергический рецептор может представлять собой сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -рецептор или сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -рецептор. Дополнительно, указанный допаминовый рецептор предпочтительно являлся D2 рецептором. Предпочтительно, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -рецептор представляет собой сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-рецептор, и более предпочтительно, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-рецептор представляет собой сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтип указанного рецептора. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, белковый комплекс согласно настоящему изобретению представляет собой адренергический рецептор сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа или сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа.

Для более полного понимания сущности и преимуществ настоящего изобретения следует ссылаться на следующее ниже подробное описание изобретения совместно с прилагаемыми рисунками.

Краткое описание фигур

Фигура 1

На фигуре 1 показаны кривые насыщения связывания [3Н]-силодозина в клетках сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L (эксперимент по связыванию целыми клетками).

Фигура 2

На фигуре 2(а) приведены кривые конкурентного связывания празозина в клетках сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A (эксперимент по связыванию целыми клетками). На фигуре 2(b) показаны кривые конкурентного связывания празозина в гомогенатах клеток сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A. Пунктирная линия с закрашенными квадратами: кривая конкурентного связывания празозина в целых клетках сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L была описана для сравнения с кривыми в гомогенатах.

Описания вариантов реализации изобретения

1. Белковый комплекс.

Настоящее изобретение обеспечивает белковый комплекс GPCR и определенного полипептида. В описании настоящего изобретения термин «комплекс» означает находящуюся в виде единого целого комбинацию множества веществ и «образование комплекса» и «объединение» взаимозаменяемы. Следует отметить, что необходимо только, чтобы множество веществ, образующих комплекс, взаимодействовали друг с другом в непосредственной близости, при этом указанные вещества могут связываться или не связываться друг с другом. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения белковый комплекс согласно настоящему изобретению представляет собой GPCR и определенный полипептид, которые взаимодействуют друг с другом в непосредственной близости, и в итоге указанный белковый комплекс функционирует как GPCR с измененным сродством к лиганду.

Данное описание описывает настоящее изобретение на примере адренэргического рецептора (в частности сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа) в качестве GPCR, сродство к лиганду которого изменено посредством взаимодействия с определенным полипептидом. Однако специалисту в данной области, который прочел настоящее описание, будет ясно, что GPCR, согласно настоящему изобретению, не ограничивается адренергическим рецептором. Кроме того, специалист в данной области сможет с легкостью получить информацию о последовательности GPCR, согласно настоящему изобретению.

Хорошо известно, что адренергические рецепторы опосредуют работу автономной нервной системы (симпатической нервной системы). Связывание адреналина, норадреналина и т.п. с адренергическим рецептором вызывает различные физиологические ответы, например сокращение гладкой мускулатуры сосудов, повышение кровяного давления и частоты сердечных сокращений, расширение зрачка и повышение уровня глюкозы в крови.

Прогресс в исследовании и развитие новых вариантов лекарственных средств позволили четко понять, что существуют различные типы адренергических рецепторов. Ранее, адренергические рецепторы подразделяли на сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -рецепторы и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -рецепторы согласно их различиям в реакционной способности к изопротеренолу и фентоламину, и дополнительно классифицировали по фармакологическим подгруппам (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-рецептор, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 2-рецептор и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -рецептор). Известно, что эти рецепторы по-разному распределены в тканях и выполняют различные функции. Например, известно, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргические рецепторы выполняют функцию важных медиаторов, которые вызывают сокращения гладкой мускулатуры сосудов, предстательной железы и т.п., и также известно, что они участвуют в управлении сознанием и эмоциями в центральной нервной системе.

В настоящий момент, когда закончено картирование генома человека, можно определить структуру и функции многих белков на генетическом уровне. В случае сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргических рецепторов выделили три подтипа (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1B и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1D), на основании различных генов, которые их кодируют. Известно, что эти классические подтипы хорошо совпадают с фармакологическими подтипами. В этом отношении можно считать, что один подтип рецепторов в основном происходит от одного отдельного гена.

Однако давно показано, что в некоторых тканях нашего организма встречается и функционирует уникальный сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргический рецептор. Из-за его низкого сродства к типичному блокатору сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1 (празозину), этот уникальный подтип был назван «сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипом», несмотря на то, что соответствующий ген пока не был клонирован.

В таблице 1 приведена классификация и избирательность к лекарственным средствам сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргических рецепторов.

[Таблица 1]
Классификация и селективность лекарственных средств в отношении сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренэргических рецепторов
подтип сродство (pKb)
Силодозин1,3,4,5 Тамсулозин1,3,4 Празозин1,2,3,4,5 RS-170532,4 BMY 73784,5
сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 10.7-9.510.4-9.9 10.6-9.3 9.1-8.46.9-5.6
сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L 10.7-9.510.4-9.9 8.3-7.6 6.36.9-5.6
сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 8.19.3 10.6-10.17.8 7.4
сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1D 8.69.9 10.1-9.97.8 9.1

Данные для соединений, приведенных в таблице 1, основаны на приведенных ниже публикациях:

1. Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 (1995)

2. Ford, АР. et al. Mol. Pharmacol., 49: 209 (1996)

3. Murata, S. et al. J. Urol., 164: 578 (2000)

4. Hiraizumi-Hiraoka, Y. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 310: 995 (2004)

5. Murata, S. et al. Br. J. Pharmacol., 127: 19 (1999)

В биологических исследованиях было показано, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип является функциональным рецептором в нижних отделах мочеполовой системы человека и других млекопитающих. Также обнаружили сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип в интактных сегментах нативных тканей (например, предстательная железа человека). Однако сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип не обнаруживали с помощью традиционных экспериментов связывания, проводившихся на гомогенизированных тканях. Тот факт, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип не определяли в гомогенизированной ткани, означает, что очень трудно выделить сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип из ткани. Если неизвестна природа сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа, то будет очень трудно исследовать функцию сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-адренэргического рецептора, в частности, для разработки сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-селективных лекарственных средств (например, агонистов или антагонистов).

