способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот

Формула изобретения

1. Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот, отличающийся тем, что 3-гидроксикарбоновую кислоту синтезируют в водном реакционном растворе, который содержит единицу, обладающую активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающую как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, причем эту единицу выбирают из группы, включающей выделенную кобаламин-зависимую мутазу, фермент или систему ферментов, производящие эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, микроорганизм или его сырой экстракт, и/или добавляют ее к указанному реакционному раствору, инкубируют, а затем получают соответствующим образом преобразованную 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту в виде кислоты или в форме ее солей.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизмы, производящие или включающие в себя кобаламин-зависимую мутазу, обладающие активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, используют в водных системах для преобразования 3-гидроксикарбоновых кислот в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что

a) микроорганизмы, с активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, так и активностью изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, культивируют в водной системе с воспроизводимым сырьем или отходами, получаемыми из воспроизводимого сырья, в качестве источника углерода и энергии, благодаря чему во внутриклеточной среде происходит синтез тиоэфиров 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA и их преобразование в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, и

b) соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту выделяют в виде свободной кислоты или ее соответствующих солей.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция идет при добавлении 3-гидроксикарбоновой кислоты извне.

5. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что микроорганизм выбирают из бактериального штамма НСМ-10 DSM 18028, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (АТСС17029) или Nocardioides sp. JS614.

6. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что используют цельные клетки микроорганизмов в неизменном виде, после пермеабилизации или в фиксированном на носителе виде.

7. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что клеточные экстракты и/или кобаламин-зависимую мутазу и, при необходимости, прочие ферменты, как, например, ферменты, синтезирующие эфиры CoA, используют после частичного или полного выделения из микроорганизмов, при необходимости, в очищенном виде.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что применяют не содержащие клеток сырые экстракты микроорганизмов.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что применяют полученные с помощью бактериального штамма кобаламин-зависимые мутазы с последовательностями SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4, с последовательностями SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6, белки с последовательностями SEQ ID NO:9 и/или ID NO:10 или белки с последовательностями SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14, а также белки, гомологичные им по меньшей мере на 80%.

10. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве источника углерода и энергии для ферментативной переработки во время культивации применяют сахар, и/или спирт, и/или органическую кислоту, и/или углеводород, и/или их производные.

11. Способ по п.3, отличающийся тем, что для культивирования применяют субстрат с трет-бутиловым остатком в качестве источника углерода и энергии.

12. Способ по п.3, отличающийся тем, что трет-бутиловый спирт используют как единственный источник углерода и энергии в базальной среде для культивирования.

13. Способ по п.3, отличающийся тем, что ферментативное преобразование сахара, и/или спирта, и/или органической кислоты, и/или углеводорода, или их производных в 3-гидроксикарбоновую кислоту и из 3-гидроксикарбоновой кислоты в 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту проводят в рамках одного единственного этапа способа.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что с добавлением 3-гидроксимасляной кислоты в качестве 3-гидроксикарбоновой кислоты извне осуществляют производство 2-гидроксиизомасляной кислоты в качестве 2-гидрокси-2-метилкарбрновой кислоты.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту подвергают дегидратации.

16. Способ по п.15 отличающийся тем, что в качестве 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты используют 2-гидроксиизомасляную кислоту.

17. Штамм микроорганизма НСМ-10 - DSM 18028 для получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот.

18. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с активностью кобаламин-зависимой мутазы, выбранная из группы, состоящей из:

a) молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности аминокислот, приведенные под номерами Seq № 2 и/или Seq № 4;

b) молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеотидов, представленную под Seq № 1 и/или Seq № 3.

19. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18, отличающаяся тем, что она кодирует белок, составленный как олигомерный фермент из двух различных субъединиц, включающий в себя последовательности аминокислот, приведенные под Seq № 2 и Seq № 4.

20. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18 или 19, представляющая собой молекулу ДНК.

21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.20, представляющая собой кДНК или геномную ДНК.

22. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18 или 19, представляющая собой молекулу РНК.

23. Белок с активностью кобаламин-зависимой мутазы, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по пп.18 и 19.

