штамм бактерий haemophilus influenzae в 326, стабильный продуцент капсульного полисахарида

Классы МПК:C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
C12P19/04 полисахариды, те соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями
A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Общество с ограниченной ответственностью "ГРИТВАК" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2011-10-05
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Haemophilus influenzae b № 326 (коллекция ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России № 289), который обладает способностью стабильно синтезировать капсульный полисахарид в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах, характеризуется высокой продуктивностью (от 90 до 150 мкг/мл на синтетической и от 80 до 130 мкг/мл на полусинтетической среде) при минимальном периоде культивирования. Изобретение может быть использовано для получения капсульного полисахарида, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов. 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения капсульного полисахарида, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов. Haemophilus influenzae b № 326 (коллекция ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России № 289) обладает способностью стабильно синтезировать капсульный полисахарид при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Капсульный полисахарид, продуцируемый Haemophilus influenzae b, является основой для производства специфических для данного серотипа возбудителя вакцин, а также диагностических тест-систем. С целью получения капсульного полисахарида разрабатывают системы культивирования микроорганизмов. Определяющим фактором эффективной системы культивирования является штамм-продуцент, способный стабильно синтезировать капсульный полисахарид в среду культивирования.

Для роста бактерий Haemophilus influenzae b требуются полноценные питательные среды. Однако при культивировании вакцинных штаммов следует избегать использования питательных сред, содержащих продукты животного происхождения, так как большое количество белков, содержащихся в полноценных питательных средах, мешает процессу очистки капсульного полисахарида [WHO Technical Report Series 897. WHO Expert committee on biological standardization. Forty-ninth Report. WHO, Geneva. 2000: 29-60]. С учетом рекомендаций ВОЗ оптимальными условиями культивирования вакцинных штаммов с целью получения чистых бактериальных полисахаридов следует считать синтетические и полусинтетические питательные среды.

Поскольку штаммы Haemophilus influenzae b обладают разными продуктивными и ростовыми характеристиками, целью изобретения является штамм Haemophilus influenzae b № 326 (коллекция ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России № 289), способный стабильно синтезировать капсульный полисахарид в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической средах.

Наиболее близким аналогом, с которым можно сравнивать предлагаемый штамм, является заявка на изобретение RU 2257412, 27.07.2005, С1 (Елкина С.И., Ястребова Н.Е., Орлова О.Е., Ванеева Н.П., Сергеев В.В., Апарин П.Г., Львов В.Л.: штамм Haemophilus influenzae b Mech № 1 - продуцент капсульного полисахарида - полирибозилрибитолфосфата, в которой охарактеризованы культурально-морфологические, биохимические, антигенные свойства штамма Haemophilus influenzae b Mech № l, дана его продуктивность при росте на полусинтетической и синтетической питательных средах в количестве 50 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно по прошествии 6 часов от момента достижения стационарной фазы роста.

В отличие от аналога предлагаемый штамм Haemophilus influenzae b № 326 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития России № 289) обладает рядом технических преимуществ: большая продуктивность от 80 до 130 мкг/мл на полусинтетической и от 90 до 150 мкг/мл на синтетической среде, высокая скорость роста на жидких питательных стерах (период культивирования по сравнению с аналогом короче почти в 2 раза).

Штамм Haemophilus influenzae b № 326 выделен в 2006 году от больного ребенка в ходе клинико-лабораторного обследования (история болезни № 62159) и характеризуется способностью стабильно синтезировать оптимальное количество капсульного полисахарида в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической средах. Культура идентифицирована по микробиологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Штамм Haemophilus influenzae b № 326 принят на депонирование в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов III и IV групп «Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича» Минздравсоцразвития России под № 289.

Морфологические свойства Haemophilus influenzae b № 326. Микроскопия окрашенного мазка: грамотрицательные бактерии в форме прямых палочек с закругленными концами 0,5-2,0 мкм в длину и 0,2-0,3 мкм в ширину, имеют капсулу, обладают полиморфизмом.

Культуральные свойства Haemophilus influenzae b № 326. На твердых питательных средах - образуют мелкие прозрачные колонии, которые похожи на капельки росы. На жидких питательных средах вызывают равномерное помутнение среды. Ростовыми факторами являются гемин и никотинамидаденонуклеотид (НАД). Оптимальные условия культивирования 35-37°С в атмосфере с повышенным содержанием CO2(5-10%).

Биохимическая активность штамма Haemophilus influenzae b № 326 - восстанавливает нитриты и нитраты, образует индол, ферментирует с образованием кислоты глюкозу и сахарозу, фруктозу, мальтозу, ксилозу.

Отношение штамма Haemophilus influenzae b № 326 к видовым диагностическим сывороткам - относится к b серовару, с другими сыворотками не агглютинирует.

Антигенные свойства штамма Haemophilus influenzae b № 326 - бактерии рода Haemophilus, вида Haemophilus influenza, серовариант b.

