препарат вакцины на основе конъюгата никотин-носитель

Формула изобретения

1. Лиофилизированный препарат для увеличения стабильности конъюгата никотин - вирусоподобная частица, содержащий:

(I) по меньшей мере один конъюгат никотин - вирусоподобная частица, который включает:

(а) вирусоподобную частицу; и

(б) по меньшей мере одну молекулу никотина,

где по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и

(II) композицию стабилизатора, которая включает:

(в) по меньшей мере один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации;

(г) по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации;

и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,8 до 6,6, предпочтительно от 6,0 до 6,4.

2. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором нередуцирующий дисахарид представляет собой сахарозу или трегалозу.

3. Лиофилизированный препарат по п.1 или 2, в котором нередуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу.

4. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором концентрация по меньшей мере одного нередуцирующего дисахарида составляет от 3 до 12% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; и причем предпочтительно концентрация по меньшей мере одного нередуцирующего дисахарида составляет 10% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации.

5. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором в состав композиции стабилизатора входит также наполнитель.

6. Лиофилизированный препарат по п.5, в котором общая концентрация нередуцирующего дисахарида и наполнителя составляет от 0,5 до 15% (мас./об.) где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации, при условии, что концентрация нередуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 0,5% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации.

7. Лиофилизированный препарат по п.5 или 6, в котором наполнитель представляет собой маннит.

8. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0025 до 0,01% (мас./об.), предпочтительно 0,005% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации.

9. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

10. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНКового бактериофага и в котором предпочтительно вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q .

11. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором связующая последовательность представлена в A-CH₂OCO(CH ₂)₂CO-B, где A обозначает молекулу никотина, а B обозначает вирусоподобную частицу.

12. Лиофилизированный препарат по п.11, в котором связующая последовательность ковалентно связана с 3'-положением молекулы никотина.

13. Лиофилизированный препарат по п.1, в котором в состав композиции стабилизатора дополнительно входит гистидин/гистидин-HCl в качестве забуферивающего агента.

14. Лиофилизированный препарат по п.1, где лиофилизированный препарат является стабильным при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 15 недель, предпочтительно, по меньшей мере, 25 недель.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, вакцин и фармацевтических препаратов. В изобретении предложены препараты, которые содержат конъюгат никотина и вирусоподобной частицы и стабилизатор, где стабилизатор содержит нередуцирующий дисахарид и неионогенное поверхностно-активное вещество. Лиофилизированные препараты сохраняют стабильность после длительного хранения при комнатной температуре.

Ссылки на родственные заявки

В настоящее время внимание общественности привлекли вакцины для лечения или предупреждения привыкания к никотину. Эти вакцины, как правило, содержат молекулы никотина, ковалентно связанные с носителем, поскольку никотин представляет собой низкомолекулярное органическое соединение и сам по себе не может вызывать иммунный ответ. Кроме того, поскольку у никотина отсутствуют пригодные для такой связи с носителем функциональные группы, то, как правило, требуется интродукция связующей последовательности в молекулы никотина. В настоящее время имеются сведения о создании нескольких вакцин, см., например, US 5876727, US 6232082, US 6656469 и US 6932971. Описанные конъюгаты различаются не только природой носителя, но также природой связующей последовательности и сайтом в молекуле никотина, в который интродуцируют связующую последовательность.

В US 6932971 описано сочетание молекул никотина с вирусоподобной частицей (ВПЧ) с помощью связующей последовательности со сложноэфирной функциональной группой, что приводит к получению упорядоченного и повторяющегося конюъгата никотин-носитель и позволяет получать высокий титр специфических антител к никотину. В настоящее время эти же авторы установили, что вакцину, которая содержит вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q , с которой молекулы никотина ковалентно сцеплены с помощью связующей последовательности, несущей сложноэфирную функциональную группу, можно эффективно применять для отказа людей от курения (Maurer и др., Eur. J. Immun., 35, 2005, cc. 2031-2040).

Требования, заключающиеся в том, чтобы композиции вакцин обладали стабильностью и чтобы химическое и/или физическое расщепление было минимальным или отсутствовало, обусловливают необходимость в разработке препаратов, удовлетворяющих указанным требованиям.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что можно создавать лиофилизированный препарат, который стабилизирует конъюгаты никотин-вирусоподобная частица, содержащие молекулы никотина, которые ковалентно связаны с вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, несущей по меньшей мере одну функциональную группу эфира карбоновой кислоты. Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что этот лиофилизированный препарат сохраняет стабильность в течение длительного периода хранения при комнатной температуре или даже при повышенной температуре (40°С). Кроме того, лиофилизированный препарат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит простую и экономичную композицию стабилизатора благодаря минимальному количеству входящих в ее состав эксципиентов.

Таким образом, одним из объектов изобретения является лиофилизированный препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, включающую: (в) по меньшей мере один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,4 до 6,6.

Следующим объектом изобретения является способ приготовления лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении.

И еще одним объектом изобретения является восстановленный препарат, содержащий лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, растворенный и/или суспендированный в физиологически приемлемом растворе или в стерильной воде, предпочтительно в воде для инъекций (WFI). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения восстановленный препарат может содержать также адъювант.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные понятия, употребляемые в настоящем описании, имеют общепринятые значения, которые очевидны специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение.

Адъювант. Понятие «адъювант» в контексте настоящего описания относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или субстанциям, которые обеспечивают образование депо в хозяине и при объединении с вакциной и фармацевтической композицией соответственно, предлагаемыми в настоящем изобретении, могут еще в большей степени усиливать иммунный ответ. Можно применять различные адъюванты. Предпочтительными адъювантами являются полный и неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и модифицированный мурамилдипептид. Кроме того, в качестве адъювантов можно применять минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол, а также адъюванты, которые можно применять для введения человеку, такие как БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области. К другим адъювантам, которые можно вводить в сочетании с композициями, предлагаемыми в изобретении, относятся (но не ограничиваясь только ими) монофосфорильный липидный иммуномодулятор, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, соли алюминия (квасцы), MF-59, ОМ-174, ОМ-197, ОМ-294 и адъюванты, созданные на основе виросомальной технологии (Virosomal adjuvant technology). Адъюванты могут также представлять собой смеси указанных субстанций. ВПЧ, как правило, относят к адъюванту. Однако в контексте настоящего описания понятие «адъювант» относится к адъюванту, который не представляет собой ВПЧ, применяемую в предлагаемом в изобретении препарате, а относится к дополнительному, отличному от ВПЧ компоненту.

Оболочечный белок. В контексте настоящего описания понятие «оболочечный белок» и понятие «капсидный белок», которые используются взаимозаменяемо в контексте настоящего описания, относятся к вирусному белку, предпочтительно субъединице встречающегося в естественных условиях капсида вируса, предпочтительно РНКового бактериофага, который обладает способностью встраиваться в вирусный капсид или ВПЧ.

Препарат до лиофилизации. Понятие «препарат до лиофилизации» относится к жидкому препарату, предлагаемому в настоящем изобретении, который подлежит процессу лиофилизации, как правило и предпочтительно, не позднее чем через 24 ч, а также, как правило и предпочтительно, не позднее чем через 8 ч и еще более часто и предпочтительно не позднее чем через 2-4 ч после рассматриваемого момента времени. Понятие «процесс лиофилизации» и понятие «процесс сушки вымораживанием» используются взаимозаменяемо в контексте настоящего описания и должны рассматриваться как синонимы.

Лиофилизированный препарат. Понятие «лиофилизированный препарат» относится к композиции, полученной или которую можно получать с помощью процесса сушки вымораживанием жидкого препарата. Как правило и предпочтительно, он представляет собой твердую композицию, содержание воды в которой менее 5%, предпочтительно менее 3%. Предпочтительно понятие «лиофилизированный препарат» относится к композиции, полученной или которую можно получать с помощью процесса изготовления лиофилизированного препарата, предлагаемого в настоящем изобретении.

Восстановленный препарат. Понятие «восстановленный препарат» относится к жидкому препарату, полученному в результате растворения и/или суспендирования лиофилизированного препарата в физиологически приемлемом растворе.

Связующая последовательность. Понятие «связующая последовательность» в контексте настоящего описания относится к молекулярному элементу, который ковалентно связывает молекулу никотина с вирусоподобной частицей.