Авторы настоящего изобретения предположили, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип, сущность которого неизвестна, образуется при связывании некой вспомогательной молекулы с уже известным подтипом (возможно, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипом). То есть, авторы предположили, что взаимодействие между молекулой рецептора определенного подтипа и ее вспомогательной молекулой, которые совместно составляют сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип, разрушается при гомогенизации ткани, и в результате сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип меняет свои свойства на свойства сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа. В результате, было обнаружено, что при гомогенизации ткани фармакологический профиль сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа превратился в профиль сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа. Более того, в результате кропотливых исследований авторы настоящего изобретения подтвердили, что определенный белок связывается с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипом, и совместная экспрессия указанного белка с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипом в культуре клеток приводит к экспрессии фенотипа сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа. То есть, было обнаружено, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип состоит из белкового комплекса, был определен белок, входящий в состав данного комплекса, и таким образом осуществлено настоящее изобретение.

В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает комплекс, который образует сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора. То есть, белковый комплекс согласно данному варианту реализации настоящего изобретения представляет собой сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора. Данный вариант реализации изобретения позволяет обеспечить лечение любого заболевания, связанного с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипом, сущность которого была определена.

Полипептид, составляющий белковый комплекс согласно настоящему изобретению, известен как CRELD (обогащенный цистеином с EGF-подобными доменами) 1а белок, миссенс мутация которого считается связанной с дефектом атриовентрикулярной перегородки (Gene 293: 47-57 (2002), Am. J. Hum. Genet. 72: 1047-1052 (2003)). Информация о последовательности полипептида может быть получена по номеру доступа NCBI: NM_015513 и в настоящем описании, представлена через SEQ ID NO:1 (последовательность аминокислот) и SEQ ID NO:2 (последовательность нуклеотидов). То есть, полипептид, составляющий белковый комплекс согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, может представлять собой полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1, или может являться полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

Полипептид, который входит в состав белкового комплекса согласно данному варианту реализации настоящего изобретения не ограничивается полипептидом, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1, и может представлять собой мутантный полипептид, сохраняющий активность исходного полипептида. Примером такого мутантного полипептида является полипептид, который: (i) имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) обладает способностью образовывать комплекс с GPCR и изменять сродство указанного GPCR к лиганду.

С помощью общих методических принципов, известных в данной области, специалист может легко получить мутантный полипептид, из аминокислотной последовательности конкретного полипептида посредстовм делеции, вставки, замены или добавления одной или нескольких аминокислот. Кроме того, на основе информации, содержащейся в настоящем описании изобретения и общих методических принципов, специалист в данной области может легко определить, сохраняет ли мутантный полипептид ту же активность, что и первоначальный полипептид.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий полипептид, входящий в состав белкового комплекса согласно настоящему изобретению, не ограничивается полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и также может представлять собой мутантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, сохраняющий способность изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс. Примером такого мутантного полинуклеотида является, но не ограничен им: (1) полинуклеотид, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, (2) полинуклеотид, который способен гибридизоваться в жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, или (3) полинуклеотид, последовательность которого на 70% или более, предпочтительно 80% или более, или более предпочтительно 85% или более, гомологична полинуклеотиду, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

С помощью общих методических подходов, известных в данной области, специалист может легко получить: мутантный полипептид из аминокислотной последовательности конкретного полинуклеотида посредством делеции, вставки, замены или добавления одной или нескольких аминокислот; мутантный полинуклеотид, способный при жестких условиях гибридизации гибридизоваться с определенным полинуклеотидом; или мутантный полинуклеотид, последовательность которого на 70% или более идентична последовательности определенного полинуклеотида. Далее, на основе описания настоящего изобретения и общих методических принципов специалист в данной области может легко определить, сохраняет ли полипептид, кодируемый указанным мутантным полинуклеотидом, ту же активность, что и полипептид, кодируемый исходным полинуклеотидом.

Применительно к настоящему описанию, термин «жесткие условия гибридизации» означает инкубацию в течение ночи при 42°С в растворе для гибридизиации (содержащем 50% формамид, 5 х SSC [150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриевого цитрата], 50 мМ фосфат натрия (рН=7.6), 5 х раствор Денгардса, 10% декстран сульфат и 20 мкг/мл денатурированной спермы лосося), с последующей промывкой фильтра при 65°С в 0.1 х SSC.

Необходимо только провести процедуру специфичной гибридизации по способу, хорошо известному в данной области (например, по способу, описанному в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., J. Sambrook and D.W.Russell ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001)", который включен посредством ссылки на настоящее описание).

Настоящее изобретение описано выше с использованием адренэргических рецепторов в качестве примера GPCR, составляющих белковый комплекс согласно настоящему изобретению. Однако достаточно, чтобы белковый комплекс согласно настоящему изобретению представлял собой комплекс GPCR и (1) полипептида, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептида (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептида (i), кодируемого полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептида (i), кодируемого полинуклеотидом, который способен в жестких условиях гибридизации гибридизоваться с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2 и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептида (i), кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого на 70% или более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс. То есть, GPCR, входящий в состав указанного белкового комплекса, не ограничен адренергическим рецептором, но также может представлять собой допаминовый рецептор, мускариновый рецептор или эндотелиновый рецептор. Кроме того, специалист в данной области может легко получить, из общедоступных баз данных, информацию о последовательности GPCR, к которому относится настоящее изобретение, и поэтому может легко получить желаемый белковый комплекс, на основе информации из описания настоящего изобретения и известных общих методических принципов.

2. Липидная мембрана, содержащая белковый комплекс.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения белкового комплекса GPCR и определенного полипептида. Способ получения белкового комплекса GPCR и определенного полипептида согласно настоящему изобретению характеризуется стадией осуществления совместного присутствия GPCR и определенного белка на липидной мембране. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает липидную мембрану, содержащую белковый комплекс, и способ ее получения.

