способ мутагенной обработки семян ячменя

Формула изобретения

Способ мутагенной обработки семян ячменя, включающий замачивание семян в водном растворе карбоната натрия в течение 12 ч в концентрации 0,01 1,0 н.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области генетики и селекции и может быть использовано для получения наследственных изменений при создании исходного материала для селекции сельскохозяйственных растений.

Для получения мутаций применяются гамма- и рентгеновские лучи, лазерное излучение, химические вещества (азид натрия, карбонат и хлорид калия и др.) (U.Niv of Bologna, 2009, Дудин Г.П., Лысиков В.Н., 2009, Емелев С.А., 2008).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ обработки семян с применением химического мутагена - 2-хлорэтилфосфорной кислоты /этрела/ с концентрацией 0,2 0,5% и экспозицией воздействия 8 10 ч (Кривошеина О.С., Дудин Г.П., 1997).

Однако при существующем способе обработки семян наблюдается сильное снижение выживаемости растений первого поколения. Увеличивается длина вегетационного периода до 10 дней. Так же этрел оказывает мощное депрессирующее действие на развития растений. Увеличение концентрации мутагена ведет к повышению частоты и спектра мутаций во втором поколении, а абсолютный выход мутаций снижается (табл.1).

Таблица 1
Частота изменчивости ячменя во втором поколении
Мутагенный фактор	Сохранившихся растений к М2	Число семей с изменениями	Частота изменений, %
Контроль	271	-	-
Этрел 0,2%	287	5	1,74
Этрел 1%	236	10	4,24
Этрел 5%	152	10	6,58

Узкий спектр морфофизиологических изменений, в спектре изменений в М2 преобладают мутантные формы ячменя с низким стеблем и длинным колосом. Выделено всего 5 типов хлорофилльных мутаций.

В предлагаемом способе обработка семян ячменя включает замачивание семян в течение 12 часов в водном растворе карбоната натрия с концентрацией 0,01 н 1,0 н.

Высокая концентрация калия в цитоплазме (100-200 мМ) по сравнению с натрием (10-30 мМ) обеспечивает оптимальные ионные условия для активации более 50 ферментов и функционирования процесса синтеза белка. Натрий в химическом и физиологическом отношении близок к калию. Содержание Na⁺ в растении около 0,01% на сырую массу. Изучено, что соли при высоких концентрациях могут дезинтегрировать клеточные мембраны, подавлять активность ферментов, вероятно, вследствие нарушения гидрофобно-электростатического баланса сил, поддерживающих структуру белковых молекул и приводить к нарушениям важных физиологических процессов (Zhu J.-K., 2001). Низкое накопление натрия в клетках определяется балансом скоростей его пассивного поступления и активного экспорта из клетки (Blumwald Е. et al., 2000).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Семена ярового ячменя сорта Биос 1 в течение 12 часов замачивали в растворе карбоната натрия с концентрацией 0,01 н, 0,1 н, 1,0 н. Контролем служили семена, замоченные в воде.

В каждом варианте после обработки карбонатом натрия высевалось в M₁ по 500 зерен /по 125 зерен на делянку площадью 1 м²/.

Карбонат натрия с концентрацией 1,0 н оказал существенное отрицательное влияние на полевую всхожесть семян ячменя (табл.2).

Наблюдения за динамикой развития растений в М₁ показали, что фаза полных всходов в варианте с 1,0 н концентрацией карбоната натрия наступила на 3 дня позже, чем в контроле.

Таблица 2
Полевая всхожесть семян ячменя сорта Биос 1 в год воздействия карбоната натрия
Мутагенный фактор	Концентрация раствора, н	Количество проросших семян
абсолютное	% к высеянным
Контроль	-	397	79,4
Карбонат натрия	0,01	401	80,2
Карбонат натрия	0,1	366	73,2
Карбонат натрия	1,0	340*	68,0
НСР0,95		9,22
Примечание: *- уровень доверительной вероятности P>0,95

Достоверно снизилась всхожесть при обработке 1,0 н раствором карбоната натрия на 11,4% по сравнению с контролем, вследствие нарушения нормального K ⁺/Na⁺ баланса в клетке и дезорганизации мембран, что приводит к нарушению выполнения ее барьерной функции.

Обработка семян ячменя карбонатом натрия оказала влияние на рост и развитие растений в первом поколении (табл.3).

Таблица 3
Влияние карбоната натрия на развитие растений в M1
Концентрация мутагена	Продуктивная кустистость	Длина стебля, см	Длина колоса, см	Масса зерна с колоса, г
Контроль	4,9	65,1	8,98	1,62
Карбонат натрия 0,01 н	5,1	64,8	8,65	1,49*
Карбонат натрия 0,1 н	5,3	64,6	8,85	1,53
Карбонат натрия 1,0 н	5,5	64,9	8,47*	1,48*
Примечание: * - уровень вероятности Р>0,95

В варианте с карбонатом натрия 0,01 н значительно уменьшилось число колосков и масса зерна с колоса.

В варианте с обработкой 1,0 н карбонатом натрия у растений существенно снизилась длина колоса, число колосков в нем и масса зерна с колоса.

Во втором поколении с появлением всходов определяли тип и частоту хлорофилльных мутаций (табл.4) Все хлорофилльные мутации классифицировали по Калам Ю.И., Орав Т.А. (1974).