Комнатная температура. Понятие «комнатная температура» в контексте настоящего описания относится к температуре от 15 до 30°С, предпочтительно от 20 до 27°С, более предпочтительно 25°С.

Стабильный. Понятие «стабильный» в контексте настоящего описания относится к состоянию лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении, который содержит конъюгаты никотин-ВПЧ, предпочтительно содержит конъюгаты никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q и еще более предпочтительно содержит Nic-Q , в котором при хранении вплоть до 15 недель, предпочтительно вплоть до 20 недель, более предпочтительно вплоть до 25 недель при комнатной температуре или повышенной температуре (40°С) (I) общее содержание свободного никотина и производных никотина составляет менее 7%, предпочтительно менее 5%, более предпочтительно менее 3%, еще более предпочтительно менее 2% от общего содержания никотина в препарате и (II) суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q , предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Q , не превышает более чем на 10%, предпочтительно на 7%, более предпочтительно на 4% суммарное количество олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q , предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Q , в препарате до лиофилизации. Согласно настоящему описанию суммарное количество олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ в препарате после хранения за вычетом суммарного количества олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ до лиофилизации соответствует проценту увеличения. Например, если в препарате до лиофилизации присутствует 1% олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Q , a после лиофилизации согласно настоящему изобретению и 15-недельного хранения присутствует 4% олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Q , то процент увеличения составляет 3%. Понятие «свободный никотин и производные никотина» в контексте настоящего описания относится к никотину и производным никотина, которые не связаны ковалентно с вирусоподобной частицей, предлагаемой в изобретении. Метод определения общего количества никотина, а также свободного никотина или производных никотина предпочтительно представляет собой ОФ-ЖХВР-анализ, изложенный в примере 1 в настоящем описании. Метод определения суммарного количества олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно суммарного содержания олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q , предпочтительно суммарного содержания олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Q , предпочтительно представляет собой анализ фракционирования потока в поле асимметричного потока (AF4), изложенный в примере 1 в настоящем описании, в котором фракции, содержащие частицы, более крупные, чем мономеры и димеры конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно более крупные, чем мономеры и димеры конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q , предпочтительно более крупные, чем мономеры и димеры конъюгатов Nic-Q , объединяют при расчете.

Олигомер. Понятие «олигомер» в контексте «олигомер конъюгата никотин-ВПЧ», «олигомер конъюгата никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q » и «олигомер конъюгата Nic-Q » относится к агрегации по меньшей мере трех и вплоть до десяти ВПЧ или ВПЧ Q соответственно.

Агрегат. Понятие «агрегат» в контексте «агрегат конъюгата никотин-ВПЧ», «агрегат конъюгата никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q » и «агрегат конъюгата Nic-Q » относится к агрегации по меньшей мере десяти ВПЧ или ВПЧ Q соответственно.

Вирусная частица. Понятие «вирусная частица» в контексте настоящего описания относится к морфологический форме вируса. У некоторых типов вируса она содержит геном, окруженный капсидным белком; у других имеет дополнительные структуры (например, оболочки, хвосты и т.д.).

Вирусоподобная частица (ВПЧ) в контексте настоящего описания относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной вирусной частице, или относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной структуре, напоминающей вирусную частицу, предпочтительно капсид вируса. Понятие «нерепликативный» в контексте настоящего описания обозначает отсутствие у генома, входящего в ВПЧ, способности к репликации. Понятие «неинфекционный» в контексте настоящего описания обозначает неспособность проникать в клетку-хозяина. Предпочтительно вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, является нерепликативной и/или неинфекционной, поскольку у нее отсутствует полностью или частично вирусный геном или функции генома. В одном из вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирусную частицу, в которой вирусный геном инактивирован физически или химически. Как правило и более предпочтительно, у вирусоподобной частицы отсутствуют все или часть репликативных и инфекционных компонентов вирусного генома. Вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, может содержать нуклеиновую кислоту из генома, отличного от ее генома. Обычным и предпочтительным вариантом вирусоподобной частицы, предлагаемой в настоящем изобретении, является вирусный капсид, такой как вирусный капсид соответствующего вируса, бактериофага, предпочтительно РНКового фага. Понятия «вирусный капсид» или «капсид» относятся к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка. Как правило, они состоят из 60, 120, 180, 240, 300, 360 и более субъединиц вирусного белка. Как правило и предпочтительно, взаимодействия этих субъединиц приводят к формированию вирусного капсида или напоминающей вирусной капсид структуры с присущей ей повторяющейся организацией, при этом структура, как правило, является сферической или трубчатой. Например, капсиды РНКовых бактериофагов или HbcAg (внутренний (коровый) антиген вируса гепатита В) имеют сферическую форму, обладающую икосаэдральной симметрией. Понятие «капсидоподобная структура» в контексте настоящего описания относится к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка, которая имеет морфологическое строение, сходное с капсидом, как он определен выше, но не имеет характерного симметричного строения, сохраняя при этом достаточную упорядоченность и частоту встречаемости. Одной из общих характерных особенностей вирусной частицы и вирусоподобной частицы является высокая упорядоченность и повторяемость строения их субъединиц.

Вирусоподобная частица РНКового бактериофага. В контексте настоящего описания понятие «вирусоподобная частица РНКового бактериофага» относится к вирусоподобной частице, содержащей или предпочтительно практически состоящей или состоящей из оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНКового бактериофага. Кроме того, вирусоподобная частица РНКового бактериофага, имея структуру РНКового бактериофага, является нерепликативной или неинфекционной, и, как правило, у нее отсутствуют ген или гены, кодирующие комплекс репликации РНКового бактериофага, и, как правило, она лишена также гена или генов, кодирующих белок или белки, которые ответственны за связывание вируса с хозяином или за проникновение в хозяина. Однако под это определение подпадают также вирусоподобные частицы РНКовых бактериофагов, в которых вышеупомянутый(ые) ген(ы) еще присутствует(ют), но является(ются) неактивным(и), и вследствие этого такие частицы также представляют собой нерепликативные и неинфекционные вирусоподобные частицы РНКового бактериофага. Предпочтительные ВПЧ, выведенные из РНКовых бактериофагов, обладают икосаэдральной симметрией и состоят из 180 субъединиц. В контексте настоящего описания понятия «субъединица» и «мономер» используют взаимозаменяемо, и они являются эквивалентными. Предпочтительными методами, с помощью которых вирусоподобной частице РНКового бактериофага придают нерепликативность и/или неинфекционность, являются физическая, химическая инактивация, например УФ-облучение, обработка формальдегидом, как правило и предпочтительно, генетическая манипуляция.

Один или несколько. В контексте настоящего описания упоминание единственного числа может обозначать «по меньшей мере один» или «один или несколько», если не указано иное.

Одним из объектов изобретения является лиофилизированный препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, включающую: (в) по меньшей мере один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,4 до 6,6. В данной области известно, что лиофилизация белковой композиции обычно приводит к получению более стабильного и в результате имеющего более длинное время пролужизни продукта. Кроме того, лиофилизированный препарат имеет повышенную стабильность сложноэфирной функциональной группы, которая присутствует в конъюгате никотин-ВПЧ, и повышенную стабильность компонента, представляющего собой РНК.

Другим объектом изобретения является жидкий препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной ВПЧ с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, которая содержит (в) по меньшей мере один, предпочтительно один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация указанного нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате, (г) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате и где значение рН композиции стабилизатора составляет от 5,4 до 6,6. Кроме того, объектом изобретения является препарат, который можно получать с помощью способа лиофилизации, включающего стадию замораживания указанного жидкого препарата и сушки указанного жидкого препарата.