Штамм Haemophilus influenzae b № 326 хранится в лиофилизированном состоянии в сахарозо-желатиновой среде (50% сахарозы, 50% желатины в физиологическом растворе).

Получение капсульного полисахарида при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах штамма Haemophilus influenzae b № 326.

Пример № 1. Выращивание штамма Haemophilus influenzae b № 326 на синтетической питательной среде. В ампулу с лиофильно высушенной культурой вносили стерильный физиологический раствор. Каплю полученной суспензии рассевали на 1,5% сердечно-мозговой агар (Difco) с добавлением 10 мг/л гемина (HEMIN CLORIDE МР Biomedicals, LLC) и 4 мг/л среды НАД (NADH Dinatriumsalz AppliChem). Затем делали посев на чашки с плотной питательной средой. Чашки помещали в термостат на 18 часов при 37°С и 5-10% CO2. Выросшую культуру подращивали в колбах емкостью 200 мл и пересевали в ферментер марки «Анкум» с жидкой синтетической питательной средой [Klein R.D., Luginbuhl G.H. Simplified media for growth of Haemophilus influenzae from clinical and normal flora sources. J. Gen. Microbiol. 1970, 113: 409-411], содержащую кроме солей факторы роста (гемин, НАД). Выращивание проводили в условиях принудительной аэрации при 37°С. В процессе культивирования биомассу равномерно перемешивали. Пробы для определения количества накапливающегося в питательной среде капсульного полисахарида отбирали каждый час. После достижения стационарной фазы выращивание заканчивали. Длительность культивирования не превышала 8 часов. Количество капсульного полисахарида в среде культивирования оценивали по результатам ракетного иммунноэлектрофореза (РИЭФ). В качестве референс-препарата использовали очищенный капсульный полисахарид. Количество капсульного полисахарида, выделяемого при глубинном культивировании, составляло от 90 до 150 мкг/мл культуральной жидкости.

Пример № 2. Выращивание штамма Haemophilis influenzae b № 326 в полу синтетической питательной среде. Посевную культуру готовили аналогично выше описанному способу. Внесение посевного материала проводили в питательную среду, содержащую раствор солей [Klein R.D., Luginbuhl G.H. Simplified media for growth of Haemophilus influenzae from clinical and normal flora sources. J. Gen. Microbiol. 1970, 113: 409-411], факторы роста (гемин, НАД), казеиновый пептон (PEPTON from CASEIN, AppliChem) 20 гр на литр, глюкозу 2 гр на литр. Выращивание проходило при тех же технических условиях. Количество капсульного полисахарида, выделяемого при глубинном культивировании штамма на полусинтетической питательной среде, составляло от 80 до 130 мкг/мл культуральной жидкости.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Anderson P., Pitt J., Smith D.H. Synthesis and release of polyribophosphate by Haemophilus influenzae b in vitro. Infect. Immun. 1976, Feb. 581-589.

2. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М., «Наука», 1983, 139-143.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм Haemophilus influenzae b № 326, депонированный в коллекции ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России под № 289, стабильный продуцент капсульного полисахарида в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2465316

patent-2465316.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/20:
способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс C12P19/04 полисахариды, те соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями

Патенты РФ в классе C12P19/04:
способ получения целлюлозосодержащего продукта, продукт полученный данным способом -  патент 2525142 (10.08.2014)
способ получения жидкой фракции, содержащей изолированные высокомолекулярные капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae, и жидкая фракция, полученная таким способом -  патент 2524436 (27.07.2014)
штамм gluconacetobacter sucrofermentans -продуцент бактериальной целлюлозы -  патент 2523606 (20.07.2014)
ускоренный способ очистки для получения капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae -  патент 2516340 (20.05.2014)
способ получения раствора, содержащего высокомолекулярные изолированные капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae серотипа 19а (варианты) -  патент 2511404 (10.04.2014)
способ получения глюкан-хитозанового комплекса из дрожжевой биомассы отходов пивоваренного производства -  патент 2499836 (27.11.2013)
способ получения липополисахарида возбудителя чумы -  патент 2483112 (27.05.2013)
способ разделения липополисахаридов грамотрицательных бактерий -  патент 2478712 (10.04.2013)
способ подготовки лигноцеллюлозного сырья для получения сахаров и установка для его осуществления -  патент 2475540 (20.02.2013)
способ получения биологического связующего -  патент 2473692 (27.01.2013)

Класс A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела

Патенты РФ в классе A61K39/00:
лекарственное средство для лечения патологического синдрома и способ лечения острых и хронических заболеваний дыхательноый системы и синдрома кашля -  патент 2529783 (27.09.2014)
холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины -  патент 2529772 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины -  патент 2528878 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)
рекомбинантная вакцина на основе инактивированного вирусного вектора -  патент 2528750 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
антагонисты pcsk9 -  патент 2528735 (20.09.2014)
способ лечения больных с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела -  патент 2528641 (20.09.2014)


Наверх