сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина и 4-винилпиридина

Классы МПК:C08F226/10 N-винилпирролидон
A61K31/79 полимеры винилпирролидона
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Кедик Станислав Анатольевич (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2011-10-05
публикация патента:

Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Предложен сополимер на основе N-винилпирролидона общей формулы (I):

сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838

где мономерное звено M1 представляет собой фрагмент 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено М2 - фрагмент 4-винилпиридина (ВП):

сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838

содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05-(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна М µ=15-250 кДа. Предложено также применение указанного сополимера в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1, агента против рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы, активатора фагоцитоза и адъюванта при изготовлении вакцины против гриппа. Технический результат - предложенный сополимер расширяет арсенал биологически активных соединений на основе сополимеров N-винилпирролидона и имеет более широкий спектр действия по сравнению с известными аналогами. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 14 пр.

Формула изобретения

1. Сополимер на основе N-винилпирролидона, представленный общей формулой (I):

сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 ,

где мономерное звено M1 представляет фрагмент 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено М2 представляет фрагмент 4-винилпиридина (ВП):

сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 ,

содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=15-250 кДа.

2. Сополимер по п.1, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-50 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна М µ=15-40 кДа.

3. Сополимер по п.2, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-40 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05-(m+k)-0,15·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=15-30 кДа.

4. Сополимер по п.1, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10-(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=45-250 кДа.

5. Сополимер по п.4, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 55-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10-(m+k)-0,25·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна М µ=50-150 кДа.

6. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 и интерейкина-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 .

7. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве агента против рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы.

8. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве активатора фагоцитоза.

9. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве адьюванта при изготовлении вакцины против гриппа.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Более конкретно изобретение относится к сополимеру на основе N-винилпирролидона, представленному общей формулой (I):

сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838

где мономерное звено M1 представляет собой фрагмент 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено M2 - фрагмент 4-винилпиридина (ВП):

сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838

содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев M2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна M µ=15-250 кДа.

Указанные сополимеры обладают противоопухолевой, иммуномодулирующей, фагоцитной и адъювантной активностью.

Уровень техники

В авторском свидетельстве SU 1578143 (опубл. 15.07.1990) описан сополимер N-винилпирролидона и 5-изопропенил-тетразола с молекулярной массой, определенной методом светорассеяния, равной 85 кДа, в котором содержание 5-изо-пропенилтетразольных звеньев составляет 0,40-0,74 мольн. доли, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита B.

Указанный сополимер получают радикальной сополимеризацией 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона в присутствии динитрила азоизомасляной кислоты в качестве инициатора сополимеризации с одновременной загрузкой всех компонентов реакционной смеси. В одном варианте радикальную сополимеризацию проводят в среде этанола, а целевой продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир. В другом варианте реакцию проводят в водной среде, необязательно, с добавлением водного раствора NaOH для повышения pH до 5,5, а целевой продукт выделяют фильтрованием или центрифугированием. В случае добавления щелочи стадии выделения продукта предшествует его осаждение в 0,1М раствор HCl. Наилучшей адъювантной активностью обладает сополимер, содержащий 0,74 мольн. доли 5-изопропенилтетразольных звеньев. В патенте RU 2000004 (опубл. 15.02.1993) раскрыты сополимеры N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой в диапазоне 29-40 кДа, содержащие 25-40 мольн.% 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев, обладающие иммуностимулирующим действием. В патенте RU 2015993 (опубл. 15.07.1994) указано, что эти сополимеры также проявляют противоопухолевое действие.

Указанные сополимеры получают радикальной сополимеризацией N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты в качестве инициатора сополимеризации, пероксида водорода и циклогексана в качестве регулятора молекулярной массы, а целевой продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир.

Наиболее близкий аналог настоящего изобретения раскрыт в патенте RU 2415876 (опубл. 10.04.2011), касающемся сополимера N-винилпирролидона, содержащего 25-90 мол.% мономерных звеньев 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой 46-250 кДа, который может применяться в качестве адъюванта при изготовлении вакцины против гриппа.

Описание изобретения

Целью данного изобретения является расширение арсенала биологически активных соединений на основе сополимеров N-винилпирролидона, которые могут найти применение в медицине. Авторы настоящего изобретения провели исследования и установили, что сополимеры на основе N-винилпирролидона (N-ВП), содержащие не только мономерные звенья 2-метил-5-винилпиридина (МВП), но также и фрагменты 4-винилпиридина (ВП), обладают более широким спектром действия, и в некоторых случаях их активность значимо превышает активность известных аналогов.