Еще одним объектом изобретения является жидкий препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной ВПЧ с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, которая содержит или представляет собой (в) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате и где значение рН композиции стабилизатора составляет от 5,4 до 6,6.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, содержит только один углевод, предпочтительно только один сахар, где сахар предпочтительно представляет собой нередуцирующий дисахарид. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит дополнительную аминокислоту. Это означает, что в препарат не вводят никакую дополнительную аминокислоту. Однако препарат может содержать следовые количества аминокислот из-за расщепления вирусоподобной частицы.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит сывороточный белок любого типа. Преимуществом исключения сыворотки является отсутствие потенциальных проблем, связанных с загрязнением препарата.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, в частности лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит хлорида натрия. Исключение NaCl позволяет избежать высокой осмолярности препарата, которая не является необходимой. Кроме того, исключение соли позволяет устранить также возможные побочные действия на стабильность белка в процессе лиофилизации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один, предпочтительно один индивидуальный нередуцирующий дисахарид, представляет собой сахарозу или трегалозу. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нередуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида, составляет от 3 до 15% (мас./об.), предпочтительно от 5 до 12% (мас./об.), предпочтительно от 5 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 7,5 до 10% (мас./об.), предпочтительно 10% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В контексте настоящего описания, если специально не указано иное, концентрация трегалозы относится к концентрации дигидрата (2H ₂O) трегалозы. Специалисту в данной области очевидно, как пересчитать концентрацию дигидрата трегалозы на концентрацию безводной трегалозы. Например, 10% дигидрата трегалозы соответствует 9% безводной трегалозы.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция стабилизатора, присутствующая в жидком или лиофилизированном препарате, предлагаемом в изобретении, предпочтительно лиофилизированном препарате, содержит также один, предпочтительно один индивидуальный наполнитель. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного нередуцирующего дисахарида и наполнителя составляет от 0,5 до 15% (мас./об.) при условии, что концентрация нередуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 0,5% (мас./об.), предпочтительно по меньшей мере 1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата в препарате до лиофилизации. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя составляет от 3 до 10%, предпочтительно от 3 до 8%, предпочтительно от 3 до 7%, предпочтительно от 4,5 до 7%, более предпочтительно от 4,5 до 6% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата в препарате до лиофилизации.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет от 3 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 4,5 до 7% (мас./об.), при этом концентрация указанного нередуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). Предпочтительно осмолярность препарата составляет от 250 до 350 мОсм/кг, более предпочтительно примерно 300 мОсм/кг.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет 3 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 4,5 до 7% (мас./об.), при этом концентрация указанного наполнителя составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). Предпочтительно осмолярность препарата составляет от 250 до 350 мОсм/кг, более предпочтительно примерно 300 мОсм/кг.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет от 3 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 4,5 до 7% (мас./об.), при этом концентрация указанного наполнителя составляет по меньшей мере 1% (мас./об.), а концентрация указанного нерудуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). Предпочтительно осмолярность препарата составляет от 250 до 350 мОсм/кг, более предпочтительно примерно 300 мОсм/кг.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения нерудуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу, а наполнитель представляет собой маннит.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет от 5,0 до 6,5% (мас./об.). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение между наполнителем и нерудуцирующим дисахаридом составляет от 3,5:1 до 4,5:1, предпочтительно 4:1. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения нерудуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу, а наполнитель представляет собой маннит. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация трегалозы составляет 1,1% (мас./об.), а концентрация маннита составляет 4,4% (мас./об.) в препарате до лиофилизации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения наполнитель представляет собой маннит или глицин. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения наполнитель представляет собой маннит. Включение наполнителя, предпочтительно маннита, способствует получению стабильной структуры «кейка» («cake») и может позволять использовать более высокую начальную температуру сушки в процессе лиофилизации, преимуществом этого является снижение стоимости производства.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения значение рН композиции стабилизатора составляет от 5,4 до 6,6, предпочтительно от 5,6 до 6,4, предпочтительно от 5,8 до 6,4, предпочтительно от 6,0 до 6,4, предпочтительно 6,2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения значение рН составляет 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5 и 6,6.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0025 до 0,02% (мас./об.), предпочтительно от 0,0025 до 0,01% (мас./об.), предпочтительно 0,005% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

Вирусоподобные частицы могут представлять собой любой вирус, известный в данной области, обладающий упорядоченной и повторяющейся структурой. Примеры ДНКовых или РНКовых вирусов, оболочечный или капсидный белок которых можно применять для получения ВПЧ, описаны в WO 2004/009124 на странице 25, строки 10-21, на странице 26, строки 11-28, и на странице 28, строка 4, до страницы 31, строка 4. Указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирус, выбранный из группы, включающей а) РНКовые бактериофаги; б) бактериофаги; в) вирус гепатита В, предпочтительно его капсидный белок (Ulrich и др., Virus Res. 50, 1998, сс.141-182) или его поверхностный белок (WO 92/11291); г) вирус кори (Warnes и др., Gene 160, 1995, cc.173-178); д) вирус Синдбис; е) ротавирус (US 5071651 и US 5374426); ж) вирус ящура (Twomey и др., Vaccine 13, 1995, cc.1603-1610); з) вирус Норвалка (Jiang X. и др., Science 250, 1990, cc.1580-1583; Matsui S.M. и др., J.Clin. Invest. 87, 1991, cc.1456-1461); и) альфавирус; к) ретровирус, предпочтительно его белок GAG (WO 96/30523); л) ретротранспозон Ту, предпочтительно белок р1; м) вирус человеческой папилломы (WO 98/15631); н) вирус полиомы; о) вирус табачной мозаики; п) вирус мозаики коровьего гороха; р) вирус домашних стад; с) вирус хлорозной крапчатости коровьего гороха и т) вирус мозаики люцерны. Методы получения ВПЧ на основе вируса хлорозной крапчатости коровьего гороха, вируса мозаики люцерны и вируса мозаики коровьего гороха описаны в US 2005/0260758 и WO 05/067478.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой РНКовый бактериофаг. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения РНКовый бактериофаг выбирают из группы, включающей а) бактериофаг Q ; б) бактериофаг R17; в) бактериофаг fr; г) бактериофаг GA; д) бактериофаг SP; е) бактериофаг MS2; ж) бактериофаг М11; з) бактериофаг МХ1; и) бактериофаг NL95; к) бактериофаг f2; л) бактериофаг РР7 и м) бактериофаг АР205. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q . Методы получения ВПЧ РНКового бактериофага, прежде всего ВПЧ бактериофага Q и ВПЧ бактериофага АР205, описаны на cc.37-47 WO 04009124 и в приведенных в указанной заявке примерах 1 и 21.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой РНКовый бактериофаг Q . В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q рекомбинантно экспрессируют в Е.coli.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ составляет от 0,1 до 2,5 мг/мл, где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ составляет от 0,2 до 2 мг/мл, где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ в жидком препарате, как правило и предпочтительно, выраженная в виде концентрации в препарате до лиофилизации, составляет 0,2, 0,6, 1,0 или 2 мг/мл. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ в жидком препарате, как правило и предпочтительно, выраженная в виде концентрации в препарате до лиофилизации, составляет 0,2 или 0,6 мг/мл, предпочтительно 0,2 мг/мл.

Несколько связующих последовательностей, содержащих функциональные группы эфира карбоновой кислоты, с помощью которых можно ковалентно связывать молекулы никотина с носителем, описаны в US 5876727, US 6656469 и US 6932971. Их конкретное описание включено в настоящее описание в качестве ссылки. Связующие последовательности, которые можно применять в настоящем изобретении и которые содержат сложноэфирную функциональную группу, представляют собой, например, связующие последовательности, обозначенные как CJ2, CJ2.1, CJ2.2, CJ2.3, CJ4, CJ4.1, CJ5, CJ5.1, CJ8, CJ8.1, CJ9 и CJ11, описанные в столбце 17 US 5876727.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения связующая последовательность представлена в A-X-CO(O)-Y-Z-B, где A обозначает молекулу никотина, где B обозначает вирусоподобную частицу и где X обозначает (CH ₂)m, где m обозначает 1-4, Y=(CH₂)n, где n обозначает 1-8, и Z обозначает C(O).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения связующая последовательность содержит, практически состоит или состоит из: CH₂OCO(CH ₂)nCO, где n обозначает 1-8, предпочтительно n обозначает 1-4, предпочтительно n обозначает 1 или 2 и наиболее предпочтительно n обозначает 2. В еще одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения связующая последовательность представлена в A-CH₂OCO(CH₂)₂CO-B, где A обозначает молекулу никотина и где B обозначает вирусоподобную частицу.

Связующую последовательность можно ковалентно связывать либо с пиридиновым, либо с пирролидиновым кольцом молекулы никотина. Их примеры описаны, в частности, в US 5876727, US 6656469 и US 6932971. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения связующую последовательность коваленто связывают с 3'-положением молекулы никотина.