Таблица 4
Частота хлорофилльных мутаций в М2
Мутагенный фактор	Проанализировано семей в М2	Число семей с мутациями	Частота хлорофилльных мутаций, % p±Sp
Контроль	364	1	0,27±0,27
Карбонат натрия 0,01 н	347	6	1,73±0,70
Карбонат натрия 0,1 н	337	4	1,19±0,59
Карбонат натрия 1,0 н	302	2	0,66±0,47

Наибольшая частота хлорофилльных мутаций наблюдался в варианте с обработкой 0,1 н концентрацией карбоната натрия. В семьях встречалось несколько типов мутаций таких как albina, viridulba, viridoalbescens.

Кроме хлорофилльных мутаций в М2 наблюдались и другие типы новообразований. Частота морфофизиологических изменений представлена в таблице 5.

Таблица 5
Частота морфофизиологических изменений ячменя в М2
Мутагенный фактор	Проанализировано семей в М2	Число семей с морфологическим и изменениями	Частота морфофизиологических изменений, % p±Sp
Контроль	364	2	0,55±0,55
Карбонат натрия 0,01 н	347	53	15,27±1,93***
Карбонат натрия 0,1 н	337	41	12,17±1,78***
Карбонат натрия 1,0 н	302	35	11,59±1,84***
Примечание: *** - уровень значимости Р>0,999

С увеличением концентрации раствора карбоната натрия происходит уменьшение частоты выхода измененных форм. Наибольшее количество семей с изменениями - 53 семьи, отмечено в варианте карбонат натрия 0,01 н.

Наиболее распространенными типами были новообразования по длине стебля и позднеспелость. Наименее распространены изменения, связанные со скороспелостью, стелющейся формой куста и скороспелостью.

Таблица 6
Спектр изменчивости ячменя во втором поколении
Признаки	Концентрация карбоната натрия /н/
0,01	0,1		1,0
абс.	%	абс.	%	абс.	%
Изучалось семей	347		337		302
Форма куста:
стелющаяся	1	0,29	1	0,30	1	0,33
Кустистость:
сильная			1	0,30
Стебель:
высокий	18	5,19	32	9,50	21	6,95
низкий	9	2,59	3	0,89	8	2,65
Длинные ости	1	0,29
Скороспелость	4	1,15	2	0,59
Позднеспелость	13	3,75	19	5,64	6	1,99
Рыхлый колос	6	1,73
Череззерница	3	0,86	1	0,30	1	0,33
Стерильный колос			1	0,30
Раздвоение колоса	1	0,29
Сильная антоцианновая окраска листьев	3	0,86	2	0,59	4	1,32
Хлорофилльные мутации:
Albina	7	2,02
Albocostata	1	0,29
Alboterminalis					1	0,33
Albotigrinavirescens			2	0,59	1	0,33
Chlorine	1	0,29
Viridoalbescens	1	0,29
Viridolutescens	1	0,29
Viridulba	2	0,58
Xantha			1	0,30
Xanthovirescens	1	0,29	1	0,30
Всего изменений	73	21,04	66	19,58	43	14,24
Всего семей с изменениями	59	17,00	45	13,35	37	12,25
Всего типов изменений	17	12	8

Большая часть полученных изменений отличается от сорта Биос 1 не одним, а целым рядом признаков, которые затрагивают длину колоса и стебля, наступления отдельных фаз развития и другим. Это явление (изменение ряда признаков) у мутантов обычно вызывается или плейотропным действием мутантного гена или одновременным мутированием нескольких генов.

Таким образом, предлагаемый для обработки карбонат натрия в сравнении с прототипом является новым мутагенным фактором для семян и растений зерновых культур, во втором поколении наряду с увеличением абсолютного выхода мутаций расширяется спектр селекционно-ценных наследственных изменений при минимальном количестве стерильных форм растений и высокой выживаемости в первом поколении.

Литература

1. РЖ. 04. Биология. Раздел 04Я. Генетика. Цитология. 04ЯЗ. Генетика и селекция возделываемых растений 2009. № 2. 1-28.09.02 - 04Я3.56 TILL More - ресурс поиска химически индуцированных мутантов ячменя.

2. Дудин Г.П., Лысиков В.Н. Индуцированный мутагенез и использование его в селекции растений: Монография. - Киров: Вятская ГСХА, 2009. - 208 с.

3. Емелев С.А. Изменчивость ярового ячменя сорта Дина в М2 под действием калийных удобрений // Экспериментальный мутагенез в биологии и селекции растений / Материалы Международной научно-практической конференции: Сборник научных трудов. - Киров: Вятская ГСХА, 2008. - с.12-15.

4. Калам Ю.И. Хлорофилльная мутация // Ю.И.Калам, Т.А.Орав. - Таллин: Валгус, 1974. - 59 с.

5. Кривошеина О.С., Дудин Г.П. Способ мутагенной обработки семян ячменя. Патент № 2093017 от 20.10.1997, прототип.

6. Zhu J. - К. Plant salt tolerance // Trends Plant Sci. - 2001. - V.6. - P.66-71.

7. Blumwald E. Aharon G.S., Apse M.P. Sodium transport in plant cells // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - V. 1465. - P. 140-151.