24. Белок с активностью кобаламин-зависимой мутазы с последовательностью № 2 или с последовательностью № 4 или гомологичные ему, по меньшей мере, на 99% или в форме гетеродимерного фермента с указанными последовательностями.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение касается способа ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот, в котором 3-гидроксикарбоновую кислоту синтезируют в водном реакционном растворе и/или добавляют ее к этому реакционному раствору и инкубируют. Водный реакционный раствор содержит вещество, обладающее активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, которое способно как производить эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, так и изомеризовать эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, и обеспечивает превращение 3-гидроксикарбоновой кислоты в соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту, которую получают в виде кислоты или в форме ее солей. В предпочтительной форме исполнения вещество, обладающее активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, включает в себя изолированную кобаламин-зависимую мутазу и, при необходимости, фермент или ферментную систему, производящую эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, либо же представляет собой содержащий их микроорганизм. Предпочтительно изобретение касается биотехнологического процесса для производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот, причем микроорганизмы, обладающие желательной мутазной активностью, культивируют в водной системе с помощью простых природных веществ, а эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, образующиеся во внутриклеточной среде, преобразуют в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты. Также изобретение включает в себя производство ненасыщенных 2-метилкарбоновых кислот, причем полученные путем дегидратации 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты превращают в соответствующие ненасыщенные 2-метилкарбоновые кислоты (метакриловую кислоту и ее высшие гомологи).

В предпочтительном варианте исполнения в качестве микроорганизма, производящего 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфир и изомеризующего 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфир, используют штамм НСМ-10 (DSM 18028).

Метакриловая кислота, а также гомологичные ей ненасыщенные 2-метилкарбоновые кислоты широко применяют при производстве листового акрилового оргстекла, фасонных изделий, изготавливаемых методом литья под давлением, и множества других продуктов.

Известен целый ряд процессов, применимых для производства метакриловой кислоты и ее гомологов. Однако в мировом коммерческом производстве самую большую долю занимает способ для гидролиза амид-сульфатов метакриловой кислоты и их гомологов, которые производят из соответствующих 2-гидроксилнитрилов (W.Bauer, "Methacrylic acid and derivatives", в: Ullmann s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Auflage, Herausgeber: В.Elvers, S.Hawkins, G.Schulz, VCH, New York, 1990, Bd. A16, S.441-452; A.W.Gross, J.C.Dobson, "Methacrylic acid and derivatives", in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4. Auflage, Herausgeber: J.I.Kroschwitz, M.Howe-Grant, John Wiley & Sons, New York, 1995, Bd. 16, S.474-506). В этом методе для производства 1 кг метакриловой кислоты необходимо, например, 1,6 кг серной кислоты. По этой причине были бы целесообразны альтернативные способы коммерческого производства метакриловой кислоты, которые позволяли бы обойтись без повторного извлечения серной кислоты и связанного с этим высокого расхода энергии.

Химическое превращение 2-гидроксимасляной кислоты в метакриловую кислоту стало известно из патентов США US 3,666,805 и US 5,225,594. Для этого проводят дегидратизацию 2-гидроксимасляной кислоты с использованием оксидов металлов, гидроксидов металлов, ионообменных смол, глинозема, диоксида кремния, аминов, фосфинов, алкоксидов и карбоксилатов щелочных металлов. Обычно температура реакции находится между 160°С и 250°С. Этот способ позволяет добиться выхода метакриловой кислоты до 96%.

Альтернативный способ производства метакриловой кислоты и ее гомологов состоит в гидролизе 2-гидроксинитрилов до соответствующих 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот с использованием нитрил-гидролизующих ферментов. Речь при этом идет о нитрилазе или сочетании нитрил-гидролазы и амидазы (A.Banerjee, R.Sharrna, U.С.Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current Status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 33-44). Этот способ защищен рядом патентов (патент США US 6,582,943 В1). Существенный недостаток этого метода состоит в нестабильности нитрилов в нейтральном диапазоне рН, необходимом для достаточной активности нитрил-гидролизующих ферментов. Разрушение нитрилов в реакционной смеси ведет к накоплению кетонов и цианида, причем оба вещества ингибируют активность нитрил-гидролизующих ферментов.

Общим недостатком обоих способов, т.е. преобладающего в настоящее время способа на основе амид-сульфатов и ферментативного способа с гидролизом нитрилов, является потребность в 2-гидроксинитрилах. Их приходится сначала синтезировать из вредных для окружающей среды исходных компонентов, а именно кетонов и цианида.

Поэтому были бы полезны способы производства метакриловой кислоты и ее гомологов, основанные на простых исходных компонентах, безвредных для окружающей среды.