Большинство ковалентно связанных молекул никотина либо имеют одинаковую абсолютную конфигурацию, т.е. все молекулы никотина имеют (R)-конфигурацию или все молекулы никотина имеют встречающуюся в естественных условиях (S)-конфигурацию, либо они присутствуют в виде любой их смеси. Предпочтительно молекулы никотина ковалентно связывают таким образом, что они присутствуют либо в виде примерно равной или равной смеси и (R)-конфигурации и встречающейся в естественных условиях (S)-конфигурации. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат никотин-ВПЧ, входящий в состав препаратов, предлагаемых в изобретении, можно получать или его получают с использованием рацемической смеси молекул никотина или производных никотина, как правило и предпочтительно, с использованием рацемической смеси молекул никотина или производных никотина, которая содержит молекулы никотина с ковалентно связанной связующей последовательностью, предназначенной для осуществления реакции сочетания с вирусоподобной частицей, что позволяет получать конъюгат никотин-вирусоподобная частица, предлагаемый в изобретении.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения конъюгат никотин-ВПЧ, предпочтительно никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Q , предпочтительно Nic-Q , получают, используя в качестве исходного материала O-сукцинил-3'-гидроксиметилникотин и используя в качестве исходного материала ВПЧ Q .

В одном из предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция стабилизатора содержит забуферивающий агент, такой как сукцинат, ацетат, малеат, цитрат, лактат, тартрат, трис, бис-трис, триэтаноламин, трицин, бицин, гистидин, аспартат, глицинат, глутамат, лизин, фталат, формиат, аланин, фенилаланин, аргинин и пролин. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент выбирают из группы, включающей фосфат натрия, фосфат калия и гистидин/гистидин·HCl, ацетат натрия, сукцинат натрия. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация забуферивающего агента составляет 10-20 мМ, где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой фосфат натрия или фосфат калия, предпочтительно фосфат натрия. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой гистидин/гистидин·HCL. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой ацетат натрия. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой сукцинат натрия.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, содержит также хлорид натрия в концентрации от 0 до 90 мМ, предпочтительно от 0 до 60 мМ, более предпочтительно от 0 до 30 мМ. Основная цель включения хлорида натрия заключается в стабилизации жидкого раствора или регулировании осмолярности жидких или лиофилизированных препаратов, предлагаемых в изобретении.

Наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения является лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, который содержит или в другом варианте практически состоит или состоит из: (I) по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композиции стабилизатора, включающей: (в) по меньшей мере один, предпочтительно один индивидуальный нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), предпочтительно от 3 до 12% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (д) забуферивающий агент, где забуферивающий агент предпочтительно выбран из группы, включающей фосфат натрия, фосфат калия, ацетат натрия, сукцинат натрия и гистидин/гистидин·HCl; (е) необязательно 0-30 мМ NaCl, где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,4 до 6,6.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, который содержит или в другом варианте практически состоит или состоит из: (I) по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композиции стабилизатора, включающей: (в) по меньшей мере один, предпочтительно один индивидуальный нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере один, предпочтительно один индивидуальный наполнитель, причем общая концентрация указанного нередуцирующего дисахарида и указанного наполнителя составляет от 0,5 до 15% (мас./об.) при условии, что концентрация указанного нередуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 0,5% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (д) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (е) забуферивающий агент, где забуферивающий агент предпочтительно выбран из группы, включающей фосфат натрия, фосфат калия, ацетат натрия, сукцинат натрия и гистидин/гистидин·HCl; (ж) необязательно 0-30 мМ NaCl, где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,4 до 6,6.

Одним из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения является лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, который содержит или в другом варианте практически состоит или состоит из: (I) по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица, предпочтительно по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица РНКового бактериофага, предпочтительно по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица РНКового бактериофага Q , еще более предпочтительно конъюгата Nic-Q , который включает: (а) вирусоподобную частицу, предпочтительно вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q , причем концентрация указанного конъюгата составляет предпочтительно от 0,1 до 2 мг/мл, предпочтительно от 0,2 до 1 мг/мл, где концентрация представляет собой концентрацию в продукте до лиофилизации; и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей, предпочтительно вирусоподобной частицей РНКового бактериофага Q , с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композиции стабилизатора, включающей: (в) по меньшей мере один, предпочтительно один индивидуальный нередуцирующий дисахарид, предпочтительно трегалозу, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 5 до 12% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, предпочтительно полисорбат 20, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (д) забуферивающий агент, где забуферивающий агент предпочтительно выбран из группы, включающей фосфат натрия, фосфат калия, ацетат натрия, сукцинат натрия и гистидин/гистидин·HCl; более предпочтительно гистидин/гистидин·HCl; и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,6 до 6,2.

Настоящее изобретение относится к лиофилизированному препарату, который содержит или в другом варианте состоит из: (I) по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу, предпочтительно вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q ; и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность представлена в A-CH ₂OCO(СН₂)₂СО-В, где А обозначает молекулу никотина и где В обозначает вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q , и где связующая последовательность ковалентно связана с 3'-положением молекулы никотина; и (II) композиции стабилизатора, включающей: (в) один нередуцирующий дисахарид, где указанный нередуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу, причем концентрация трегалозы составляет 10% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) одно неионогенное поверхностно-активное вещество, где указанное неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20, причем концентрация полисорбата составляет 0,005% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет 6,2.

Настоящее изобретение относится к лиофилизированному препарату, который содержит или в другом варианте состоит из: (I) по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу, предпочтительно вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q ; и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность представлена в А-СН ₂ОСО(СН₂)₂СО-В, где А обозначает молекулу никотина и где В обозначает вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q , и где связующая последовательность ковалентно связана с 3'-положением молекулы никотина; и (II) композиции стабилизатора, которая практически состоит или состоит из: (в) одного нередуцирующего дисахарида, где указанный нередуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу, причем концентрация трегалозы составляет от 10% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) одного неионогенного поверхностно-активного вещества, где указанное неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20, причем концентрация полисорбата составляет 0,005% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (д) одного забуферивающего агента, где указанный забуферивающий агент представляет собой фосфат натрия или гистидин/гистидин·HCl, причем концентрация фосфата натрия или гистидина/гистидина·HCl составляет 20 мМ; и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет 6,2.

Еще одним очень предпочтительным вариантом осуществления изобретения является лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, который содержит или в другом варианте практически состоит или состоит из: (I) по меньшей мере одного конъюгата никотин-вирусоподобная частица, включающего: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композиции стабилизатора, которая практически состоит или состоит из: (в) по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида, причем концентрация указанного нередуцирующего дисахарида составляет от 5 до 15% (мас./об.), предпочтительно 10% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального неионогенного поверхностно-активного вещества, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), предпочтительно 0,005%, где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (д) забуферивающего агента, где указанный забуферивающий агент предпочтительно выбран из ацетата натрия, сукцината натрия и гистидина/гистидина·HCl; (е) необязательно 0-30 мМ NaCl, где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет 6,0 до 6,4, предпочтительно 6,2.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения лиофилизированный продукт, предлагаемый в изобретении, сохраняет стабильность в течение по меньшей мере 15 недель, предпочтительно по меньшей мере 25 недель, при комнатной температуре или даже при повышенной температуре (40°С).