Авторы установили, что отношение наблюдаемых констант сополимеризации N-ВП с МВП и N-ВП с ВП практически постоянно во всем диапазоне температур и концентраций реагентов, в которых проводят сополимеризацию. При этом константы полимеризации N-ВП и МВП или ВП различаются более чем на порядок, вследствие чего МВП и ВП расходуются быстрее, чем N-ВП. Поэтому для синтеза сополимера заданного состава необходимо компенсировать расход мономеров подпиточной смесью. Учет выявленных закономерностей позволяет получать сополимеры в соответствии с изобретением, в которых мольные доли звеньев МВП и ВП определяются соотношениями МВП и ВП в подпиточной смеси.

В соответствии с первым вариантом данного изобретения получают сополимер формулы (I), в котором содержание мономерных звеньев Ml и М2 (m+k) составляет 20-50 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-40 кДа.

Предпочтительно содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-40 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,15·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-30 кДа.

В соответствии со вторым вариантом данного изобретения получают сополимер формулы (I), в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=45-250 кДа.

Предпочтительно содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 55-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10·(m+k)-0,25·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=50-150 кДа.

Настоящее изобретение относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 и интерлейкина-сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 .

Среди белков семейства ИЛ-1 главным эндогенным медиатором защитных реакций организма служит интерлейкин-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 (ИЛ-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 ). В частности, различные типы клеток синтезируют и секретируют ИЛ-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 в ответ на повреждение тканей, например, под воздействием ионизирующих излучений, тогда как ИЛ-1сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 существует, в основном, в виде мембранной формы. Одно из главных свойств обоих типов ИЛ-1 заключается в способности стимулировать функциональную активность многих типов лейкоцитов и лимфоцитов в ходе развития иммунного ответа на воспаление и пролиферацию злокачественных клеток. Кроме того, ИЛ-1 стимулирует костномозговое кроветворение и воздействует на функции фибробластов и эндотелиальных клеток.

Благодаря своим свойствам рекомбинантный ИЛ-сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина   и 4-винилпиридина, патент № 2459838 человека находит применение в клинической практике. Например, медицинский препарат «Беталейкин» разрешен к медицинскому применению в РФ (Приказ Минздрава РФ № 51 от 18.02.1997 г., рег. № 97/51/6) в качестве иммуностимулятора и как средство восстановления костномозгового кроветворения у раковых больных после интенсивных курсов химио- и радиотерапии. С этой целью препарат применяется у онкологических больных для восстановления подавленного лейкопоэза. Его применение ведет к значительному сокращению сроков нейтропении, снижению частоты суперинфекций и увеличению выживаемости, что подтверждается результатами сравнений с данными медицинской статистики за предшествующие десятилетия. Кроме того, «Беталейкин» используется как гемостимулирующее средство при пересадках костного мозга.

Таким образом, сополимеры настоящего изобретения могут найти применение в качестве агентов, повышающих терапевтическую эффективность обеих форм интерлейкина-1 при лечении онкологических заболеваний, особенно с применением лучевой терапии, а также как средства, улучшающие общее состояние больного, за счет восстановления показателей гемопоэза. К указанным онкологическим заболеваниям относятся, в первую очередь, злокачественные поражения печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы.

В связи с вышеописанным настоящее изобретение также относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве противоракового агента, где рак выбран из группы, состоящей из рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы.

Далее настоящее изобретение относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве активатора фагоцитоза.

Настоящее изобретение далее относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве адъюванта при изготовлении вакцин. Предпочтительно применять сополимер для приготовления вакцины против гриппа.

Для реализации первого и второго вариантов изобретения проводят радикальную сополимеризацию N-ВП и смеси МВП и ВП в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты (ДАК) в качестве инициатора сополимеризации, пероксида водорода (ПВ) и циклогексана (ЦГ) в качестве регулятора молекулярной массы. Продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир (ДЭ).

Исходная реакционная смесь содержит 83,5-92,0 мас.% N-ВП, 1,5-9,5 мас.% смеси МВП и ВП, 6,5-7,0 мас.% ЦГ, 0,1 мас.% ПВ и 0,4 мас.% ДАК. Подпиточная смесь содержит 7-72 мас.% N-ВП, 27,5-92,5 мас.% смеси МВП и ВП, 0,2 мас.% ПВ и 0,4 мас.% ДАК.