Задача изобретения, следовательно, состояла в поиске альтернативных возможностей производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот и в том, чтобы предложить средства и способы, которые основаны на применении простых, безвредных для окружающей среды компонентов, обладают невысоким энергопотреблением и отходов также производят немного.

Задачу решают с помощью ферментативного способа получения 2-гидрокси- 2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот. Согласно изобретению 3-гидроксикарбоновую кислоту синтезируют в водном реакционном растворе, который содержит вещество, обладающее активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, и/или добавляют ее к этому реакционному раствору. Под веществом, обладающим активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, в рамках изобретения подразумевают вещество (систему), включающее в себя кобаламин-зависимую мутазу и, при необходимости, фермент или систему ферментов, производящую эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, либо включающую или производящую эти вещества биологическую систему, которые обладают активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и демонстрируют как активность производства эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA, так и активность в изомеризации эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA. После инкубации получают соответствующим образом преобразованную 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту в виде кислоты или в форме ее солей.

Изобретение предпочтительно касается биотехнологического процесса для производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот с использованием микроорганизмов. Эти микроорганизмы, как правило, обладают активностью синтеза эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA, и они в состоянии производить эту кобаламин-зависимую мутазу либо же содержат такую мутазу и благодаря активности мутазы 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA способны во внутриклеточной среде преобразовывать эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, образованные из простых натуральных веществ (из исходных компонентов, например, сахаров, и/или спиртов, и/или органических кислот и их производных), в соответствующие эфиры 2-гидрокси-2-метилкарбонила-CoA.

Способ согласно изобретению отличается, в частности, тем, что микроорганизмы, производящие или включающие в себя кобаламин-зависимую мутазу и обладающие активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, используют в водных системах для преобразования 3-гидроксикарбоновых кислот в соответствующие 2- гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты.

В предпочтительном варианте способа микроорганизмы, включающие в себя активность CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, культивируют в водной системе с воспроизводимым сырьем или отходами, получаемыми из воспроизводимого сырья, в качестве источника углерода и энергии. При этом тиоэфиры 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA преобразуют в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты. Целесообразно, чтобы реакция шла с добавлением 3-гидроксикарбоновой кислоты извне. Затем соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту выделяют как кислоту или в форме ее солей.

Этот новый биотехнологический способ, использующий получение 3-гидроксикарбоновых кислот из простых натуральных веществ и их изомеризацию в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, в состоянии решить вышеуказанную проблему.

В предпочтительном варианте изобретения способ включает в себя следующие этапы:

(a) В надлежащей биологической системе, обладающей активностью синтеза эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA и активностью мутазы, осуществляют производство 3-гидроксикарбоновых кислот из простых натуральных веществ и последующее их преобразование в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты и

(b) Выделение 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот в виде свободных кислот или их соответствующих солей.

Полученные таким образом 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты целесообразно использовать для производства ненасыщенных изоалкеновых кислот с 2-3 атомами углерода (метакриловая кислота и гомологичные ей соединения), что можно осуществлять путем дегидратации кислот, синтезированных на этапах (а) и (b), или их соответствующих солей. Эти реакции представлены ниже:

Простые природные вещества (например, поспроизводимое сырье или отходы переработки воспроизводимого сырья, как, например, сахара, органические кислоты или спирты) 3-гидроксикарбоновые кислоты 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты (например, посредством штамма НСМ-10)

2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты метакриловая кислота и ее гомологи (например, в присутствии NaOH и при температуре 185°С).

Условия реакции (значение рН, концентрация ионов (ионная сила), потребность в кислороде и двуокиси углерода, микроэлементы, температуры и т.п.) выбирают, разумеется, так, чтобы микроорганизмы были способны оптимальным образом преобразовывать 3-гидроксикарбоновые кислоты в 2-гидрокси~2-метилкарбоновые кислоты. В таких условиях процесса кобаламин-зависимая мутаза обладает в естественном микроокружении, то есть в клетке, более высокой стабильностью и эффективностью, чем изолированный фермент. Кроме того, при надлежащих условиях может быть возможно размножение клеток и, следовательно, повышение концентрации мутазы. Таким образом, ферментативное преобразование с помощью микроорганизмов может означать существенное преимущество в том, что касается надежности, пригодности к автоматизации, простоты, а также качества и выхода конечного продукта процесса.