Одним из объектов настоящего изобретения является восстановленный препарат, содержащий лиофилизированную композицию, предлагаемую в изобретении, растворенную и/или суспендированную в физиологически приемлемом растворе или в стерильной воде, предпочтительно в воде для инъекций. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения раствор представляет собой раствор NaCl. Предпочтительно восстановленный препарат имеет физиологически приемлемое значение осмолярности.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения восстановленный препарат содержит адъювант. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения адъювант представляет собой гидратированные гели на основе гидроксида алюминия или гидратированные гели на основе фосфата алюминия.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых: (I) замораживают препарат до лиофилизации путем снижения температуры на полке до уровня ниже -35°С, предпочтительно ниже -38°С, предпочтительно ниже -40°С, предпочтительно ниже -45°С и предпочтительно ниже -50°С; (II) осуществляют первичную сушку препарата при температуре на полке от -45 до -15°С, предпочтительно от -40 до -20°С, предпочтительно от -35 до -25°С, при давлении в камере ниже 0,2 мбара; (III) осуществляют вторичную сушку препарата при температуре на полке от 10 до 40°С, предпочтительно от 10 до 30°С, при давлении в камере ниже 0,2 мбара. Способ необязательно заключается в том, что осуществляют стадию сушки препарата при температуре на полке от -30 до -15°С, предпочтительно при -20°С, после стадии (II), при давлении в камере ниже 0,2 мбара.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения давление в камере в процессе первичной и вторичной сушки составляет от 0,005 до 0,2 мбара, предпочтительно от 0,020 до 0,2 мбара, предпочтительно от 0,03 до 0,1 мбара, предпочтительно от 0,040 до 0,05 мбара.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения снижение температуры на полке осуществляют со скоростью от 0,1 до 1,0°С/мин, предпочтительно от 0,5 до 1,0°С/мин.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, включает стадии, на которых: (I) замораживают препарат до лиофилизации путем снижения температуры на полке ниже -40°С, предпочтительно ниже -50°С; (II) осуществляют первичную сушку препарата при температуре на полке -35°С в течение по меньшей мере 10 ч, предпочтительно 20 ч, при давлении в камере ниже 0,2 мбара; (III) осуществляют вторичную сушку препарата при температуре на полке от 10 до 30°С при давлении в камере ниже 0,2 мбара. Способ необязательно заключается в том, что осуществляют стадию сушки препарата при температуре на полке -20°С после стадии (II) при давлении в камере ниже 0,2 мбара.

Одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения является способ получения лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых: (I) замораживают препарат до лиофилизации путем снижения температуры на полке ниже -40°С, предпочтительно до -50°С; (II) осуществляют первичную сушку препарата при температуре на полке -35°С в течение по меньшей мере 25 ч; повышают температуру на полке и сушат препарат при температуре на полке -20°С, предпочтительно в течение 10 ч, при давлении в камере ниже 0,2 мбара, предпочтительно при 0,045 мбара; (III) осуществляют вторичную сушку препарата при температуре на полке 20°С при давлении в камере ниже 0,2 мбара; предпочтительно при 0,045 мбара.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, предусматривает дополнительную стадию ренатурации, предпочтительно при температуре от -10 до -20°С, как правило, в течение от 2 до 5 ч, после замораживания препарата согласно одному из процессов замораживания, описанных в изобретении. Указанную стадию ренатурации предпочтительно используют, когда композиция стабилизатора, предлагаемая в изобретении, дополнительно содержит по меньшей мере один наполнитель, такой как маннит или глицин.

Следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ получения лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых: (I) замораживают препарат до лиофилизации путем снижения температуры на полке ниже -40°С, предпочтительно до -50°С, при давлении в камере ниже 0,2 мбара, предпочтительно при 0,045 мбара; (II) необязательно осуществляют ренатурацию при -15°С; (III) осуществляют первичную сушку препарата при температуре на полке -15°С, предпочтительно в течение 20 ч; (IV) осуществляют вторичную сушку препарата при температуре на полке 40°С, при давлении в камере ниже 0,2 мбара, предпочтительно при 0,0075 мбара.

Примеры

Пример 1

Материалы и методы

«Nic-Q » - понятие «Nic-Q » в контексте настоящего описания относится по меньшей мере к одному конъюгату никотин-вирусоподобная частица, который содержит (а) вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность представлена в А-CH ₂OCO(СН₂)₂СО-В, где А обозначает указанную молекулу никотина и где В обозначает вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Q , и где связующая последовательность ковалентно связана с 3'-положением указанной молекулы никотина. Nic-Q можно получать с помощью метода, описанного в примере US 6932971. Nic-Q в виде лекарственной субстанции подвергали оттаиванию при комнатной температуре.

Протоколы сушки вымораживанием

Таблица 1
Процесс I сушки вымораживанием
Стадия	Время [ч]	Температура [°С]	Давление [мбар]
Загрузка	0:00:00	20	1013
Замораживание	1:10:00	-50	1013
3:00:00	-50	1013
Первичная сушка	0:01:00	-50	0,045
0:15:00	-35	0,045
20:00:00	-35	0,045
Вторичная сушка	2:30:00	-20	0,045
10:00:00	-20	0,045
1:20:00	20	0,045
10:00:00	20	0,045

Таблица 2
Процесс II сушки вымораживанием
Стадия	Время [ч]	Температура [°С]	Давление [мбар]
Загрузка	0:00:00	20	1013
Замораживание	1:10:00	-50	1013
3:00:00	-50	1013
Первичная сушка	0:01:00	-50	0,045
4:00:00	-15	0,045
20:00:00	-15	0,045
Вторичная сушка	0:01:00	-15	0,007
6:00:00	40	0,007
10:00:00	40	0,007

Восстановление лиофилизатов

Как известно специалисту в данной области, для некоторых из описанных ниже анализов лиофилизаты необходимо превращать в водный раствор. Поэтому лиофилизаты восстанавливали с использованием стерильной фильтрованной воды, как правило и предпочтительно, с использованием такого объема стерильной фильтрованной воды, чтобы довести общий объем до объема препарата до лиофилизации. Например, если объем препарата до процесса лиофилизации составлял 0,7 мл на пузырек, то затем образовавшийся в результате процесса лиофилизации «кейк» предпочтительно восстанавливали таким объемом стерильной воды, чтобы объем конечной композиции опять составлял 0,7 мл.

Анализ фракционирования потока в поле асимметричного потока (AF4) для оценки агрегатов ВПЧ

АР4-анализы проводили с использованием разделяющего канала типа Wyatt с 350 микрометровой вставкой, системы для разделения Eclipse2 (фирма Wyatt Technology Corporation), изократического насоса типа Agilent 1100 G1310A, дегазатора типа Agilent 1100 G1379A, автосэмплера типа Agilent 1100 G1329A, Agilent 1100 G1330B термостата для автосэмплера, детектора типа Agilent 1100 G1365B MWD, RI-детектора типа Agilent 1100 G1362A и детектора типа Wyatt DAWN EOS MALS.

Скорость потока в канале составляла 1,5 мл/мин. Скорость поперечного потока составляла 2,0 мл/мин в течение 18 мин, после чего ее снижали до 0,15 мл/мин в течение 15 мин и выдерживали в течение 5 мин на уровне 0,15 мл/мин. На конечной стадии скорость поперечного потока составляла 0,0 мл/мин в течение 5 мин.

Концентрацию ВПЧ определяли при 260 нм с помощью MWD-детектора. Для определения гидродинамического радиуса и молекулярной массы видов ВПЧ применяли детектор Wyatt DAWN EOS MALS. В систему для измерения AF4 инъецировали ВПЧ в жидких препаратах и восстановленных лизатах (восстановленных водой согласно описанному выше методу) соответственно в количестве, составляющем примерно 20 мкг.

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для определения температуры стеклования

ДСК-анализы проводили с помощью дифференциального сканирующего калориметра типа 204 Phoenix фирмы Netzsch. В алюминиевые чашки отвешивали, как правило, по 1-25 мг образца. Затем чашки плотно закрывали алюминиевыми крышками с помощью универсального обжимного пресса. Применяемая для сравнения чашка оставалась пустой, и ее подготавливали аналогичным образом. Чашки помещали в ячейку для измерения. Ячейку продували азотом. Анализ образцов проводили при скорости нагревания 10°С/мин.

Температуру стеклования, Tg, лиофилизатов определяли с помощью индивидуальных ДСК-сканов.

Анализ содержания воды

Оценку содержания влаги в лиофилизатах проводили с помощью кулонометрического титратора Карла Фишера, снабженного печью, находящейся в модуле Head-Space (фирма Analytic Jena AG). Лиофилизаты анализировали непосредственно в стеклянных флаконах 2R при температуре в модуле Head-Space, составляющей 80°С. Образцы нагревали в камере печи по меньшей мере в течение 5 мин.

Анализ методом динамического рассеяния света (ДРС) для определения гомогенности препарата

Анализы методом динамического рассеяния света проводили с помощью устройства типа Malvern Zetasizer Nano ZS. С помощью пипетки вносили по 0,5-1,0 мл жидкого препарата или восстановленных лиофилизатов (восстановленных согласно описанному выше методу) в УФ-микрокюветы типа Plastibrand и оценивали с использованием разработанного Университетом Людвига-Максимилиана (LMU) г. Мюнхена стандартного протокола (SOP protein_m_99%). Рассчитывали показатель полидисперсности PI, долю основного пика Nic-Q и размер основного пика с применением моделей конверсии объема и интенсивности.