Липидная мембрана согласно настоящему изобретению характеризуется содержанием белкового комплекса, описанного выше. Липидная мембрана согласно настоящему изобретению может представлять собой природную липидную мембрану или искусственной липидной мембраной. В тех случаях, когда мембрана представляет собой природную липидную мембрану, подразумевается, что мембрана является биологической мембраной. В тех случаях, когда мембрана представляет собой искусственную липидную мембрану, подразумевается, что мембрана представляет собой плоскую липидную мембрану или липосому.

В одном аспекте настоящего изобретения, липидная мембрана может представлять собой биологическую мембрану трансформанта, в который включен полинуклеотид, кодирующий полипептид, входящий в состав белкового комплекса согласно настоящему изобретению. Такой трансформант можно получить посредством введения в живой организм вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, таким образом, что полипептид экспрессируется в виде биологической мембраны. Следует отметить, что живой организм, который используют в качестве трансформанта, может представлять собой прокариотный или эукариотный организм.

В другом аспекте настоящего изобретения, липидная мембрана может представлять собой липидный бислой, содержащий полипептид, который входит в состав белкового комплекса согласно настоящему изобретению. Липидный бислой представляет собой мембранную структуру, состоящую из двух слоев полярных липидов (в частности, фосфолипидов). Структура липидного бислоя стабилизирована в виде двумерной структуры, если она принимает вид сферы, но она может являться плоской структурой, если ее концы изолированы от молекул воды. При использовании в настоящем описании термином «липосома» обозначается сферический липидный бислой, созданный искусственно, и термин «липидная плоская мембрана» означает плоский липидный бислой, созданный искусственно. В данной области искусственный липидный бислой используют при измерениях активности мембранных белков in vitro (например, белков каналов). Т.о., специалист в данной области может легко получить липидную плоскую мембрану и сделать так, чтобы указанная плоская липидная мембрана удерживала интересующий белок (полипептид). Дополнительно, липосома представляет собой искусственную липидную мембрану, которую также обозначают термином «везикула», и ее можно получить посредством взбивания суспензии липидов (например, фосфолипидов) и последующей обработки их ультразвуком. В этой области, широко известны работы с липосомами в качестве моделей клеточных мембран и способов доставки лекарств (DDS). Таким образом, специалист в данной области может легко получить липосому и заставить липосому удерживать интересующий белок (полипептид).

В одном варианте реализации, настоящее изобретение обеспечивает липидную мембрану, содержащую сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора. Как описано выше, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора представляет собой белковый комплекс молекулы сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа и белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 . Как сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтип адренэргического рецептора, так и CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 оба являются мембранно связанными белками и, как описано выше, их взаимодействие друг с другом нарушается при гомогенизации (разрушении мембраны). То есть, их взаимодействие друг с другом выражается в размещении и сохранении их обоих на липидной мембране.

В тех случаях, когда липидная мембрана согласно данному варианту реализации настоящего изобретения является биологической мембраной, способ получения липидной мембраны согласно такому варианту реализации может также представлять собой способ получения трансформанта, экспрессирющего сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора, и который необходимо только дополнить стадией совместной экспрессии белка сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-адренэргического рецептора и белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 . Информация о последовательности сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа адренэргического рецептора доступна через номер доступа NCBI - No. U03866 или NM_000680 и, в настоящем описании, представлена как SEQ ID NO:3 (последовательность аминокислот) и SEQ ID NO; 4 (последовательность нуклеотидов). То есть, необходимо только, чтобы способ получения белкового комплекса согласно настоящему варианту реализации включал стадию трансформации хозяина вектором, содержащим полинуклеотид, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и вектором, содержащим полинуклеотид, состоящий из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:4.

Предпочтительно, чтобы каждый из указанных векторов представлял собой вектор экспрессии, включающий представляющий интерес полинуклеотид, функционально связанный с ним. В настоящем описании термин "функционально связанный" означает, что полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес пептид (или белок), находится под контролем контрольного участка, например промотора, и находится в такой форме, что пептид (или белок) может экспрессироваться в клетке - хозяине. Способ получения желаемого вектора с помощью «функционального связывания» полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес пептид, с вектором экспрессии хорошо известен в данной области техники. Кроме того, способ введения вектора экспрессии в клетку-хозяина также хорошо известен в данной области. Поэтому специалист в данной области может с легкостью создать желаемый пептид в хозяине.

При использовании в настоящем описании термин «трансформант» означает не только клетку, ткань или орган, но также и отдельный живой организм. К примерам живых организмов, служащих объектами трансформации, относятся, но не ограничены ими, различные микроорганизмы, растения и животные. Следует отметить, что необходимо только ввести в трансформант по крайней мере полинуклеотид, кодирующий полипептид, образующий белковый комплекс согласно настоящему изобретению и нужно, чтобы указанный трансформант экспрессировал такие полипептиды. То есть, следует отметить, что трансформант, полученный с применением других средств, отличных от вектора экспрессии, также входит в область охвата настоящего изобретения. Дополнительно, несмотря на то, что предпочтительно, чтобы в трансформанте согласно настоящему изобретению стабильно экспрессировался полипептид, образующий белковый комплекс согласно настоящему изобретению, представляющий интерес полипептид может экспрессироваться временно. Следует отметить, что использование трансформанта совместно с белковым комплексом согласно данному варианту реализации изобретения позволяет провести скрининг агонистов или антагонистов указанного комплекса, изучая поведение вторичного посредника в клетке хозяина.

В тех случаях, когда липидная мембрана согласно данному варианту реализации настоящего изобретения является искусственной мембраной, способ получения липидной мембраны согласно такому варианту реализации также может представлять собой способ получения планарной липидной мембраны или липосомы, содержащей сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора и, в частности, необходимо только, чтобы он включал стадию распределения белка сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-адренэргического рецептора и белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 на искусственной плоской мембране. С помощью общих принципов в данной области специалист в данной области может с легкостью перераспределить мембранный белок на искусственной липидной мембране. Применение искусственной липидной мембраны, существующей совместно с белковым комплексом согласно настоящему варианту реализации, позволяет измерить сродство комплекса к лиганду.