Для ферментативного преобразования 3-гидроксикарбоновых кислот в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты согласно изобретению систему, обладающую активностью мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты-CoA, то есть кобаламин-зависимую мутазу, предпочтительно в сочетании с активностью синтеза CoA-эфиров, можно также вводить в реакционный раствор в очищенной, обогащенной и/или выделенной форме, причем ферменты могут быть, например, природного происхождения. Разумеется, ферменты могут представлять собой произведенные рекомбинантным способом ферменты из генетически модифицированного организма.

В способе согласно изобретению ферменты используют в рамках изобретения в качестве катализаторов как в форме интактных микробных клеток, так и в форме микробных клеток с повышенной проницаемостью. Кроме того, существуют возможности применения в форме компонентов (одного или нескольких) клеточных экстрактов, но также и в частично очищенной или очищенной форме. При необходимости, согласно изобретению применяют ферменты, синтезирующие CoA-эфиры, например, CoA-трансферазу или CoA-синтетазы. Ферментативные катализаторы могут быть иммобилизованы или же прикреплены к растворенному или нерастворенному материалу-носителю.

В предпочтительном варианте исполнения определенные клеточные компартменты или их части отделяют друг от друга или объединяют друг с другом, то есть углеводные структуры, липиды или белки и/или пептиды, а также нуклеиновые кислоты, которые в состоянии положительно или отрицательно повлиять на систему, обладающую мутазной активностью, можно сочетать между собой или разделять. Чтобы осознанно использовать такой способ воздействия, из микроорганизмов известным в отрасли способом получают, например, сырые экстракты, которые, при необходимости, центрифугируют, чтобы иметь возможность провести реакцию согласно изобретению с осадком или жидкой фракцией.

3-Гидроксикарбоновые кислоты (как, например, 3-гидроксимасляная кислота) или, точнее говоря, их внутриклеточные CoA-тиоэфиры 3-гидроксикарбонила-CoA можно легко получать из простых природных веществ посредством разнообразных бактериальных штаммов. Эти кислоты представляют собой компоненты (мономеры) для широко распространенного бактериального вещества поли-3-гидроксиалканоата, являющегося запасом углерода и энергии. Перемещения углерода в пределах «каркаса» карбоновых кислот также широко распространены как в бактериальных, так и в других биологических системах. До сих пор, однако, не удавалось обнаружить биологическую систему для преобразования эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA в соответствующие эфиры 2-гидрокси-2-метилкарбонила-CoA. Изобретение основано на том неожиданном открытии, что система с активностью кобаламин-зависимой мутазы обладает обоими этими свойствами.

Микроорганизмы, содержащие кобаламин-зависимые мутазы, это, например, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8 (Собрание штаммов UFZ Лейпциг), -протеобактериальный штамм НСМ-10, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) или Nocardioides sp. JS614.

Подходящую биологическую систему, которой можно отдать предпочтение, нашли в штамме НСМ-10. Согласно Будапештскому Договору о складировании микроорганизмов для целей патентования, 13.03.2006 он был размещен в Германском собрании микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ в Брауншнвейге, Германия, под № DSM 18028.

С использованием этой предпочтительной биологической системы удалось добиться особенно высокого выхода 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот, особенно 2-гидроксиизомасляной кислоты. Тем не менее ферментативное преобразование посредством микроорганизмов ни в коем случае не ограничивается этим штаммом. Все организмы, которые в состоянии преобразовывать 3-гидроксикарбоновые кислоты в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, можно применять согласно изобретению.

Это могут быть микроорганизмы, которые, во-первых, обладают одним и тем же геном или генетическим продуктом, или же, с другой стороны, имеют аналогичный ген, ведущий к образованию генетических продуктов с подобной или аналогичной активностью. Т.е. активность 3-гидроксикарбонил-CoA-мутазы другого происхождения также охватывается настоящим изобретением. Равным образом, в изобретение также включены трансформированные системы, которые обладают такой же или подобной активностью 3-гидроксикарбонил-CoA-мутазы, что и штамм НСМ-10 или таковой иного происхождения.

К таковым могут относиться мутанты, генетически модифицированные и изолированные производные микроорганизмов, например, организмы, которые обладают желательной кобаламин-зависимой мутазной активностью вследствие введения нуклеотидной последовательности, кодирующей мутазу.

Предпочтительно применяемая биологическая система (Stamm НСМ-10 - DSM 18028) синтезирует эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA в виде тиоэфиров из простых природных веществ, например сахаров, и/или органических кислот, и/или спиртов и их производных. В применяемой здесь предпочтительной системе эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA с помощью кобаламин-зависимой мутазы, перестраивающей углеродный каркас, преобразуют в эфиры 2-гидрокси-2-метилкарбонила-CoA, как это показано в уравнении 1 на примере (R)-3-гидроксибутирила-CoA. Тиоэфир-CoA гидролизуется в системе, а кислота выделяется в среду культивации.