Измерения блокировки света для определения уровня загрязнения частицами и агрегатами ВПЧ

Измерения блокировки света проводили с помощью устройств типа PAMAS SVSS-C. Через систему пропускали часть препарата и затем в образцах жидкого препарата или восстановленных лиофилизатов объемом 0,1-0,3 мл оценивали уровень загрязнения частицами. Раствор пропускали через измерительную ячейку и определяли в 1 мл количество частиц, размер которых составлял более 1, 10 и 25 мкм.

Анализ целостности РНК с помощью ГФ (гель-фильтрация)-ЖХВР

Частицы гомогенизировали в TRI-реагенте (комбинация фенола и тиоцианата гуанидина в однофазном растворе, предназначенная для ингибирования РНКазной активности), а затем экстрагировали РНК с помощью 1-бром-3-хлорпропана (ВСР) - реагента для разделения фаз. Экстрагированную РНК осаждали изопропанолом и дебрис промывали этанолом. Затем РНК растворяли в DEPC-H₂O и анализировали с помощью ЖХВР (мониторинг осуществляли при А_260нм , изократическая элюция). Время удерживания экстрагированной РНК определяли относительно стандарта тРНК в этих же сериях.

Анализ свободного никотина с помощью ОФ-ЖХВР

Раствор никотиновых производных гидроксиметилникотина (продукт гидролиза эфирной связи) и сукцинилгидроксиметилникотина (продукт расщепления амидной связи) выделяли из Nic-Q путем фильтрации во вращающихся фильтрах. Проходящий поток анализировали с помощью ОФ-ЖХВР (А_260нм - длина волны абсорбции для никотина и производных никотина). Концентрацию производных никотина рассчитывали с помощью регрессионного анализа полученной параллельно стандартной кривой для никотина. Данные для свободного никотина представлены в виде процента по отношению к данным для общего никотина.

Анализ общего никотина с помощью ОФ-ЖХВР

Фрагмент никотина, ковалентно связанный с белком Q , количественно отщепляли при инкубации в течение 3 ч при 40°С и значении рН>11, после чего белок осаждали. Продукт гидролиза, т.е. гидроксиметилникотин, оставался в супернатанте, и его количественно определяли с помощью ОФ-ЖХВР (А_260нм ), используя стандартную кривую для никотина, поскольку как продукт гидролиза, так и никотин входили в один и тот же хромофор.

Анализ целостности ВПЧ с помощью ГФ-ЖХВР

ГФ-ЖХВР представляет собой аналитический метод разделения различных соединений в образце на основе их размера. Так, крупные частицы Q можно отделять от более мелких молекул, например мономеров оболочечного белка Q или фрагментов нуклеиновых кислот, и поэтому данный метод применяли для подтверждения целостности ВПЧ. Этот метод применяли также для подтверждения чистоты лекарственной субстанции. Используемую в качестве контроля стандартную ВПЧ анализировали вместе с образцом в этих же сериях. Обнаружение осуществляли при 260 нм. Связанные с продуктом загрязнители могут представлять собой белковые агрегаты, более мелкие продукты расщепления и/или нуклеиновые кислоты. Все указанные связанные с продуктом загрязнители выявляли с помощью ГФ-ЖХВР, для этого метода установлено, что с его помощью можно отделять указанные загрязнители от пика, соответствующего требуемому продукту. Обнаружение проводили при длине волны 260 нм.

Оценка степени мутности

Степень опалесценции жидких растворов образцов определяли с помощью лабораторного турбидиметра (2100 AN, фирма НАСН). Оценку степени мутности осуществляли по коэффициенту мутности, который определяли в виде соотношения пропущенного света и света, рассеянного частицами в растворе образца. Прибор калибровали с использованием стандартных суспензий для определения мутности, содержащих формазин, в определенных опытных ячейках. Для анализа образцов в объемах, составляющих 1-5 мл, которые находились в меньших опытных пробирках, экспериментатор получал калибровочную кривую в диапазоне 0-200 NTU (нефелометрические единицы мутности). Образец объемом 1 мл анализировали в одноразовых стеклянных пробирках, в которые добавляли силиконовое масло для снижения эффектов рассеяния, вызываемых стеклом.

Измерение пропускания света с помощью VIS

Измерение пропускания света осуществляли с помощью двухлучевого визуального УФ-спектрофотометра UV1 (фирма Thermo Spectronic). С помощью пипетки вносили по 0,5-1,0 мл жидкого препарата в УФ-микрокюветы типа Plastibrand. Пропускание света определяли при 600 нм.

Пример 2

Воздействие рН на стабильность Nic-Q

Стабильность Nic-Q анализировали при десяти различных значениях рН в диапазоне от 4,6 до 8,2. Значение рН партии продукта регулировали, используя либо 0,1 н. раствор NaOH, либо 0,1 н. раствор H₃PO ₄. Все образцы разводили до концентрации 1 мг/мл Nic-Q с помощью воды. Образцы хранили при комнатной температуре в течение периода времени вплоть до 14 дней. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты опытов по оценке стабильности Nic-Q при разных значениях рН
рН	ОФ-ЖХВР Содержание свободных производных никотина [% от общего никотина] в день 7	ГФ-ЖХВР Основной пик Относительная площадь пика в день 7	PI	ДСР Основной пик (определен на основе модели конверсии интенсивности) [%]
4,6	1,7	98,5	0,26	82,9
5,0	1,5	98,2	0,23	89,8
5,4	1,9	97,8	0,20	93,6
5,8	1,6	97,3	0,21	91,8
6,2	3,1	97,1	0,19	94,3
6,6	3,9	96,6	0,17	94,0
7,0	7,2	96,3	0,14	98,9
7,4	11,1	91,4	0,12	100,0
7,8	22,6	89,1	0,08	100,0
8,2	34,8	84,0	0,10	100,0

Химическую стабильность Nic-Q исследовали с помощью методов ОФ-ЖХВР и ГФ-ЖХВР. Химическая нестабильность Nic-Q приводит к расщеплению ВПЧ на мономеры или мультимеры оболочечного белка Q и/или диссоциации никотина и ВПЧ Q .

Содержание свободных производных никотина возрастало при повышении значений рН. При значениях рН от 4,6 до 6,2 обнаружено лишь незначительное увеличение свободных производных никотина. При значениях рН выше 6,2 количество свободных производных никотина быстро возрастало в зависимости от времени хранения. Кроме того, на целостность ВПЧ оказывало отрицательное воздействие повышение значений рН. При значениях рН, равных или превышающих 7,4, по данным ГФ-ЖХВР целостность капсида Q резко снижалась через 7 дней. Относительное содержание Nic-Q при рН 7,0 после 7 дней хранения при комнатной температуре составляло около 96%, а при значении рН 7,4 - около 91%.

Физическую стабильность Nic-Q исследовали с помощью измерений блокировки света, ДСР-анализа и измерений пропускания света с помощью VIS.

Физическая стабильность Nic-Q . понятие «физическая стабильность Nic-Q » в контексте настоящего описания относится к агрегации ВПЧ Q . С помощью всех трех аналитических методов установлено, что Nic-Q имеет тенденцию к агрегации при значениях рН, равных или более низких чем 5,8. С помощью ДСР-анализа установлено, что доля основного пика снижалась, в то время как пик, соответствующий агрегатам и олигомерам ВПЧ, возрастал, и показатель полидисперсности (PI) возрастал при значениях рН, равных и более низких чем 5,8. Результаты, полученные с помощью измерений блокировки света и измерений пропускания света с помощью VIS, подтвердили данные о том, что по мере уменьшения значения рН Nic-Q имели тенденцию к агрегации.

Пример 3

Воздействие стресса, связанного с замораживанием/оттаиванием, на стабильность Nic-Q

Всего 36 различных препаратов Nic-Q подвергали циклам замораживания/оттаивания. Образцы замораживали при -80°С и подвергали оттаиванию при 20-25°С. Указанный цикл замораживания/оттаивания повторяли 5 раз. Препараты анализировали до и после циклов замораживания/оттаивания с помощью ДСР-анализа и анализа блокировки света.

