способ получения овомукоида

Классы МПК:C07K1/14 экстракция; разделение; очистка
C07K1/30 осаждением
C07K1/34 фильтрацией, ультрафильтрацией или обратным осмосом
C07K1/36 комбинацией двух или более способов разного типа
C07K14/81 ингибиторы протеазы
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук (ИНХС РАН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2011-05-12
публикация патента:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения овомукоида. К белку утиных яиц добавляют равный объем смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3. Отделяют образующийся осадок фильтрованием при 0-5°С. Затем добавляют к фильтрату органический растворитель в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1. Удаляют надосадочную жидкость декантированием при 0-5°С. Удаляют низкомолекулярные примеси из овомукоида ультрафильтрацией. Лиофильно высушивают овомукоид. В качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35. Изобретение способствует повышению выхода овомукоида до 1,66 г/100 мл яичного белка и увеличению степени чистоты овомукоида до 99,5%. 1 табл., 5 пр.

Формула изобретения

Способ получения овомукоида путем добавления к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделения образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавления к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удаления надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удаления низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильного высушивания овомукоида, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем ультрафильтрации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу получения из белка утиных яиц овомукоида, который является эффективным ингибитором протеолитических ферментов и может быть использован для создания антипротеиназных лекарственных препаратов, биоспецифических сорбентов для удаления протеолитических ферментов из биологических жидкостей, включая кровь, для получения стабилизированных белковых препаратов и высокоочищенных протеолитических ферментов, а также для получения носителей полипептидных лекарственных препаратов с повышенной устойчивостью к действию пищеварительных ферментов.

Известен способ получения овомукоида (Авторское свидетельство СССР № 1404513, Бюл. № 23, 1988), который состоит в добавлении к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удалении надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удалении низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильном высушивании овомукоида. В качестве органического растворителя используют этанол, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем диализа против дистиллированной воды.

Известный способ позволяет получать овомукоид с выходом 0,89-1,06 г на 100 мл белка утиных яиц и степенью чистоты овомукоида 85-91%.

Цель изобретения - повышение выхода и степени чистоты овомукоида.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения овомукоида, который состоит в добавлении к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удалении надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удалении низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильном высушивании овомукоида, в качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем ультрафильтрации.

Пример 1

Яйца утки разбивают и отделяют белок от желтка. К 300 мл яичного белка при комнатной температуре (18-22°С) и перемешивании добавляют 300 мл смеси 107,15 мл 0.5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 193 мл смеси этанола (125,5 мл) и ацетона (67,5 мл) (объемное отношение равно 65:35). Объемное отношение водного раствора трихлоруксусной кислоты и указанного растворителя - 1:1,8.

После добавления всего количества смеси реакционную массу дополнительно перемешивают в течение 1 часа при 0°С. Выпавший осадок отфильтровывают и отбрасывают. К фильтрату добавляют 1960 мл смеси этанола и ацетона указанного выше состава при объемном отношении фильтрата к смеси этанола и ацетона, равном 3,5:1, и смесь оставляют стоять на сутки при 0°С для более полного осаждения овомукоида. Затем надосадочную жидкость удаляют декантированием при 0°С, осадок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и раствор помещают в ячейку объемом 250 мл аппарата для ультрафильтрации Amicon (США). Ультрафильтрацию проводят при давлении 3 атм в течение 1 часа, используя мембрану UM-10 (Amicon). Затем в ячейку добавляют 100 мл дистиллированной воды и операцию повторяют 3 раза до полного удаления низкомолекулярных примесей. Контроль за полнотой удаления проводят спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность промывных вод при 280 нм. Раствор овомукоида переносят в аппарат для лиофильной сушки и высушивают. Получают 4,31 г овомукоида (1,44 г на 100 мл яичного белка).

Оценку качества выделенного овомукоида проводят следующим образом. Сначала готовят раствор красителя. Для этого 60 мг Кумасси бриллиант (Coomassie Brilliant Blue G) растворяют в 50 мл этанола и перемешивают в течение нескольких часов. К раствору добавляют 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты, доводят до 1000 мл водой и фильтруют. Краску выдерживают в течение суток, а затем доводят концентрацию красителя до 0.005% (E350=0.6 для кюветы с оптическим путем 1 см). Затем к 1000 мл раствора красителя добавляют 1 мл раствора додецилсульфата натрия - SDS (3.003 г SDS/100 мл). Для проведения измерения 0.1 мл раствора овомукоида смешивают с 2 мл раствора красителя, смесь инкубируют 10-60 минут при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность раствора при 595 нм. Концентрацию овомукоида рассчитывают по предварительно построенной калибровке с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Стандартный раствор БСА получают растворением 5 мг БСА в 5 мл дистиллированной воды. Для расчета концентрации БСА измеряют оптическую плотность раствора при 280 нм и используют формулу [БСА] мг/мл=А280×1.49.