Для способа согласно изобретению в качестве предпочтительных ферментативных катализаторов применяют содержащие кобаламин-зависимые мутазы штаммы микроорганизмов НСМ-10 (DSM 18028), Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) или Nocardioides sp. JS614, их сырые экстракты или части. Применяемые согласно изобретению штаммы предпочтительно производят белки (кобаламин-зависимые мутазы) с последовательностями SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 4 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 3 (HCM-10), производят белки с последовательностями SEQ ID NO: 5 и/или SEQ ID NO: 6 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8 (Xanthobacter autotrophicus Py2), производят белки с последовательностями SEQ ID NO: 9 и/или SEQ ID NO: 10 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых SEQ ID NO: 11 и/или SEQ ID NO: 12 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029) или производят белки с последовательностями SEQ ID NO: 13 и/или SEQ ID NO: 14 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых SEQ ID NO: 15 и/или SEQ ID NO: 16 (Nocardioides sp. JS614). В смысле изобретения указанные белки можно также применять в обогащенной, изолированной форме или изготовленные синтетическим путем.

Еще в одном предпочтительном варианте исполнения ферментативные катализаторы, в частности микроорганизмы, экстракты из них или их части и/или обогащенные или изолированные ферменты применяют в иммобилизованном виде. Путем иммобилизации ферменты, клеточные органеллы и клетки переводят в нерастворимое состояние, ограничивая их реакционным пространством. Их можно, например, иммобилизовать в полимерном матриксе (например, в гелях на основе альгинатов, поливиниловых спиртов или полиакриламида). Иммобилизацию можно также проводить на растворенных или нерастворенных материалах-носителях (например, Celit) в целях облегчения повторного извлечения и использования катализатора. Методы иммобилизации клеток в полимерном матриксе или на растворенном или нерастворенном носителе известны специалисту и были подробно описаны. Ферментативную активность также можно выделить из клеток. В этом случае ее можно непосредственно применять в иммобилизованном в полимерном матриксе или на растворенном или нерастворенном носителе виде как катализатор. Необходимые для этого методики известны специалисту и описаны, например, в Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G.F.Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997.

Преобразование 3-гидроксикарбоновых кислот в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты предпочтительно проводить в рамках непрерывного процесса, который можно реализовывать в проточном реакторе, где происходит рост микробов и, следовательно, образование продукта. Под непрерывным процессом можно, однако, подразумевать и любую систему растущих клеток и катализирующих ферментов, в которую с одной стороны подают питательный раствор и из которой, с другой стороны, отделяют раствор культуры, включая синтезированную ферментативным способом 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту. Согласно изобретению способ можно также реализовывать полунепрерывным или периодическим образом.

Как уже сказано, 3-гидроксикарбоновую кислоту, которая представляет собой исходное вещество для 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты, синтезируют предпочтительно путем ферментативного преобразования углеводов, и/или органических кислот, и/или спиртов или их производных. В связи с изобретением, помимо кобаламин-зависимой мутазы при необходимости применяют прочие ферменты, синтезирующие эфиры CoA, которые наличествуют в микроорганизмах или которые туда добавляют. При этом преобразование углеводов, и/или органических кислот, и/или спиртов или их производных в 3-гидроксикарбоновую кислоту и из 3-гидроксикарбоновой кислоты в 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту в рамках одного единственного этапа способа, т.е. преобразование исходных субстратов до 3-гидроксикарбоновой кислоты и ферментативная реакция преобразования 3-гидроксикарбоновой кислоты в соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту проходят в одном и том же реакционном растворе одновременно или с небольшим сдвигом во времени.

В крайне предпочтительном варианте исполнения способа для культивирования применяют субстрат с трет-бутиловым остатком в качестве источника углерода и энергии, предпочтительно, чтобы единственным источником углерода и энергии в базальной среде был трет-бутиловый спирт.

Способ согласно изобретению целесообразно применять для производства 2-гидрокси-2-метилпропановой кислоты (2-гидроксимасляной кислоты). Предпочтительный вариант синтеза 2-гидроксимасляной кислоты, кроме того, отличается тем, что извне добавляют 3-гидроксимасляную кислоту.