Воздействие трегалозы и добавления полисорбата 20

Исследовали препараты, содержащие 0,2 мг/мл Nic-Q , либо 0, либо 10% трегалозы, рН 6,4, 30 мМ NaCl с добавлением 0,005% полисорбата 20 или без него. Результаты, полученные с помощью ДСР-анализов для препаратов, которые содержали трегалозу, но не содержали полисорбата, показали небольшое снижение основного пика и увеличение PI. Таким образом, добавление трегалозы приводило к небольшому увеличению уровня агрегации Nic-Q . Однако это действие можно было предотвращать добавлением полисорбата 20. Результаты, полученные с помощью измерений блокировки света, подтвердили данные, полученные с помощью ДСР-анализов. Существенное снижение количества частиц размером >1 мкм обнаружено в содержащих полисорбат 20 препаратах после замораживания/оттаивания по сравнению с количеством частиц размером >1 мкм в препаратах без полисорбата.

Воздействие различных концентраций NaCl и добавления полисорбата 20

Исследовали препараты, содержащие 0,2 мг/мл Nic-Q , 10% трегалозы, рН 6,4, различные концентрации NaCl с добавлением 0,005% полисорбата 20 или без него. Результаты, полученные с помощью ДСР-анализов, показали, что NaCl оказывал воздействие на уровень агрегации Nic-Q после замораживания/оттаивания. Значения PI растворов возрастали с повышением концентраций NaCl после циклов замораживания/оттаивания. Таким образом, физическая стабильность Nic-Q существенно снижалась при повышении концентраций NaCl. Однако при добавлении полисорбата 20 эту физическую нестабильность можно было компенсировать при концентрациях NaCl, равных или более низких чем 90 мМ. Эти результаты были подтверждены с помощью анализов блокировки света. После замораживания/оттаивания в препаратах без полисорбата обнаружено существенное увеличение количества частиц размером более 1 мкм, что свидетельствует о повышении количества агрегатов. Добавление полисорбата 20 предупреждало агрегацию, поскольку практически не обнаружено частиц размером более 1 мкм.

Воздействие различных значений рН и добавления полисорбата 20

Исследовали воздействие значений рН в диапазоне от 5,4 до 7,2 на стабильность препаратов в присутствии полисорбата 20 или без него. Исследовали препараты, содержащие 0,2 мг/мл Nic-Q , 10% трегалозы, различные значения рН, 30 мМ NaCl, с добавлением 0,005% полисорбата 20 или без него. Результаты подтвердили данные, полученные в опыте по оценке стабильности при разных значениях рН, которые приведены в примере 2. Уже в процессе приготовления растворов препаратов доля основного пика Nic-Q снижалась по мере уменьшения значений рН, что установлено на основе ДСР-анализов с использованием модели конверсии объема. С другой стороны, значения PI возрастали. Добавление полисорбата 20 предупреждало агрегацию Nic-Q при изученных значениях рН 6,4 и 7,2. Кроме того, добавление полисорбата 20 снижало агрегацию Nic-Q при рН 5,4. Помимо ДСР-анализов эти результаты подтверждены с помощью анализов блокировки света. Вышеописанные результаты, полученные в этом опыте по оценке влияния различных значений рН, с помощью ДСР-анализов и измерений блокировки света, согласовались друг с другом при использовании концентраций NaCl 30, 60, 90 и 150 мМ.

Пример 4

Воздействие различных композиций на стабильность Nic-Q при сушке вымораживанием

Nic-Q подвергали оттаиванию при комнатной температуре. Различные препараты (представленные на фиг.1) с различными концентрациями Nic-Q , трегалозы, полисорбата, NaCl и с различными буферными системами получали путем добавления пипеткой Nic-Q в маточные растворы эксципиентов. Растворы перемешивали с помощью магнитной мешалки типа IKA в течение 5-10 мин. Конечные растворы лекарственных средств стерилизовали фильтрацией (мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм) и затем лиофилизировали.

В целом, метод состоял в следующем. Растворы лекарственных средств фильтровали в стерильные стеклянные пузырьки 2R. Отбирали по 0,7 мл препаратов F29RL, F48RL и F49RL и вносили в пузырьки. Другие препараты вносили из расчета по 0,6 мл на пузырек. На пузырьки помещали покрытые полидиметилсилоксаном и ЭТФЭ (этилентетрафторэтилен) крышки для лиофилизации (фирма West Pharmaceutical Services). Пузырьки переносили в камеру для лиофилизации сублимационной сушилки типа Christ Epsilon 2-12 D (фирма Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). Температуру на полке понижали со скоростью от 0,5 до 1,0°С/мин до -40°С и поддерживали на уровне ниже -40°С в течение 3 ч. Затем давление в камере понижали до 0,045 мбара, температуру на полке изменяли до -35°С со скоростью 1°С/мин и поддерживали в течение 20 ч. После этого температуру на полке повышали до -20°С со скоростью 0,1°С/мин и поддерживали в течение 10 ч. Затем температуру на полке повышали до 20°С со скоростью 0,5°С/мин и поддерживали в течение 10 ч. Затем в камеру для лиофилизации впускали воздух с профильтрованным сухим азотом до достижения давления 800 мбар и пузырьки закрывали крышками в камере для лиофилизации. Пузырьки удаляли из камеры и запечатывали с помощью герметика Flip-Off^®. После сушки вымораживанием были получены стабильные лиофилизаты с удовлетворительной структурой «кейка».

Результаты представлены на фиг.2. Так, во всех лиофилизатах препаратов, содержащих до лиофилизации Nic-Q в различных концентрациях (были изучены концентрации от 0,2 до 2,0 мг/мл), трегалозы (были изучены концентрации от 5 до 10%), полисорбата (были изучены концентрации от 0,005 до 0,01%), NaCl (были изучены концентрации от 0 до 60 мМ), содержание влаги составляло менее 1%. Суммарное количество олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q в вышеуказанных препаратах не повышалось более чем до 1% после сушки вымораживанием по сравнению с препаратом до сушки вымораживанием, что выявлено с помощью AF4-анализов. По данным ДСР-анализов показатели полидисперсности (PI) в этих препаратах оказались одинаковыми и составляли ниже 0,2, а доля основного пика Nic-Q составляла более 98,5% соответственно при определении с помощью модели конверсии объема. Проведенные аналитические исследования позволили сделать заключение о том, что вышеуказанный состав препаратов позволял стабилизировать Nic-Q при использовании концентраций от 0,20 до 2 мг/мл.

Препарат F22RL, в состав которого не входил полисорбат 20, имел значение показателя полидисперсности (PI) около 0,35. Кроме того, суммарное количество олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q возрастало в нем примерно на 5,5% после сушки вымораживанием по сравнению с препаратом до сушки вымораживанием. Эти результаты свидетельствуют о том, что неионогенное поверхностно-активное вещество необходимо для предотвращения агрегации ВПЧ.

В состав препаратов F08RL, F39RL, F37RL, F38RL входил хлорид натрия в концентрации 30, 60, 90 и 150 мМ соответственно. Хотя присутствие полисорбата 20 компенсировало воздействие NaCl (в концентрации, равной и более низкой чем 60 мМ) на физическую стабильность Nic-Q , в F08RL и F39RL не обнаружено существенного увеличения количества олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q после лиофилизации), присутствие полисорбата 20 лишь частично компенсировало воздействие NaCl в концентрациях, равных и превышающих 90 мМ, поскольку в этом случае суммарные количества олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q возрастали на 2,8 и 3,5% после сушки вымораживанием. Кроме того, присутствие NaCl в концентрациях, равных или превышающих 90 мМ, приводило к получению величины осмолярности более 400 мОсм/кг.

Пример 5

Оценка композиций, содержащих маннит/трегалозу в качестве стабилизаторов Nic-Q , в процессе сушки вымораживанием

Таблица 4
Препараты
Препарат	Nic-Q	Полисорбат 20	Буфер и молярность	Маннит	Дигидрат трегалозы	рН
[мг/мл]	[%]	[мМ]	[%]	[%]
F30RL	1,0	0,005	фосфат калия 20	4,0	1,0	6,2
F32RL	1,0	0,005	фосфат калия 20	5,3	1,3	6,2
F42RL	1,0	0,005	фосфат натрия 20	4,4	1,1	6,2
F54RL	1,0	0,005	фосфат натрия 20	5,0	0,0	6,2

Приготавливали четыре препарата (F30RL, F32RL, F42RL, F54RL, фиг.1), практически аналогично методу, описанному в примере 4. Объем заполнения пузырьков составлял 0,6 мл. Препараты F30RL, F32RL и F42RL быстро лиофилизировали в следующих условиях: температуру на полке снижали со скоростью 1,0°С/мин до -50°С и поддерживали на уровне -50°С в течение 3 ч. Давление в камере затем снижали до 0,045 мбара, температуру изменяли до -15°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 20 ч. В другом варианте препараты F42RL и F54RL лиофилизировали с использованием такого же процесса сушки вымораживанием, но с добавлением стадии ренатурации, которую проводили при -15°С в течение 2 ч. Затем давление в камере снижали до 0,007 мбара, температуру на полке изменяли до 40°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 10 ч. Затем в камеру для лиофилизации впускали воздух с профильтрованным сухим азотом до достижения давления 800 мбар и пузырьки закрывали крышками в камере для лиофилизации. Пузырьки удаляли из камеры и запечатывали с помощью герметика Flip-Off^®.

