способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы

Формула изобретения

Способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы, включающий окрашивание сформировавшихся биопленок красителем с последующим экстрагированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом и оценкой интенсивности окрашивания спиртового раствора на фотометре, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют биологический субстрат - измельченные и простерилизованные натуральные почечные камни различной химической природы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии для определения способности микроорганизмов формировать биопленки на биологических субстратах.

Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки, заключающийся в культивировании бактерий в лунках полистироловых микротитровальных планшет с последующей окраской адгезировавшихся к твердой фазе (полистиролу) и сформировавших биопленку бактерий. Оценка интенсивности сформировавшихся биопленок проводится на фотометре по степени окраски спиртового экстракта красителя в каждой лунке (O'Tool G.A., Mol. Microbiol., 1998, v.28, № 3; Jackson D.W., J.Bacteriol., 2002, v.184, № 1).

Однако этот способ не позволяет объективно оценивать способность микроорганизмов формировать биопленки на биологических субстратах, т.к. в качестве твердой фазы используют синтетический материал (полистирол), сильно отличающийся по своему химическому составу от биологических объектов. Особенно это важно в урологии, где объективная оценка инфицированности почечных камней микроорганизмами, находящимися в составе биопленок, необходима для проведения адекватного лечения больных мочекаменной болезнью.

Цель изобретения - разработка способа определения способности микроорганизмов формировать биопленки на биологическом субстрате.

Сущностью изобретения является использование в качестве твердой фазы биологического субстрата - натуральных почечных камней различной химической природы, что позволяет более эффективно определять способность микроорганизмов формировать биопленки на данном биологическом субстрате.

Пример 1. Несколько натуральных почечных камней разной химической природы, полученных в ходе операций по удалению камней из почек, помещают в 70% этиловый спирт и стерилизуют в течение 24 ч, затем их подсушивают и тщательно измельчают в стерильной фарфоровой ступке до относительно гомогенного состояния (песка). Одинаковые навески почечного песка по 10 мг помещают в стерильные пробирки (V - 10 мл). В эти пробирки добавляют по 0,5 мл суспензий нескольких штаммов Е.coli ( № № 3, 38, 55, 136, 1068), выделенных из мочи больных циститами или из почечных камней, в концентрации n×10⁶ КОЕ/мл. В качестве контроля фона используют стандартную навеску песка с 0,5 мл стерильной питательной среды.

Пробирки инкубируют, плавно покачивая, в течение 48 ч при температуре 37°С. Осадок почечного песка в культуральной жидкости отбирают и переносят в микроцентрифужные пробирки (V - 1,5 мл). Затем песок отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (15 сек при 5000 об/мин) и трижды промывают физиологическим раствором, избегая резкого встряхивания пробирок. К отмытому почечному песку, содержащему лишь прикрепившиеся бактериальные клетки биопленок, добавляют 0,5 мл 0,1% раствора красителя кристалл виолет. Окрашивание биопленок проводят в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем песок осаждают центрифугированием и 3-4 раза промывают стерильной водой (до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится бесцветной). Связавшийся с клетками биопленки краситель экстрагируют с окрашенного почечного песка этиловым спиртом (0.5 мл) в течение часа. Интенсивность окрашивания этилового спирта оценивают на фотометре при длине волны 540 нм.

Параллельно проводят такой же опыт в лунках полистироловых микротитровальных планшет. Суспензии данных штаммов Е.coli в концентрации n×10 ⁶ КОЕ/мл вносят по 100 мкл в лунки, инкубируют также в течение 48 ч при 37°С. В качестве контроля фона используют полистироловые лунки, заполненные стерильной питательной средой. После инкубирования культуральную жидкость удаляют, лунки промывают 3 раза физиологическим раствором и вносят по 100 мкл раствора красителя в каждую лунку и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После этого лунки промывают 3 раза дистиллированной водой и вносят по 100 мкл этилового спирта для экстрагирования красителя, связавшегося с клетками биопленок на стенках полистироловых лунок. Интенсивность окрашивания спиртового раствора также оценивают на фотометре при длине волны 540 нм. Результаты сравнения двух параллельных опытов представлены в виде фиг.1. В каждом опыте уже вычтены фоновые значения.