Способ можно реализовывать в аэробных условиях, предпочтительно - при использовании целых клеток, либо же в анаэробных, например, в условиях азотной атмосферы, предпочтительно - при использовании экстрактов или очищенных ферментов.

Также изобретение касается молекул нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с активностью кобаламин-зависимой мутазы, выбранных из групп, состоящих из:

a) Молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности нуклеиновых кислот, приведенные под номерами Seq № 2 и/или Seq № 4;

b) Молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеотидов, представленную под Seq № 1 и/или Seq № 3.

Было продемонстрировано, что фермент согласно изобретению предпочтительно представляет собой гетеродимерный протеин, включающий в себя субъединицы, описанные Seq № 2 и/или Seq № 4, и обладает, таким образом, выдающейся ферментативной активностью.

Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой молекулу ДНК, предпочтительно - комплементарной (кДНК) или геномной ДНК и/или молекулу РНК. Как нуклеиновые кислоты, так и белки можно выделять из природных источников, предпочтительно из DSM 18028, но также, например, из Methylibium petroleiphilum PM 1, Methylibium sp. R8 (Собрание штаммов UFZ Лейпциг), Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) или Nocardioides sp. JS614, либо же их можно синтезировать известными способами.

В применяемых согласно изобретению молекулах нуклеиновых кислот с помощью известных как таковых молекулярно-биологических методик можно вызывать мутации, что дает возможность синтезировать прочие ферменты с аналогичными или подобными свойствами, которые также применяют в способе согласно изобретению. Мутации могут представлять собой делеции, ведущие к образованию укороченных ферментов. Посредством иных молекулярных механизмов, как, например, инсерций, дупликаций, транспозиций, слияния генов, замены нуклеотидов или трансфера генов между различными штаммами микроорганизмов также можно создать модифицированные ферменты с аналогичными или подобными свойствами.

Идентификацию и выделение таких молекул нуклеиновых кислот можно проводить с применением молекул нуклеиновых кислот или их частей. Молекулы, подвергаемые гибридизации с молекулами нуклеиновых кислот, включают в себя также фрагменты, производные или аллельные варианты описанных выше молекул нуклеиновых кислот, кодирующих фермент, пригодный к применению согласно изобретению. Под фрагментами при этом подразумевают части молекул нуклеиновых кислот, которые обладают достаточной длиной, чтобы кодировать описанный фермент. Под производными подразумевают последовательности этих молекул, которые отличаются от последовательностей вышеописанных молекул нуклеиновых кислот в одном или нескольких положениях, но демонстрируют высокую степень гомологичности этим последовательностям. Гомологичность при этом означает идентичность последовательностей по меньшей мере на 40%, в частности, идентичность по меньшей мере на 60%, предпочтительно, более 80%, а особо предпочтительно, более 90%, 95%, 97% или 99% на уровне нуклеиновых кислот. При этом кодируемые ферменты демонстрируют идентичность приведенным последовательностям аминокислот по меньшей мере на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, особо предпочтительно, по меньшей мере на 95%, крайне предпочтительно, по меньшей мере на 99% на уровне аминокислот. Отклонения могут возникать по причине делеций, замещений (субституций), вставок (инсерций) или рекомбинации. При этом речь может идти о появляющихся естественным путем вариациях, например, о последовательностях из других организмов, или же о мутациях, причем эти мутации могут возникать естественным путем или посредством направленного мутагенеза (УФ-излучение, рентгеновские лучи, химические средства и т.п.). Кроме того, эти варианты могут представлять собой последовательности, созданные синтетическим путем. Эти варианты обладают определенными общими чертами, как, например, активностью фермента, активной концентрацией фермента, субъединицами, функциональными группами, иммунологической реактивностью, конформацией и/или физическими свойствами, как то: пробегом в гель-электрофорезе, хроматографическими признаками, растворимостью, коэффициентами седиментации, оптимальным значением рН, оптимальным значением температуры, спектроскопическими свойствами, стабильностью и/или иными свойствами.

Кроме того, объектом изобретения являются также новые белки с последовательностью № 2 и 4, а также гетеродимерный белок, включающий последовательность № 2 и последовательность № 4, а также таковые, гомологичные ему по меньшей мере на 99%.

SEQ ID NO: 1 демонстрирует включающую 1644 пар оснований последовательность нуклеотидов большой субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.

SEQ ID NO: 2 демонстрирует включающую 548 аминокислот последовательность аминокислот большой субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.