Результаты частично представлены на фиг.2. После лиофилизации удавалось получать стабильные лиофилизаты и требуемую структуру «кейка». Содержание влаги в трех лиофилизированных препаратах, как правило, составляло менее 0,3%. Осмолярность препаратов, как правило, составляла от 250 до 340 [мОсм/кг]. Осмолярность увеличивалась с повышением концентраций трегалозы и маннита.

Группа содержащих маннит препаратов F30RL, F32RL и F42RL, полученных без использования стадии ренатурации, была аморфной или частично аморфной. Группа содержащих маннит препаратов F42RL и F54RL, полученных с использованием стадии ренатурации, была кристаллической после сушки вымораживанием.

В препаратах F30RL, F32RL и F42RL не обнаружено существенного увеличения суммарных количеств олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q после сушки вымораживанием по данным AF4-анализов. С помощью ДСР-анализов установлено, что в трех препаратах показатель полидисперсности (PI) составлял менее 0,2, а доля основного пика Nic-Q , как правило, составляла более 99%, что установлено с использованием модели конверсии объема. В препарате F54RL не удалось обнаружить увеличения суммарных количеств олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q после сушки вымораживанием с помощью АF4-анализов.

Анализы блокировки света позволили установить, что количество загрязняющих частиц в восстановленных лиофилизатах, как правило, составляло менее 100 частиц размером >10 мкм на мл, а количество частиц размером >1 мкм, как правило, составляло менее 2000 частиц на мл. Эти результаты свидетельствуют о том, что смесь трегалозы и наполнителя, такого как маннит, может стабилизировать Nic-Q в процессе сушки вымораживанием.

Пример 6

Оценка стабильности высушенных вымораживанием препаратов Nic-Q

Пять препаратов, т.е. F42RL, F35RL, F10RL, F16RL и F54RL, приготавливали практически аналогично методу, описанному в примере 4 и примере 5. Объем заполнения пузырьков составлял 0,6 мл.

Препараты, содержащие только трегалозу (F35RL, F10RL, F16RL) лиофилизировали в следующих условиях: температуру на полке снижали со скоростью 1,0°С/мин до -50°С и поддерживали на уровне -50°С в течение 3 ч. Затем давление в камере снижали до 0,045 мбара, температуру изменяли до -15°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 25 ч. Затем температуру на полке изменяли до -20°С со скоростью 0,1°С/мин и поддерживали в течение 10 ч. Затем температуру на полке повышали до 20°С скоростью 0,5°С/мин и поддерживали в течение 10 ч.

Препарат, содержащий и трегалозу, и маннит (F42RL), лиофилизировали в следующих условиях: температуру на полке снижали со скоростью 1,0°С/мин до -50°С и поддерживали на уровне -50°С в течение 3 ч. Затем давление в камере снижали до 0,045 мбара, температуру изменяли до -15°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 20 ч. Затем давление в камере снижали до 0,007 мбара и температуру на полке изменяли до 40°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 10 ч.

Препарат, содержащий только маннит (F54RL), лиофилизировали в следующих условиях: температуру на полке снижали со скоростью 1,0°С/мин до -50°С и поддерживали на уровне -50°С в течение 2 ч. Затем осуществляли стадию ренатурации при -15°С в течение 2 ч. Температуру на полке снижали до -50°С и поддерживали на уровне -50°С в течение 2 ч. Затем давление в камере снижали до 0,045 мбара, температуру изменяли до -15°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 20 ч. Затем давление в камере снижали до 0,007 мбара и температуру на полке изменяли до 40°С со скоростью 0,15°С/мин и поддерживали в течение 10 ч.

После лиофилизации удавалось получать стабильные лиофилизаты всех высушенных вымораживанием препаратов и требуемую структуру «кейка».

Образцы хранили при 2-8°С, 25°С и 40°С вплоть до 25 недель. Результаты аналитических исследований представлены на фиг.3. Структура «кейка» лиофилизатов всех препаратов, содержащих трегалозу или трегалозу/маннит, оказалась стабильной в процессе хранения, даже при повышенных температурах. Этот результат получен для всех условий и продолжительности хранения. Температура стеклования лиофилизатов без маннита, как правило, составляла от 60 до 110°С и не изменялась существенно в процессе хранения. Осмолярность препаратов составляла от 300 до 350 [мОсм/кг].

Начальное содержание влаги в лиофилизированных препаратах составляло менее 1,0%. Содержание влаги лиофилизатов, хранившихся при 2-8°С и 25°С оказалось постоянным при хранении в течение 25 недель, при этом содержание воды повышалось менее чем на 0,5%. В лиофилизатах, хранившихся при 40°С, обнаружено небольшое повышение содержания влаги; содержание воды после хранения, как правило, было менее 1,7% по сравнению с примерно 1% до начала хранения.

Суммарные количества олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q не повышались после сушки вымораживанием в препаратах, содержащих трегалозу или трегалозу/маннит, по данным анализа с помощью AF4. После хранения с помощью AF4-анализов обнаружено небольшое увеличение менее чем на 3% по сравнению с препаратами до лиофилизации. В препарате, содержащем маннит, обнаружено заметное повышение суммарных количеств олигомеров Nic-Q и агрегатов Nic-Q .

Измерения блокировки света позволили установить, что загрязнение частицами восстановленных лиофилизатов после хранения, как правило, составляло менее 500 частиц размером >10 мкм на 1 мл для всех препаратов, условий хранения и продолжительности хранения.

ДСР-анализы позволили установить, что после хранения в восстановленных лиофилизатах четырех препаратов, содержащих трегалозу или трегалозу/маннит, показатель полидисперсности (PI), как правило, составлял менее 0,2, а доля основного пика Nic-Q , как правило, превышала 98,5% соответственно, что определено с использованием модели конверсии объема. Этот результат получен для всех препаратов, условий и продолжительности хранения. В препарате F54RL обнаружено повышение показателя полидисперсности вплоть до 0,24 при хранении в течение 6 недель при 40°С.

Анализы методом электрофокусирования (IEF), ГФ-ЖХВР (целостность РНК), ОФ-ЖХВР (общий никотин), спектрометрии (содержание РНК), на основе определения мутности и ЛСН-ПААГ продемонстрировали отсутствие существенных изменений во всех препаратах, содержащих трегалозу и трегалозу/маннит, при всех условиях и продолжительности хранения. Полученная рекомбинантно вирусоподобная частица Q , как правило, содержала молекулы РНК-хозяина, которые обычно находились во внутреннем пространстве вирусоподобных частиц.

Содержание свободных производных никотина во всех содержащих трегалозу и трегалозу/маннит препаратах, при всех условиях и продолжительности хранения, как правило, составляло менее 1,5% от общего сшитого никотина, что определено с помощью ОФ-ЖХВР. Количество свободных производных никотина повышалось вплоть до 4,2% в препарате F54RL после хранения при 40°С в течение 6 недель.

Анализы методом ГФ-ЖХВР (целостность ВПЧ) продемонстрировали, что относительное содержание Nic-Q превышало 97% во всех содержащих трегалозу и трегалозу/маннит препаратах, при любой продолжительности и при всех условиях хранения. Относительное содержание Nic-Q снижалось до 93% в препарате F54RL после хранения при 40°С в течение 6 недель.

Проведенные аналитические исследования позволили сделать заключение о том, что все препараты, содержащие трегалозу и трегалозу/маннит, обладали способностью стабилизировать Nic-Q в процессе лиофилизации и последующего хранения даже при повышенной температуре (40°С).