Требуемое содержание 4-винилпиридиновых мономерных звеньев М2 (k) обеспечивается введением соответствующих количеств ВП как в исходную, так и в подпиточную смеси. Например, если требуется получить сополимер, содержащий около 60 мольн.% N-ВП с содержанием мономерных звеньев M1 и М2 (m+k), равным приблизительно 40 мольн.% и долей мономерных звеньев М2 на уровне 0,05·(m+k), то подпиточная смесь должна содержать 60 мольн.% N-ВП, 38 мольн.% МВП и 2 мольн.% ВП. Учитывая различие в скоростях полимеризации, исходная реакционная смесь должна иметь на порядок меньшее содержание МВП и ВП: 3,8 мольн.% МВП и 0,2 мольн.% ВП, и ее остаток, т.е. 96 мольн.%, должен составлять N-ВП.

Применяя проиллюстрированный выше подход, можно заранее оценивать составы исходной реакционной смеси и подпиточной смеси. При необходимости, можно более точно определять содержания каждого из реагентов по данным анализа полученного продукта. Продукт характеризуется, в частности, числом мономерных звеньев МВП (m) и ВП (k). В одном варианте его вычисляют по данным элементного анализа с учетом стехиометрии сополимера. Получение необходимых для этого расчетных формул доступно среднему специалисту в данной области. В другом варианте строение полученного продукта определяют по данным ЯМР-спектрометрии, например 1 H-, 13C- или 15N-ЯМР, по соотношениям интегральных интенсивностей сигналов определенных ядер. Решение указанной задачи также доступно среднему специалисту в данной области.

Объем подпиточной смеси вычисляют каждые 10-20 минут по результатам анализа соотношения концентраций мономеров в реакционной смеси. Реакцию сополимеризации проводят при температуре 60-70°C. По достижении степени конверсии по мономерам около 20-25% реакционную массу охлаждают до 20°C и осаждают в диэтиловый эфир.

В одном варианте подпиточную смесь готовит и добавляет оператор (аппаратчик), основываясь на данных анализа и регламенте синтеза. В другом варианте добавление подпиточной смеси осуществляется автоматически с помощью системы контроля и управления синтезом. Такая система объединяет высокоэффективный жидкостный хроматограф, управляющее устройство и исполнительные устройства. В качестве управляющего устройства может быть использована ЭВМ, реализующая алгоритм управления синтезом, построенный на основе математической модели процесса. В качестве исполнительных устройств могут быть использованы управляемые запорные устройства, например клапаны с пневматическим или электромеханическим приводом.

Для контроля протекания реакции, а также для определения физико-химических характеристик продукта, применяют средства анализа и методы, описанные выше. Кроме того, для обеспечения экспрессности анализа применяют ВЭЖХ. Условия хроматографирования и способ детектирования аналитического сигнала могут быть определены средним специалистом в данной области на основании знаний в рамках известного уровня техники. Предпочтительно применение ОФ-ВЭЖХ с элюированием водно-спиртовыми элюентами, в частности - с градиентным элюированием. В качестве детектора может применяться УФ-спектрометр.

Полученный продукт также характеризуется средневязкостной молекулярной массой, которую вычисляют по характеристической вязкости сополимеров. Выбор методики и подбор условий измерения вязкости является рутинной процедурой, доступной среднему специалисту в данной области. В одном варианте характеристическую вязкость определяют в растворителе, состоящем из 85 об.% ДМФА и 15 об.% 0,1М водного раствора LiBr.

При необходимости для усиления определенного вида активности сополимера в соответствии с настоящим изобретением продукт реакции с широким молекулярно-массовым распределением может быть дополнительно фракционирован, например, методом гель-хроматографии. Условия выполнения фракционирования известны среднему специалисту в данной области. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением имеется возможности регулировать диапазон средневязкостной молекулярной массы Mµ сополимера на стадии синтеза, изменяя количества ПВ и ЦГ.

В частности, сополимеры по п.1, в которых содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-50 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-40 кДа, обладают более выраженными свойствами активаторов фагоцитоза и продуцирования интерлейкинов, а также противораковыми свойствами по сравнению с адъювантными свойствами. Сополимеры, в которых содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=45-250 кДа, обладают более выраженными адъювантными свойствами и свойствами активаторов фагоцитоза.

Присутствие у соединений указанных видов активности может быть подтверждено исследованиями in vivo. Специалисту в данной области очевиден выбор вирусов и их серотипов, а также подопытных животных, в качестве которых могут быть использованы млекопитающие и птицы. В одном из вариантов млекопитающими являются беспородные белые мыши. В другом варианте млекопитающими являются морские свинки.