3. Применение липидной мембраны.

Специалисту в данной области будет очевидно, что приведенный выше способ получения липидной мембраны может представлять собой как способ получения белкового комплекса, так и способ изменения сродства к лиганду GPCR. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ изменения сродства GPCR к его лигандам.

Дополнительно, применение липидной мембраны согласно настоящему изобретению позволяет провести скрининг агониста или антагониста GPCR с измененным сродством к лиганду. То есть, настоящее изобретение обеспечивает способ скрининга агониста или антагониста GPCR с измененным сродством к лиганду.

Способ скрининга согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадии получения белкового комплекса, описанного выше, на липидной мембране; и инкубации белкового комплекса вместе с исследуемым фактором. В настоящем описании термин «инкубация» означает осуществление совместного нахождения множества веществ и приведение их в такое состояние, что они могут в достаточной степени контактировать друг с другом.

В предпочтительном варианте реализации, способ скрининга согласно настоящему изобретению включает стадию инкубации совместно с исследуемым фактором-кандидатом, трансформанта, содержащего интересующий GPCR (например, клетки, в которой экспрессируется сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора). Способ скрининга согласно указанному варианту реализации настоящего изобретения позволяет провести скрининг агонистов или антагонистов, представляющих интерес GPCR (например, адренэргического рецепторасопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа) с помощью измерения изменений вторичного посредника в клетке (например, количества цАМФ в тех случаях, когда G - белок представляет собой Gs или Gi белок, или концентрации инозинтрифосфата и Ca2+ в тех случаях, когда G -белок является Gq - белком).

Агонисты адренэргического рецептора сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа можно использовать в качестве лекарственного средства против недержания мочи, в качестве мидриатического средства, лекарства от глаукомы и для стимуляции центральной нервной системы. Антагонисты адренэргического рецептора сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа можно использовать в качестве лекарственного средства против расстройств мочеполовой системы, против болезни Рейно, против нарушения микроциркуляции, в качестве гипотензивного средства, депрессанта центральной нервной системы, средства для улучшения почечного кровотока, диуретического лекарственного средства. Далее, поскольку известно, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора связан с болезнями сердца, и известно, что допаминовый D2 рецептор и мускариновый рецептор связаны с болезнями центральной нервной системы, агонисты или антагонисты этих рецепторов также могут быть полезны.

4. Клетки с «нокдауном» и их применение.

Настоящее изобретение также обеспечивает трансформант, в котором экспрессия полипептида, который образует белковый комплекс с GPCR, была нарушена (нокдаун), и способ его получения. Способ получения трансформанта согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадии ингибирования экспрессии эндогенного полипептида.

Например, белок CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 , который является полипептидом, который образует комплекс с GPCR, экспрессируется в различных клетках. Поэтому, трансформант, в котором подавлена экспрессия эндогенного белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 , является очень полезным в качестве контроля клеток, который используют для анализа функции белкового комплекса или скрининга целевого соединения (например, агониста или антагониста). Клетку с нокдауном, описанную в этом разделе, можно использовать отдельно, но предпочтительно использовать ее в сочетании с описанным выше белковым комплексом или описанной выше липидной мембраной, содержащей комплекс. Следует отметить, что GPCR, который экспрессируется в целевой клетке, может быть эндогенным или экзогенным.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение может включать стадию подавления экспрессии эндогенного белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 в клетке, в которой экспрессировался GPCR. Это позволяет изменить сродство к лиганду GPCR, который экспрессируется в клетке. Таким образом, способ получения трансформанта согласно настоящему изобретению может представлять собой способ получения трансформанта, экспрессирующего GPCR с измененным сродством к лиганду и способ изменения сродства GPCR к его лиганду. В одном варианте реализации, настоящее изобретение может включать стадию подавления экспрессии эндогенного белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 в клетке, в которой экспрессируется сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтип адренэргического рецептора. Это позволяет превратить клетку, проявляющую фенотип сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-подтипа, в клетку, проявляющую фенотип сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа. Предпочтительно, в качестве способа подавления экспрессии эндогенного белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 используют способ РНК-интерференции. Способ РНК-интерференции представляет собой хорошо известный в данной области способ, например, экспрессию эндогенного белка CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 можно успешно ингибировать посредством введения в интересующую клетку олигонуклеотида, состоящего из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:5. В том случае, когда для введения в интересующую клетку олигонуклеотида, состоящего из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:5, применяют вектор предпочтительно, чтобы в качестве антисмысловой последовательности использовали олигонуклеотид, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:6 без каких-либо ограничений.

Дополнительно, настоящее изобретение обеспечивает способ, который характеризуется использованием описанного выше трансформанта, для скрининга агониста или антагониста GPCR с измененным сродством к лиганду.

Настоящее изобретение не ограничивается описанием приведенных вариантов реализации, но может быть изменено специалистом в данной области в пределах формулы изобретения. Вариант реализации, основанный на правильном сочетании технических средств, раскрытых вариантов реализации включен в область охвата настоящего изобретения.

Вся академическая и патентная литература, размещенная здесь, включена посредством ссылки на настоящее описание.

Примеры

1. Структуры.

Ген сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -адренэргического рецептора человека (ADRA1A) клонировали из библиотеки простаты человека с помощью метода ПЦР. Клонированный ген имеет общую длину 1465 п.н. и последовательность открытой рамки считывания (ОРС), которая идеально соответствует последовательности открытой рамки считывания гена сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 человека (NCBI номер доступа U03866 или NM_000680), о чем сообщали ранее. Дополнительно, последовательности, находящиеся до и после последовательности ОРС, совпадали с последовательностями, о которых сообщали Hirasawa et al. (1993).

