способ оценки участия остеоцитов в минерализации костного матрикса

Формула изобретения

Способ оценки участия остеоцитов в минерализации костного матрикса, включающий визуализацию растворимых аморфных минеральных компонентов по характерному цвету, описываемому неравенством I_B>I_R>I_G, где I_B - значение интенсивности по синему, I_R - по красному и I_G - по зеленому каналам RGB-системы, в оцифрованных без светофильтров в режиме автоматического баланса белого при инструментальных увеличениях микроскопа не менее 200х полноцветных изображениях окрашенных по Массону-трихром в прописи с анилиновым синим поперечных срезов частично (булавочная проба) декальцинированной кости, отличающийся тем, что в качестве участков для анализа оконтуривают и кадрируют остеоны и вставочные пластинки, в каждом из полученных изображений нумеруют лакуны остеоцитов, подсчитывают общее их число, а также количество лакун, содержащих минералы в аморфной фазе, определяют процентное содержание последних как коэффициент участия остеоцитов в минерализации костного матрикса, и если минералы в аморфной фазе обнаруживаются менее чем в 30% лакун, минерализационную активность остеоцитов оценивают как низкую, при наличии аморфных минералов в 30-80% лакун - как среднюю, а если более 80% лакун содержат минералы в аморфной фазе - как высокую.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при патоморфологической диагностике остеопороза по костным биоптатам.

Известно, что остеоциты участвуют в минерализации межклеточного костного матрикса (Bonewald L. Osteocytes as multifunctional cells. Musculoskelet Neuronal Interact. 2006; 6(4):331-333), закачивая необходимый для этого раствор минеральных компонентов из канала и внутренней пластинки остеона в свои лакуны по костным канальцам благодаря волнообразным движениям проходящих в них отростков (Veno Р, Nicolella DP, Sivakumar Р, Kalajzic I, Rowe D, Harris SE, Bonewald L, Dallas SL. Live imaging of osteocytes within their lacunae reveals cell body and dendrite motions. J Bone Miner Res. 2006), но количественная оценка этого участия отсутствует.

Известен способ визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации костного матрикса в процессе остеогенеза, включающий визуализацию растворимо-аморфных минеральных компонентов в оцифрованных без светофильтров в режиме автоматического баланса белого при инструментальных увеличениях микроскопа не менее 200х полноцветных изображениях окрашенных по Массону-трихром в прописи с анилиновым синим поперечных срезов частично (булавочная проба) декальцинированной кости по характерному цвету, описываемому неравенством I_B>I_R >I_G, где I_B - значение интенсивности по синему, I_R - по красному и I_G - по зеленому каналам RGB-системы цифрового цвета (Способ визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации костного матрикса в процессе остеогенеза - заявка на изобретение № 2010112158, приоритет от 29.03.2010 г., положительное решение о выдаче патента 27.01.2011 г.).

Однако способ не адаптирован для количественной оценки участия остеоцитов в минерализации костного матрикса.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность количественной оценки участия остеоцитов в минерализации костного матрикса.

Указанная задача решается тем, что в способе оценки участия остеоцитов в минерализации костного матрикса, включающем визуализацию растворимых аморфных минеральных компонентов по характерному цвету, описываемому неравенством I_B>I _R>I_G, где I_B - значение интенсивности по синему, I_R - по красному и I_G - по зеленому каналам RGB-системы, в оцифрованных без светофильтров в режиме автоматического баланса белого при инструментальных увеличениях микроскопа не менее 200х полноцветных изображениях окрашенных по Массону-трихром в прописи с анилиновым синим поперечных срезов частично (булавочная проба) декальцинированной кости, а в качестве участков для анализа оконтуривают и кадрируют остеоны и вставочные пластинки, в каждом из полученных изображений нумеруют лакуны остеоцитов, подсчитывают общее их число, а также количество лакун, содержащих минералы в аморфной фазе, определяют процентное содержание последних как коэффициент участия остеоцитов в минерализации костного матрикса, и если минералы в аморфной фазе обнаруживаются менее чем в 30% лакун, минерализационную активность остеоцитов оценивают как низкую, при наличии аморфных минералов в 30-80% лакун - как среднюю, а если более 80% лакун содержат минералы в аморфной фазе - как высокую.

Способ поясняется описанием и иллюстративным материалом, на котором изображено:

Фиг.1 - представленный в серой палитре фрагмент полноцветного цифрового изображения поперечного целлоидинового среза диафиза малоберцовой кости взрослой беспородной собаки. Окраска - Массон-трихром. Объектив - 16, окуляр - 12,5х. Овалом оконтурен остеон, ГК - его канал, цифрами обозначены лакуны остеоцитов остеона, ВП - вставочные пластинки вокруг него.

Фиг.2 - в том же изображении цветовой сегментацией визуализированы участки, цвет которых, описываемый неравенством I_B>I _R>I_G, указывает на присутствие в тканевых структурах минералов в аморфной, растворимой фазе. Малыми овалами очерчены лакуны остеоцитов остеона, содержащие такие минералы (11 из 28). Все лакуны остеоцитов между вставочными пластинками демонстрируют наличие минералов в аморфной фазе.

Способ осуществляют следующим образом.

Микропрепарат - окрашенный трихромным методом по Массону (пропись с анилиновым синим) поперечный гистологический срез частично - до готовности к микротомированию (булавочная проба) - декальцинированной компактной кости размещают на предметном столике микроскопа, снабженного цифровой фото- или видеокамерой, выбирают режим камеры «автоматический баланс белого», при увеличении микроскопа от 200х и более выбирают нужное поле зрения - остеоны и расположенные между ними вставочные пластинки, без светофильтров регулируют освещение, тщательно фокусируют и оцифровывают изображение препарата, сохраняют его как полноцветный графический файл формата *.bmp без компрессии и, при необходимости, транспортируют по телекоммуникационным каналам связи в специализированный компьютер.

В программе-графическом редакторе (например, Adobe PhotoShop 3.0) выделяют контуром один остеон, внутри контура маркируют (например, цифрами) все лакуны остеоцитов и визуализируют минералы в аморфной фазе, осуществляя цветовую сегментацию изображения так, чтобы в нем осталась только одна цветовая тональность, описываемая неравенством I_B>I_R>I_G, где I_B - значение интенсивности по синему, I_R - по красному и I_G - по зеленому каналам RGB-системы цифрового цвета, подсчитывают лакуны, содержащие аморфные минералы, и определяют их процентное содержание в анализируемом остеоне. Оценивают минерализационную активность остеоцитов как низкую, если минералы в аморфной фазе обнаруживаются менее чем в 30% лакун, среднюю - при наличии аморфных минералов в 30-80% лакун и высокую, если более 80% лакун содержат минералы в аморфной фазе.

Использование заявленного способа в ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова, показало, что данный способ оценки не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, но позволяет в стандартном биопсийном материале при стандартных для костных биопсий методах окраски надежно и объективно выявить особенности процесса вторичной минерализации в ходе ремоделирования кости, что имеет диагностическое и прогностическое значение в клинике остеопороза.