SEQ ID NO: 3 демонстрирует 369 пар оснований частичной последовательности нуклеотидов малой субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.

SEQ ID NO: 4 демонстрирует включающую 123 аминокислоты частичную последовательность [малой] субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.

SEQ ID NO: 5 и 6 демонстрируют включающие 562 или 135 аминокислот, соответственно, последовательности кобаламин-зависимой мутазы из Xanthobacter autotrophicus Py2.

SEQ ID NO: 7 и 8 демонстрируют 1689 или же 408 пар оснований, соответственно, последовательности нуклеотидов кобаламин-зависимых мутаз из Xanthobacter autotrophicus Py2.

SEQ ID NO: 9 и 10 демонстрируют включающие 563 или 135 аминокислот, соответственно, последовательности кобаламин-зависимой мутазы из АТСС 17029.

SEQ ID NO: 11 и 12 демонстрируют 1692 или 408 пар оснований, соответственно, последовательности нуклеотидов кобаламин-зависимых мутаз из Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029.

SEQ ID NO: 13 и 14 демонстрируют включающие 569 или 164 аминокислот, соответственно, последовательности кобаламин-зависимой мутазы из Nocardoides sp. JS614.

SEQ ID NO: 15 и 16 демонстрируют 1710 или 495 пар оснований, соответственно, последовательности нуклеотидов кобаламин-зависимых мутаз из Nocardoides sp. JS614.

Gjkextyyst согласно изобретению 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты можно выделять, обрабатывая среду культуры посредством известных способов (после удаления нерастворенных компонентов, как, например, микробных клеток). Такими способами являются, помимо прочего, концентрированно, ионообмен, дистилляция, электродиализ, экстракция и кристаллизация. Продукт можно выделять в виде соли или (после подкисления) в виде протонированной 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты.

2-Гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты (или их соответствующие соли) можно дегидратировать до соответствующих ненасыщенных 2-метилкарбоновых кислот целым рядом способов. Для получения ненасыщенных изоалкеновых кислот с 2-3 атомами углерода полученные 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты дегидратируют с помощью известных из уровня техники способов. Дегидратацию 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот можно проводить с использованием оксидов металлов, гидроксидов металлов, ионообменных смол, глинозема, диоксида кремния, аминов, фосфинов, алкоксидов и карбоксилатов щелочных металлов. Обычно температура реакции находится между 160°С и 250°С. Так, например, синтез метакриловой кислоты осуществляют путем дегидратации 2-гидроксиизомасляной кислоты в присутствии NaOH, при температуре ок. 185°С.

Полученная по этому процессу метакриловая кислота и ее гомологи находят целесообразное применение в различных отраслях промышленности, например, как добавки, либо же в лакокрасочных материалах. В отличие от известных до сих пор способов, в настоящем способе объединены желаемые преимущества низкотемпературного процесса, применения безвредных для окружающей среды исходных компонентов и сниженного образования отходов.

Ниже приведено более подробное описание изобретения на основании примеров исполнения, которыми оно, однако, не ограничено.

Материалы и методы

Микробный ферментативный катализатор

Микробные клетки штамма НСМ-10 (DSM 18028), обладающие активностью продукции 3-гидроксикарбонила-CoA-эфиров и изомеризации эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA, или изолированные из них субъединицы белков с последовательностями № 2 и № 4.

Рост микробного ферментативного катализатора

Микробный штамм, используемый для производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот, выделяли, как это описано ниже. Культуры штамма хранили в 20%-ном растворе глицерина в жидком азоте.

Штамм НСМ-10 из грунтовых вод обогащали трет-бутиловым спиртом в качестве единственного источника углерода и энергии на базальной среде (табл.1). Филогенетически штамм принадлежит к группе Rubrivivax-Leptothrix.

Таблица 1
Базальная среда (мг/л)
NH4Cl	761,4	Биотин	0,02
KH2PO4	340,25	Фолиевая кислота	0,02
K2 HPO4	435,45	Пиридоксин-HCl	0,1
CaCl2×6H2O	5,47	Тиамин-HCl	0,05
MgSO4×7H2O	71,2	Рибофлавин	0,05
ZnSO4×7H2O	0,44	Никотиновая кислота	0,05
MnSO4 ×H2O	0,615	DL-Ca-пантотенат	0,05
CuSO4×5H2O	0,785	парааминобензойная кислота	0,05
CoCl2 ×6H2O	0,2	Липоновая кислота	0,05
Na2MoO4×2H2O	0,252
FeSO4×7H2O	4,98	pH	7,0

Штамм НСМ-10 растили в аэробных условиях, подробности указаны в табл.2, для испытания на активность 3-гидроксикарбонил-CoA-мутазы.