Ген CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 клонировали из библиотеки кДНК простаты человека. В результате определения последовательности клонированный ген совпадал с последовательностью, о который сообщали Rupp et al. (2002) (NCBI номер доступа NM_015513).

Затем кодирующий район гена ADRA1A субклонировали по сайту рестрикции EcoRI мультиклонального сайта A pIRES (Clonetech, каталожный номер РТ3266-5). Дополнительно, кодирующий участок CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 субклонировали по сайту рестрикции Xbal мультиклонального сайта В pIRES. В целях субклонирования, к каждому концу каждого гена добавляли адаптер фермента рестрикции.

2. Получение трансформанта.

Вектор амплифицировали/очистили традиционным способом и затем провели трансфекцию клеток СНО-К1, которые представляют собой клетки яичника китайского хомячка, с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation) согласно протоколу изготовителя. Через 2 дня после трансфекции, в питательную среду DMEM добавили 1200 мкг/мл антибиотика Генетицина (G418). Клетки, которые не трансфицировали вектором, т.е. клетки, которые обработали так же Lipofectamine 2000 и т.п., и вектор не добавляли, погибали при концентрации G418 1000 мкг/мл. С418-устойчивые клетки разбавляли, суспендировали и распределяли по 96-луночному планшету так, что в среднем на лунку приходилось 0.5 клетки и затем отбирали отдельные колонии. Эту операцию повторяли трижды, в результате чего получили стабильный клон клеток (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клеток), в которых одновременно экспрессировался ген ADRA1A и ген CREDL1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 . Далее, в качестве контрольной группы получили клетки, в которых стабильно экспрессировался только ген ADRA1A (сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клетки), и клетки, в которых стабильно экспрессировался только ген CREDL1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 (CREDL1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 клетки).

3. Опыт по связыванию.

Препаратами, использованными в экспериментах по связыванию, и их правильными химическими названиями являются: силодозин, празозин, тамсулозин, RS-17053 (N-[2-(2-циклопропилметоксифенокси) этил)-5-хлор-сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 ,сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 -диметил-1Н-индол-3-этанамин гидрохлорид), BMY 7378 (8-[2-[4-(2-метоксифенил)-1-пиперазинил]этил]8-ааспиро[4,5]декан7,9-дион дигидрохлорид).

Стабильный клон изучали с помощью способа фармакологического связывания с [3Н]-силодозином, который является радиолигандом. Эксперимент проводили с использованием способа связывания с целыми клетками. Иначе говоря, за 2-3 дня до эксперимента клетки рассеяли по поверхности для получения конфлюентности 50%, дважды отмыли ледяным PBS и затем соскребли скребком. Клетки, собранные таким образом, повторно суспендировали в растворе Krebs-HEPES и затем инкубировали при 4°С в течение 4 часов вместе с [3H]-силодозином и другим лекарством по мере необходимости. После этого клетки фильтровали/отмывали на фильтре Whatmann GC/F, предварительно обработанном полиэтиленомимином и измеряли радиоактивность с помощью жидкого сцинтилляционного счетчика. Неспецифичное связывание оценивали как связывание в присутствии 30 мкМ фенотоламина.

[А] Эксперименты по связыванию и насыщению согласно цельноклеточному способу.

Исследовали связывание [3H]-силодозина в различных концентрациях (30-1000 нМ) с клетками сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L (Фиг.1). На Фиг.1 изображена кривая насыщения-связывания, полученная с помощью способа анализа связывания с целыми клетками. Специфичное связывание [3H]-силодозина с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клетками демонстрирует максимальное связанное количество (Bmax) 134 фмоль/мг белка и значение Kd 843 пМ

(pKD=9.1).

[Б] Эксперимент по конкурентному связыванию.

Известно, что силодозин селективно с высоким сродством связывается с подтипами сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A- и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L. Термин "высокое сродство" здесь означает, что Kd равна или меньше 1 нМ. Для того чтобы определить фармакологические свойства рецепторов, экспрессируемых на клетках сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, проводили эксперименты по конкурентному связыванию с празозином в концентрации 300 пМ по сайтам связывания [3H]-силодозина с помощью способа анализа связывания с целыми клетками. В качестве контрольной клеточной линии использовали она клетки. Показано, что [3H]-силодозин является селективным антагонистом для обоих подтипов сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A- и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L.

Как показано на конкурентной кривой на Фиг.2(а), большинство (88% или выше) рецепторов сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клеток демонстрируют низкую чувствительность к празозину (pKi=7.6). Дополнительно, аналогично рецепторы имеют низкую чувствительность к RS-17053 и обладают высокой чувствительностью к тамсулозину. Кроме того, рецепторы сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клеток демонстрируют только низкую чувствительность к BMY 7378 (Таблица 2). С другой стороны, чувствительность (значения pKi) сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клеток, использованных в качестве контрольной группы, к празозину (Фиг.2), тамсулозину и RS-17053 достигает 9.5, 9.9 и 8.8, соответственно, что соответствует свойствам сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, о которых сообщалось ранее (таблица 2).

[Таблица 2]
Фармакологические свойства сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-адренергических рецепторов в двух клеточных линиях и предстательной железе человека
Лекарствосопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клетки сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клетки Предстательная железа человека
[3H]-силодозин 9.19.7 9.5
(pKD)
Празозин 7.6 9.58.3
Тамсулозин 9.39.9 10.0
RS-17053 <6.0 8.86.6
BMY 7378 <6.06.5 5.9

В этой таблице константы ингибирования (Ki) конкурентных лекарственных средств по сайтам связывания [3H]-силодозина на сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клетках, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клетки, и фрагменты ткани простаты человека приведены в виде logKi (pKi). Однако величина [3H]-силодозина показывает величину pKD (константа равновесия диссоциации), рассчитанную из кривой связывания насыщения. Величина представляет собой среднее для трех-четырех примеров.