Выделенный препарат овомукоида содержит 98,9% белка и 1,1% связанной воды.

Определение степени чистоты овомукоида проводят путем изучения природы N-концевой аминокислоты (гомогенный белок должен содержать только одну N-концевую аминокислоту). 30 мкл раствора овомукоида в 0.1 М бикарбонате натрия (общее количество белка равно 1 нмоль) помещают в ампулу и добавляют 30 мкл раствора дансил хлорида (dansyl chloride) в ацетоне (6 мг/мл). Смесь инкубируют 45 минут при 37°С. Затем смесь упаривают досуха в вакууме при 50°С. К остатку добавляют 50 мкл 5,7 N HCl, содержимое ампулы замораживают жидким азотом, ампулу вакуумируют и выдерживают 16 часов при 105°С для полного кислотного гидролиза дансилированного белка. Затем ампулу вскрывают, кислоту удаляют выпариванием в вакууме при 50°С. К остатку добавляют 20 мкл воды и высушивают в тех же условиях. Затем остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и анализируют дансильные производные аминокислот HPLC в обращенной фазе на колонке Superspher RP 6 (125×2 мм, Merk, Германия), используя линейный градиент 60% ацетонитрила, содержащего 0.1% трифторуксусной кислоты.

Содержание дансил-валина составляет более 0,995 нмоль, т.е. степень чистоты овомукоида составляет более 99,5%.

Пример 2

Процесс проводят по примеру 1, используя различные соотношения компонентов. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.

Пример 3

Процесс проводят по примеру 1, используя различные соотношения компонентов и на всех стадиях вместо температуры 0°С используют температуру 5°С. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.

Примеры 4-5 (контрольные)

Процесс проводят по примеру 1, используя соотношения компонентов, лежащие вне заявленных пределах. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.

Таблица
Параметры процесса получения овомукоида и характеристики конечного продукта
№ примераОбъемное отношение этанол:ацетон Объемное отношение 0.5 М раствор ТХУ*:смесь этанола и ацетона Объемное отношение фильтрат:смесь этанола и ацетона Выход овомукоида, г/100 мл яичного белка Степень чистоты овомукоида, %
165:35 1:1,83,5:1 1,44 >99,5
250:50 1:2,33,2:1 1,53 >99,5
340:60 1:2,03,0:1 1,66 >99,6
4 (к)70:30 1:2,2 3,4:11,13 95,1
5 (к)30:70 1:2,23,4:1 1,22 94,8
6 (прототип)Этанол=100% 1:1,8-2,3 3,0-3,5:10,89-1,06 85-91
* - ТХУ - трихлоруксусная кислота.

Использование предложенного способа позволяет получать овомукоид со степенью чистоты до 99,6% и выходом до 1,66 г на 100 мл белка утиных яиц. Замена диализа на ультрафильтрацию существенно ускоряет процесс выделения овомукоида (часы вместо суток) и способствует повышению выхода овомукоида. Выбор состава органического растворителя обусловлен тем, что при увеличении количества ацетона в смеси выше 60% резко снижается степень чистоты овомукоида (до 95%) при выходе до 1,2 г на 100 мл белка, а при увеличении количества этанола в смеси выше 65% снижается выход овомукоида до 1,1 г на 100 мл белка и степень его чистоты (до 95%).

Таким образом, предложенный способ позволяет более эффективно использовать сырье, то есть снизить стоимость самого овомукоида и продуктов на его основе, интенсифицировать процесс, а главное, существенно повысить степень чистоты овомукоида, то есть повысить ингибиторную активность овомукоида в расчете на единицу массы и избежать нежелательных реакций при использовании овомукоида в качестве лекарственного препарата, обусловленных большим количеством (до 9%) неидентифицированных примесей.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2460734

patent-2460734.pdf

Класс C07K1/14 экстракция; разделение; очистка

способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria immitis -  патент 2525688 (20.08.2014)
очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран -  патент 2520817 (27.06.2014)
оптимизированный способ очистки рекомбинантного белка фактора роста -  патент 2491290 (27.08.2013)
производство 2s-белка канолы с применением ионного обмена -  патент 2490274 (20.08.2013)
способ получения эстрогенсвязывающего белка, ассоциированного со злокачественными новообразованиями -  патент 2489440 (10.08.2013)
способ крупномасштабного получения, выделения и очистки рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека -  патент 2487885 (20.07.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485133 (20.06.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485132 (20.06.2013)
способ производства фармакологически приемлемой смеси веществ, содержащей низкомолекулярные компоненты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий и обладающей иммуностимулирующей активностью -  патент 2478644 (10.04.2013)
осаждение и очистка белков полиэлектролитами -  патент 2474585 (10.02.2013)