Сополимеры в соответствии с любым из вариантов настоящего изобретения являются нетоксичными. В качестве признаков токсического воздействия сополимера на подопытных животных могут рассматриваться, например, гибель, снижение массы тела, изменения походки и поведения, цвета мочи, консистенции экскрементов, состояния глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата.

Далее приведены иллюстративные примеры осуществления изобретения, способствующие более точному и полному пониманию его сути. Специалисту в данной области очевидны возможные модификации и замены, например, относящиеся к протоколам исследований, которые не выходят за рамки формулы изобретения.

Пример 1. Получение сополимера N-винилпирролидона (N-ВП), 2-метил-5-винилпиридина (МВП) и 4-винилпиридина (ВП)

В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,30 кг (2,21 л) N-ВП (90,5 мас.%), 35,9 г (44 мл) МВП (1,5 мас.%), 1,7 г (1,8 мл) ВП (0,1 мас.%), 2,9 г (3,1 мл) 30% водного раствора пероксида водорода (ПВ)(0,1 мас.%), 190 г (245 мл) циклогексана (ЦГ) (7,5 мас.%) и 10,0 г ДАК (0,4 мас.%). Реакционную массу нагревают до 60-70°C и ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб C-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOH/H2O 6:94, 2,5 мл/мин (50°C), 254 нм) и подавая подпиточную смесь, содержащую 450 г (433 мл) N-ВП (77,5 мас.%), 121,3 г (127 мл) МВП (20,9 мас.%), 5,6 г (5,9 мл) ВП (1,0 мас.%), 1,2 г (1,1 мл) 30% водного раствора ПВ (0,2 мас.%) и 2,6 г ДАК (0,4 мас.%). По достижении степени конверсии по мономерам 20-25% реакционную массу охлаждают до 20°C и осаждают в диэтиловый эфир. Целевой продукт промывают на фильтре 2 л ДЭ, выделяют фильтрацией и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°C, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°С. Получают 550 г аморфного порошка белого цвета, растворимого в воде (10 мас.% водный раствор имеет pH 7,12), с суммарным содержанием звеньев МВП и ВП равным 21 мольн.% и долей звеньев ВП равной 0,048. Мµ сополимера: 15-40 кДа.

Примеры 2-7. Синтез и выделение сополимеров осуществляют в условиях, указанных в Примере 1. Состав исходной и подпиточной смесей, а также выход сополимера (Вых), содержание в нем звеньев МВП и ВП (m+k, мольн.%), доля звеньев ВП (k) и интервалы средневязкостной молекулярной массы Mµ сополимера приведены в Таблице 1.

Таблица 1
Пр. Реакционная смесь Подпиточная смесь Вых. г m+k kM µ, кДа
N-ВП, гМВП, г ВП, г ПВ, гЦГ, г N-ВП, г МВП, гВП, г ПВ, г
22300 86,78,4 1,7195 350114,8 11,11,3 55725 0,0915-30
3 2300163,0 25,31,7 195180 119,118,7 1,3542 420,15 45-90

Таблица 1 (продолжение)
Пр. Реакционная смесь Подпиточная смесь Вых. г m+k kM µ, кДа
N-ВП, гМВП, г ВП, г ПВ, гЦГ, г N-ВП, г МВП, гВП, г ПВ, г
42300 183,869,5 1,6195 5240,3 15,11,2 56551 0,3075-150
5 2300194,1 71,81,5 19549 34,111,7 1,1552 500,29 135-250
62300 92,18,9 1,6195 420132,4 13,51,3 68325 0,1015-40
7 2300174,9 38,71,6 195170 231,967,8 1,2678 630,25 55-95
8 2300 201,276,2 1,7200 45405,8 143,21,1 75692 0,2980-145
9 2300214,4 82,31,7 20041 402,6132,3 1,1 73591 0,30140-250

Пример 10. Исследование in vivo острой токсичности сополимеров в соответствии с изобретением

Исследование проводят в группе из 6 здоровых беспородных белых мышей массой 18-22 г. Сополимер, полученный в соответствии с каждым из Примеров 1-6, растворяют в стерильном изотоническом растворе NaCl из расчета 5 мас.% и вводят каждому животному 1,0 мл этого раствора. Соединение считают выдержавшим испытание, если через 7 суток наблюдения в группе не погибло ни одно животное. В исследовании, проведенном для сополимеров, полученных в Примерах 1-9, гибели животных не отмечено.