Далее, Фиг.2(b) иллюстрирует результаты, полученные при исследовании чувствительности к празозину в гомогенатах сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клеток и гомогенатах сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клеток. Гомогенаты сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клеток демонстрируют такую же высокую чувствительность к празозину, что и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клетки. Это хорошо соотносится с тем, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L рецепторы в простате и мозге разрушаются при гомогенизации тканей, и с тем, что фармакологический профиль меняется на сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A фенотип.

Данные по сродству различных лекарственных средств к сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1-адренергическим рецепторам сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L и сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клеток и простаты человека обобщены в таблице 2. сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клетки, в которых одновременно экспрессируется ген ADRA1A и ген CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 , отличаются по свойствам рецепторов от сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A рецепторов и по фармакологическим свойствам хорошо соотносятся с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L рецепторами, о присутствии которых в простате человека и т.п. сообщали. Таким образом, считается, что в отличие от сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клеток, сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L клетки являются клеточной линией, которая экспрессирует преимущественно сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L рецепторы.

4. Эксперимент по определению концентрации внутриклеточного Са2+.

Далее, для того чтобы полностью избавиться от влияния CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 , которые могли эндогенно экспрессироваться в сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клетках, применили способ РНК-интерференции для получения клеток, в которых экспрессия CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 была полностью подавлена (такие клетки далее обозначают термином "KD клетки"). Для того чтобы подавить экспрессию гена с помощью способа РНК-интерференции, создали вектор посредством вставки олигонуклеотида (смысловая последовательность;

GATCCAGGCGACTTAGTGTTCACCTTCAAGAGAGGTGAACACTAAGTCG ССТТТА: SEQ ID NO:5, антисмысловая последовательность;

AGCTTAAAGGCGACTTAGTGTTCACCTCTCTTGAAGGTGAACACTAAGTC GCCTG: SEQ ID NO:6), содержавшего кодирующий участок мРНК CRELDIa китайского хомячка, в коммерчески доступный pSilencerсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 4.1-CMV hygro (Ambion, Inc.) согласно инструкциям изготовителя, и затем трансфицировали сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A клетки таким же способом, как описанный выше. Ответ Са2+ на норадреналин в KD клетках изучали с помощью флуоресцентного фотометрического способа с использованием Рига-2, который является флуоресцентным красителем. Значение рЕС50 Са2+ ответа на норадреналин в KD клетках составило 7.9. С другой стороны, когда клетки заранее обрабатывали празозином 10-8 М в течение 2 минут, дозозависимая кривая ответа Ca2+ на норадреналин смещалась вправо, и значение pKD оказалось равно 9.3. Это показывает, что ответ Ca2+ на норадреналин в KD клетках соответствует свойствам сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа.

Таким образом, когда экспрессию эндогенного CRELD1сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 в СНО клетках, в которых экспрессировался ген сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа, подавляли с помощью способа РНК-интерференции, идеально проявлялись свойства сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A рецептора. Следует отметить, что проводили некоторые эксперименты, в которых функции рецептора сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A-подтипа, например ответ Са2+, исследовали с использованием СНО клеток, в которых экспрессировался ген рецептора. Однако, не всегда было соответствие в свойствах рецептора, полученных в результате этих экспериментов.

Применение настоящего изобретения делает возможным определить GPCR, природа которых оставалась неизвестной, и таким образом, обеспечить лечение любого заболевания, связанного с данным рецептором, и также делает возможным изменить сродство GPCR к лиганду.

Варианты реализации и конкретные примеры выполнения настоящего изобретения, рассмотренные в предыдущем подробном объяснении, служат исключительно для иллюстрации технических подробностей настоящего изобретения, которое не должно быть узко истолковано в пределах таких вариантов реализации и конкретных примеров, но может быть применено в различных вариациях в пределах духа настоящего изобретения, при условии, что эти вариации не выходят за пределы формулы изобретения, приведенной ниже.

Промышленное применение

Известно, что сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-AR является функциональным рецептором и главной мишенью для многих лекарственных средств системы нижних мочевыводящих путей. Поэтому, представленные клетки, экспрессирующие сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-AR, созданные авторами настоящего изобретения, следует считать очень полезными для разработки лекарственных средств для лечения нарушения функций мочевых путей у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и недержанием мочи. Дополнительно, клетки, экспрессирующие сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-AR, следует считать очень полезными для применения в способе скрининга лекарственных средств для лечения любых заболеваний, связанных с сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L-AR.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Белковый комплекс, обладающий сродством GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L к лиганду, включающий GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, и полипептид, причем указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:1;

или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

2. Трансформированная клетка, экспрессирующая белковый комплекс по п.1, причем указанная клетка содержит:

(i) первый вектор, содержащий первый полинуклеотид, который кодирует GPCR сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, и второй вектор, содержащий второй полинуклеотид, который кодирует пептид; или

(ii) третий вектор, включающий первый полинуклеотид, который кодирует GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, и второй полинуклеотид, который кодирует пептид,

где указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:1;

или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

3. Способ получения трансформированной клетки по п.2, включающий стадию совместной экспрессии GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A и полипептида в изолированной клетке, причем указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет

последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

4. Способ изменения сродства GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A к лиганду, включающий стадию экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, причем указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или

(3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет

последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

5. Способ скрининга агониста или антагониста GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, включающий стадии:

одновременной экспрессии в изолированной клетке GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A и полипептида с образованием GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L; и

инкубации клетки, экспрессирующей GPCR сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L с исследуемым фактором, и дополнительно включающий стадии:

измерения внутриклеточной концентрации Са 2+ или метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата в клетке, экспрессирующей GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, перед стадией инкубации или после нее;

и

определения того, является исследуемый фактор агонистом или

антагонистом GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, причем

исследуемый фактор признают агонистом GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, если значение, полученное в результате измерения после стадии инкубации, выше значения, полученного в результате измерения до стадии инкубации, и исследуемый фактор признают антагонистом GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, если значение, полученное в результате измерения после инкубации, не отличается от значения, полученного в результате измерения до стадии инкубации, причем измерение, осуществляемое после стадии инкубации, проводят в присутствии агониста GPCR сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L,

где указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

6. Способ получения трансформированной клетки, экспрессирующей GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, включающий стадию подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L,

причем указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный полипептид представляет собой эндогенный белок.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что стадию подавления экспрессии полипептида осуществляют способом РНК-интерференции.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что способ РНК-интерференции осуществляют посредством вставки олигонуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:5.

10. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная изолированная клетка представляет собой трансформированную клетку, экспрессирующую экзогенный GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L.

11. Способ изменения сродства GPCR сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L к лиганду, включающий стадию подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L,

причем указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.

12. Способ скрининга агониста или антагониста GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, включающий стадии:

подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L с образованием GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A; и

инкубации указанной клетки, экспрессирующей GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A,

совместно с исследуемым фактором,

и дополнительно включающий стадии:

измерения внутриклеточных концентраций Cа2+ или

метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата в клетке, экспрессирующей GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, перед стадией инкубации и после нее; и

определения того, является исследуемый фактор агонистом или антагонистом GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, причем

исследуемый фактор признают агонистом GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A, если значение, полученное в результате измерения после стадии инкубации, выше значения, полученного в результате измерения до инкубации, и

исследуемый фактор признают антагонистом GPCRсопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1L, если значение, полученное в результате измерения после инкубации, не отличается от значения, полученного в результате измерения до инкубации, при условии, что измерение, осуществляемое после стадии инкубации, проводят в присутствии агониста GPCR сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство   к лигандам, и его применение, патент № 2468035 1A,

причем указанный полипептид представляет собой:

(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или

(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2468035

patent-2468035.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K14/47 из млекопитающих

Патенты РФ в классе C07K14/47:
способ получения хлоркальциевого казеина -  патент 2528978 (20.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
антигенные tau-пептиды и их применения -  патент 2518291 (10.06.2014)
применение производных пептида wnt5-a для лечения меланомы и рака желудка -  патент 2517190 (27.05.2014)
мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения -  патент 2515063 (10.05.2014)
композиция для лечения рака предстательной железы (рпж) -  патент 2508125 (27.02.2014)
сшивающие реагенты и их применение -  патент 2503687 (10.01.2014)
плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду escherichia, неактивного предшественника днказы i человека или ее мутеинов, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, предшественник рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина днказы i человека, ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной днказы i человека -  патент 2502803 (27.12.2013)
бис-met-гистоны -  патент 2498997 (20.11.2013)

Класс C07K17/02 пептиды, иммобилизованные на или в органическом носителе

Класс C07K19/00 Гибридные пептиды

Патенты РФ в классе C07K19/00:
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами -  патент 2524129 (27.07.2014)
искусственный ген mel-tci-a0201, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген mel-tci-a0201, рекомбинантная плазмидная днк pmel-tci-a0201, обеспечивающая экспрессию искусственного гена mel-tci-a0201 и искусственный белок-иммуноген mel-tci-a0201, содержащий множественные ctl- и th-эпитопы антигенов меланомы -  патент 2522830 (20.07.2014)
антитело двойной направленности в новой форме и его применение -  патент 2520824 (27.06.2014)
мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных кислот -  патент 2517608 (27.05.2014)
гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения -  патент 2515914 (20.05.2014)
гибридный белок, обладающий пролонгированным действием, на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека (варианты), способ его получения и штамм saccharomyces cerevisiae для осуществления этого способа (варианты) -  патент 2515913 (20.05.2014)
рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза -  патент 2514230 (27.04.2014)

Класс C12N1/15 модифицированные введением чужеродного генетического материала

Патенты РФ в классе C12N1/15:
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
гомологи фосфатазы фосфатидной кислоты и их применение -  патент 2507264 (20.02.2014)
новые гены ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты -  патент 2507263 (20.02.2014)
клетка-хозяин trichoderma reesei для получения целлюлолитической белковой композиции, целлюлолитическая белковая композиция, способы ее получения и применения -  патент 2494146 (27.09.2013)
способ получения гетерологичных белков -  патент 2487168 (10.07.2013)
гомологи глицерин-3-фосфатацилтрансферазы (гфат) и их использование -  патент 2485179 (20.06.2013)
способ биологического производства н-бутанола -  патент 2461627 (20.09.2012)
рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18 -  патент 2445358 (20.03.2012)
рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 -  патент 2445357 (20.03.2012)
бактерия - продуцент 1-бутанола и способ получения 1-бутанола -  патент 2431672 (20.10.2011)

Класс C12N1/19 модифицированные введением чужеродного генетического материала

Патенты РФ в классе C12N1/19:
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
способ получения механозависимого фактора роста человека -  патент 2523908 (27.07.2014)
применение штамма дрожжей komagataella pastoris в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевого белка -  патент 2522479 (20.07.2014)
гибридный белок, обладающий пролонгированным действием, на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека (варианты), способ его получения и штамм saccharomyces cerevisiae для осуществления этого способа (варианты) -  патент 2515913 (20.05.2014)
гомологи фосфатазы фосфатидной кислоты и их применение -  патент 2507264 (20.02.2014)
новые гены ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты -  патент 2507263 (20.02.2014)
рекомбинантный штамм дрожжей yarrowia lipolytica - продуцент фитазы -  патент 2504579 (20.01.2014)
способ микробиологического синтеза целевого секретируемого белка в дрожжах saccharomyces cerevisiae -  патент 2502805 (27.12.2013)
способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита е и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е -  патент 2501809 (20.12.2013)
укороченная мутантная люцифераза из metridia longa для применения в качестве биолюминесцентного репортера в живых клетках -  патент 2495929 (20.10.2013)

Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала

Патенты РФ в классе C12N1/21:
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
тест-система для скрининга ингибиторов протеинкиназы gsk3 ; человека -  патент 2528059 (10.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
плазмида 40nagal, определяющая синтез -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения -  патент 2525682 (20.08.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина -  патент 2524133 (27.07.2014)

Класс C12N5/10 клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом

Патенты РФ в классе C12N5/10:
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование -  патент 2527891 (10.09.2014)
антитела против g-белка распираторно-синцитиального вируса (rsv) -  патент 2526517 (20.08.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
средство для лечения ишемических поражений тканей и способ его применения -  патент 2522778 (20.07.2014)
одноцепочечное антитело к раково-эмбриональному антигену, химерный мономолекулярный т-клеточный рецептор, вектор и клетка-хозяин для обеспечения экспрессии такого рецептора и способ диагностики или лечения. -  патент 2522004 (10.07.2014)
средство для вовлечения происходящей из костного мозга плюрипотентной стволовой клетки в периферический кровоток -  патент 2519714 (20.06.2014)

Класс C12N15/09 метод рекомбинантных ДНК

Патенты РФ в классе C12N15/09:
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
способ скрининга с использованием фактора, являющегося мишенью для талидомида -  патент 2528380 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
полинуклеотид, кодирующий гомолог ацил-соа-синтетазы, и его применение -  патент 2528248 (10.09.2014)
тест-система для скрининга ингибиторов протеинкиназы gsk3 ; человека -  патент 2528059 (10.09.2014)
способ и набор для детекции микроорганизмов -  патент 2527897 (10.09.2014)
способ получения наноматериала на основе рекомбинантных жгутиков археи halobacterium salinarum -  патент 2526514 (20.08.2014)
рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, продуцирующая гемагглютинин вируса гриппа штамма a/brisbane/59/2007(h1n1) и способ ее использования -  патент 2523599 (20.07.2014)

Класс G01N33/15 медицинских препаратов

Патенты РФ в классе G01N33/15:
способ определения подлинности и количественного содержания бензэтония хлорида в лекарственных препаратах -  патент 2529814 (27.09.2014)
способ скрининга с использованием фактора, являющегося мишенью для талидомида -  патент 2528380 (20.09.2014)
способ диагностики мембранотоксичности -  патент 2527698 (10.09.2014)
способ количественного определения молочной кислоты методом вольтамперометрии на стеклоуглеродном электроде -  патент 2526821 (27.08.2014)
способ определения антиоксидантной активности эфирного масла растительного происхождения in vitro -  патент 2526125 (20.08.2014)
способ детекции дегенеративных мышечных заболеваний и способ определения терапевтической эффективности при заболеваниях -  патент 2524641 (27.07.2014)
способ определения кодеина -  патент 2523408 (20.07.2014)
средство для вовлечения происходящей из костного мозга плюрипотентной стволовой клетки в периферический кровоток -  патент 2519714 (20.06.2014)
способ доклинического тестирования иммуномодулирующих лекарственных средств -  патент 2519641 (20.06.2014)
способ определения пикамилона -  патент 2517489 (27.05.2014)

Класс G01N33/50 химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания

Патенты РФ в классе G01N33/50:
способ выбора лечения акне у женщин -  патент 2529789 (27.09.2014)
способ определения структурного состояния мембраны эритроцитов -  патент 2528909 (20.09.2014)
способ определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните -  патент 2528880 (20.09.2014)
способ лечения больных с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела -  патент 2528641 (20.09.2014)
способ диагностики острого токсического повреждения печени -  патент 2527770 (10.09.2014)
способ исследования скорости всасывания аминокислот в пищеварительном тракте -  патент 2527349 (27.08.2014)
способ комплексного лечения некротического энтероколита у новорожденных и детей младшего грудного возраста -  патент 2527348 (27.08.2014)
способ оценки эффективности тромболитической терапии у больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента st -  патент 2526831 (27.08.2014)
способ прогнозирования развития пороговой стадии ретинопатии недоношенных у детей без офтальмологических признаков заболевания -  патент 2526827 (27.08.2014)
способ диагностики наружного генитального эндометриоза -  патент 2526823 (27.08.2014)

Класс C07K14/705 рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы

Патенты РФ в классе C07K14/705:
искусственный ген mel-tci-a0201, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген mel-tci-a0201, рекомбинантная плазмидная днк pmel-tci-a0201, обеспечивающая экспрессию искусственного гена mel-tci-a0201 и искусственный белок-иммуноген mel-tci-a0201, содержащий множественные ctl- и th-эпитопы антигенов меланомы -  патент 2522830 (20.07.2014)
scfv cинтетический аналог вариабельных участков моноклонального антитела 6313/g2 к рецептору ангиотензина ii типа 1 -  патент 2512071 (10.04.2014)
иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты -  патент 2506275 (10.02.2014)
синтетический антиген, обладающий способностью связывать аутоантитела к мускариновому м2-рецептору -  патент 2502743 (27.12.2013)
изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическое(ий) для человеческого иммуноглобулина е (варианты), кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, фармацевтическая композиция, применение ее для лечения расстройств, ассоциированных с ige -  патент 2466140 (10.11.2012)
способ изготовления панели сывороток с hbsag ad- и ay-субтипов для контроля качества диагностики гепатита в -  патент 2463610 (10.10.2012)
пептиды, ингибирующие нейронный экзоцитоз -  патент 2461568 (20.09.2012)
способ иммуноферментного анализа для определения аутоантител к 1-адренорецептору в плазме и сыворотке крови человека -  патент 2452964 (10.06.2012)
sparc-производные антигенные пептиды отторжения опухоли и лекарственные средства, содержащие их -  патент 2451521 (27.05.2012)
пептид с антипролиферативной активностью и фармацевтическая композиция для лечения пролиферативных заболеваний -  патент 2446174 (27.03.2012)


Наверх