Из приведенных на фиг.1 данных видно, что способность бактерий E.coli прикрепляться к поверхности полистирола и формировать на нем биопленки значительно ниже, чем при использовании натуральных почечных камней.

Таким образом, предлагаемый способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы позволяет в 2-4 раза повысить эффективность теста для уропатогенных E.coli при использовании адекватного биологического субстрата (почечных камней).

Пример 2. Одинаковые навески по 10 мг предварительно подготовленного почечного песка (как описано выше) помещают в стерильные пробирки (V - 10 мл) и добавляют в эти пробирки по 0,5 мл суспензий микроорганизмов разных видов, выделенных из мочи больных циститами или из почечных камней, в концентрации n×10⁶ КОЕ/мл: E.coli 38, Kl.pneumoniae 153, Pr.mirabilis 71, Ps.aeruginosa 32, St.haemoliticus 159, St.epidermis 83, E.faecalis 6, M.morgani 166. В качестве контроля фона используют стандартную навеску песка с 0,5 мл стерильной питательной среды. Пробирки инкубируют при плавном покачивании в течение 48 часов при температуре 37°С. Осадок почечного песка в культуральной жидкости отбирают и переносят в микроцентрифужные пробирки (V - 1,5 мл). Затем песок отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (15 сек при 5000 об/мин) и трижды промывают физиологическим раствором, избегая резкого встряхивания пробирок. К отмытому почечному песку, содержащему лишь прикрепившиеся бактериальные клетки биопленок, добавляют 0,5 мл 0,1% раствора красителя кристалл виолет. Окрашивание биопленок проводят в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем песок осаждают центрифугированием и 3-4 раза промывают стерильной водой (до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится бесцветной). Связавшийся с клетками биопленки краситель экстрагируют с окрашенного почечного песка этиловым спиртом (0.5 мл) в течение часа. Интенсивность окрашивания этилового спирта оценивают на фотометре при длине волны 540 нм.

Параллельно проводят такой же опыт в лунках полистироловых микротитровальных планшет. Суспензии данных видов микроорганизмов в концентрации n×10⁶ КОЕ/мл вносят по 100 мкл в лунки, инкубируют также в течение 48 ч при 37°С. В качестве контроля фона используют полистироловые лунки, заполненные стерильной питательной средой. После инкубирования культуральную жидкость удаляют, лунки промывают 3 раза физиологическим раствором и вносят по 100 мкл раствора красителя в каждую лунку и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После этого лунки промывают 3 раза дистиллированной водой и вносят по 100 мкл этилового спирта для экстрагирования красителя, связавшегося с клетками биопленок на стенках полистироловых лунок. Интенсивность окрашивания спиртового раствора также оценивают на фотометре при длине волны 540 нм. Результаты сравнения двух параллельных опытов представлены в виде фиг.2. В каждом опыте также уже вычтены фоновые значения.

Из данных фиг.2 видно, что предлагаемый способ позволяет более эффективно определять способность разных видов микроорганизмов формировать биопленки на биологическом субстрате, в то время как способность данных видов микроорганизмов прикрепляться к поверхности полистирола и формировать на нем биопленки была значительно ниже, чем при использовании натуральных почечных камней.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет объективно оценивать способность микроорганизмов формировать биопленки на биологическом субстрате - почечных камнях и наглядно доказывает более высокую эффективность предлагаемого способа, в отличие от способа, использующего полистироловые лунки. Объективная оценка инфицированности почечных камней микроорганизмами, формирующими биопленки на поверхностях этого биологического субстрата, очень важна для проведения адекватного лечения больных мочекаменной болезнью.