Таблица 2
Штамм	Субстрат	Среда	Температура, °С	Продолжительность, сут
НСМ-10	Трет-бутиловый спирт (0,5 г/л)	Базальная среда	25	7

Клетки высаживали непосредственно после сбора. Интактные клетки можно было применять без дальнейшей предварительной обработки, как, например, повышения проницаемости (пермеабилизации) мембраны. Кроме того, клетки можно было применять после пермеабилизации (например, посредством обработки толуолом, ПАВ или после ряда циклов замораживания-оттаивания), что имело целью повысить скорость диффузионного транспорта веществ в клетки и из них.

Концентрацию 2-гидроксиизомасляной кислоты и 3-гидроксимасляной кислоты в жидкости или в реакционной емкости определяли с помощью газовой хроматографии после кислого метанолиза, применяя колонку FFAP и детектор FID.

Пример 1

Преобразование 3-гидроксимасляной кислоты в 2-гидроксиизомасляную кислоту штаммом НСМ-10.з

Суспензию из 1 г (сухая масса) клеток штамма НСМ-10 в 100 мл базальной среды поместили во флаконы для сыворотки емкостью 120 мл. В эту суспензию добавили 50 мг 3-гидроксимасляной кислоты и инкубировали суспензию на вращающемся встряхивающем устройстве при 30°С. По прошествии 0,3 часа инкубации в аэробных условиях суспензию продули азотом и инкубировали еще 4,4 часа при 30°С со встряхиванием. В различные моменты времени проводили отбор проб и после центрифугирования суспензии определяли содержание 2-гидроксиизомасляной кислоты и 3-гидроксимасляной кислоты в не содержащем клеток супернатанте. Было обнаружено, что 2-гидроксиизомасляная кислота является единственным продуктом, выделяющимся в анаэробной фазе. В начальной аэробной фазе, напротив, была полностью израсходована 3-гидроксимасляная кислота (Фиг.1). Выход 2-гидроксиизомасляной кислоты в этом случае составлял 5,1%, ок. 80% 3-гидроксимасляной кислоты остается в реакционной жидкости.

Пример 2

Преобразование 3-гидроксимасляной кислоты в 2-гидроксиизомасляную кислоту сырым экстрактом штамма НСМ-10

Не содержащий клеток экстракт штамма НСМ-10 создали после разрушения клеток в шаровой мельнице, фрагменты клеток затем отделили центрифугированием. Не содержащий клеток экстракт с концентрацией 10 мг белка в 5 мл калиево-фосфатного буферного раствора (50 мМ, содержит 1 мМ MgCl₂ при рН 7,2) поместили в закрывающиеся стеклянные сосуды емкостью 10 мл. Затем к этому экстракту добавили 0,01 мМ кофермента В12, 1 мМ коэнзима-А, 1 мМ АТФ и 4,25 мг 3-гидроксимасляной кислоты. Реакционную жидкость продули азотом, реакционный сосуд герметически закрыли и инкубировали со встряхиванием 2 часа при 30°С. Анализ продуктов реакции проводили так, как описано выше. Выход 2-гидроксиизомасляной кислоты в этом случае составлял 9%, ок. 88% 3-гидроксимасляной кислоты остается в реакционной жидкости (Фиг.2).

Пример 3

Дегидратация 2-гидроксиизомасляной кислоты до метакрилата

В раствор 2-гидроксиизомасляной кислоты (1 мг/5 мл), изготовленной согласно процедуре, описанной в примере 2, перемешивая, добавили NaOH (0.06 мг). Раствор, перемешивая и охлаждая флегмой, инкубировали при 185-195°С в вакууме (300 торр). На протяжении 5 часов ежечасно добавляли еще по одной аликвоте в размере 0,5 мг 2-гидроксиизомасляной кислоты на 5 мл, эти аликвоты дополнительно содержали 0,4% пара-метоксифенола по массе, что должно было воспрепятствовать полимеризации метакрилата. После инкубации в течение 24 часов реакцию завершили. Преобразование 2-гидроксиизомасляной кислоты в метакрилат составило 97%. Метакриловую кислоту отделяли от реакционной среды дистилляцией.