Класс C07K1/30 осаждением

способ получения хлоркальциевого казеина -  патент 2528978 (20.09.2014)
очистка белков с помощью катионного поверхностно-активного вещества -  патент 2426738 (20.08.2011)
способ получения липопротеинов из семян подсолнечника -  патент 2340625 (10.12.2008)
очистка пептидов -  патент 2303040 (20.07.2007)
способ получения белковой кормовой добавки из растительного сырья и устройство для его осуществления -  патент 2266680 (27.12.2005)
способ получения концентрата белка, способ извлечения изофлавона в концентрат белка, концентрат белка (варианты) -  патент 2151775 (27.06.2000)
способ получения экстракта, обогащенного изофлавоном аглюкона -  патент 2142957 (20.12.1999)
способ получения сыворотки растительного белка, обогащенной изофлавонами аглюкона (варианты), способ извлечения белка сыворотки -  патент 2130073 (10.05.1999)
способ получения кристаллов гр или производных гр, кристаллы человеческих гр или производных человеческих гр и фармацевтический препарат -  патент 2108341 (10.04.1998)
способ выделения рекомбинантного полипептида с последовательностью соматотропина -  патент 2099348 (20.12.1997)

Класс C07K1/34 фильтрацией, ультрафильтрацией или обратным осмосом

очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран -  патент 2520817 (27.06.2014)
фильтрация в переменном тангенциальном потоке -  патент 2504549 (20.01.2014)
способ удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор vii -  патент 2472804 (20.01.2013)
способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц -  патент 2468032 (27.11.2012)
способ получения высокоэффективного человеческого альбумина для применения в детоксикационной терапии -  патент 2424822 (27.07.2011)
способ получения концентрата фактора фон виллебранда или комплекса "фактор viii/фактор фон виллебранда" и его применение -  патент 2417096 (27.04.2011)
cпособ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферон-стимулирующей активностью -  патент 2409678 (20.01.2011)
способ очистки ванкомицина -  патент 2400489 (27.09.2010)
способ концентрирования препаратов антител -  патент 2390524 (27.05.2010)
препарат иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения -  патент 2122864 (10.12.1998)

Класс C07K1/36 комбинацией двух или более способов разного типа

очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран -  патент 2520817 (27.06.2014)
гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения -  патент 2515914 (20.05.2014)
способ выделения и очистки рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого дрожжами saccharomyces cerevisiae -  патент 2492177 (10.09.2013)
способ получения комплекса иммуноглобулинов igg, igm и iga для внутривенного введения -  патент 2492176 (10.09.2013)
способ крупномасштабного получения, выделения и очистки рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека -  патент 2487885 (20.07.2013)
способ производства фармакологически приемлемой смеси веществ, содержащей низкомолекулярные компоненты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий и обладающей иммуностимулирующей активностью -  патент 2478644 (10.04.2013)
способ синтеза рекомбинантного паратиреоидного гормона человека -  патент 2441019 (27.01.2012)
способ получения и очистки ингибина-а человека -  патент 2434018 (20.11.2011)
способ получения высокоэффективного человеческого альбумина для применения в детоксикационной терапии -  патент 2424822 (27.07.2011)
способ очистки рекомбинантного интерферона -1b -  патент 2392282 (20.06.2010)

Класс C07K14/81 ингибиторы протеазы

модифицированные варианты ингибиторов протеаз bowman birk -  патент 2509776 (20.03.2014)
слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением -  патент 2503688 (10.01.2014)
применение слитого конструкта тимп-гфи и способ лечения повреждений кожи для предотвращения или ингибирования образования рубца -  патент 2428479 (10.09.2011)
полипептид, способный преодолевать гематоэнцефалический барьер, и его конъюгат -  патент 2408605 (10.01.2011)
способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина -  патент 2370500 (20.10.2009)
производные фактора vii свертывания крови -  патент 2338752 (20.11.2008)
по существу, кристаллическая форма мелагатрана -  патент 2243973 (10.01.2005)
бикунин человека (варианты), кодирующая его днк и вектор экспрессии (варианты) -  патент 2218353 (10.12.2003)
природный и рекомбинантный ингибиторы тромбина, их получение и применение -  патент 2183214 (10.06.2002)
протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция -  патент 2128705 (10.04.1999)
Наверх