Пример 11. Исследование in vivo аномальной токсичности противогриппозной вакцины, содержащей сополимеры в соответствии с Примерами 1, 3, 5 и 9

Аномальную токсичность исследуют при однократном внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам одной прививочной дозы вакцины (0,5 мл), содержащей соединения Примера 4, 6 или 7 в качестве адъюванта. Самцов и самок мышей с массой тела 18-22 г разделяют на 5 опытных и 1 контрольную группу по 5 животных в каждой. Перед началом исследований животные проходят карантин при групповом содержании в клетках, а также подробный клинический осмотр непосредственно перед формированием групп.

Проявление аномальной токсичности определяют по результатам наблюдений в течение 7 суток, регистрируя следующие события и характеристики (качественные оценки): гибель животного, походка и поведение, цвет мочи, консистенция экскрементов, состояние глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата. Количественной оценкой может служить усредненное по группе изменение массы тела животных за 7 суток.

Ни одного факта гибели животного как в контрольной, так и в опытных группах, не наблюдалось. Походка, поведение, цвет мочи, консистенция экскрементов, состояние глаз и ушей оставались неизменными в течение всего периода наблюдений. Выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата также не отмечено.

Данные об изменении массы тела подопытных животных, наблюдаемых в течение 7 суток, представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Группа СС*, мкг Изменение массы тела подопытных животных, г (среднее по группе)
Пример 1 Пример 3 Пример 5Пример 9
1 125 5,73,1 4,92,9
2 2505,2 3,34,3 3,2
3 500 6,12,8 4,74,0
4 10005,4 3,55,1 3, 6
5 2000 5, 63,3 4,93,1
Контроль -6,3 4,45,2 3,7
*СС - содержание сополимера.

Анализ данных свидетельствует об отсутствии аномальной токсичности у противогриппозной вакцины, содержащей сополимеры в соответствии с изобретением.

Пример 12. Исследование адъювантного действия сополимеров в соответствии с изобретением

Метод исследования основан на выявлении прироста специфических антител в сыворотке крови после двукратного, с интервалом 7 суток, внутрибрюшинного введения вакцины беспородным белым мышам.

Вакциной является гриппозная тривалентная субъединичная жидкая вакцина. В 1 дозе (0,5 мл) вакцины содержится по 5 мкг гемагглютинина вируса гриппа подтипов A (H1N1) и A (H3N2), 11 мкг гемагглютинина вируса гриппа подтипа B и 85-115 мкг/мг консерванта (мертиолят). В качестве иммуномодулятора (адъюванта) применяют сополимеры, полученные в соответствии с Примерами 3 и 8 (Серии 1 и 2 соответственно) или сополимер, раскрытый в Примере 11 патента RU 2415876 (Серия 3). Данные о приросте титра представлены в Таблице 3.

Таблица 3
Гр. CA, мкг Титр антител (среднее по группе)
Серия 1* Серия 2* Серия 3*
H3N2H1N1 ВH3N2 H1N1B H3N2H1N1 B
1 125 1:701:15 1:151:90 1:201:20 1:701:15 1:10
2 250 1:601:2 1:101:75 1:151:10 1:501:20 1:10
3 500 1:701:20 1:101:90 1:201:10 1:601:15 1:15
4 1000 1: 901:20 1:101:100 1:201:20 1:701:20 1:15
5 2000 1:701:20 1:151:90 1:301:15 1:701:20 1:10
Контр. - 1:101:10 1:101:10 1:101:10 1:101:10 1:10
СА - содержание адъюванта; * исходный титр - 1:10.

На основании полученных данных можно заключить, что вакцина, содержащая соединение в соответствии с Примером 8 настоящего изобретения, является более эффективной, чем аналогичная вакцина известного уровня техники. Вакцина, содержащая соединение в соответствии с Примером 3 настоящего изобретения, проявляет сопоставимую активность.

Пример 13. Исследование противораковой активности сополимеров в соответствии с изобретением

Самок беспородных белых крыс с массой тела 250-300 г разделили на 6 групп по 50 крыс в каждой группе. Животным первой группы по схеме вводили изотонический раствор (негативный контроль), вторая группа получала внутримышечно по схеме сополимер в соответствии с Примером 2 настоящего изобретения, третья группа получала внутримышечно по схеме сополимер в соответствии с Примером 3 патента RU 2415876. Животным четвертой группы по схеме вводили изотонический раствор после введения дозы нитрата плутония-239, достаточной для индуцирования подострого поражения (405 кБк/кг, позитивный контроль). Крысам пятой группы была введена такая же доза нитрата плутония-239, после чего они получали внутримышечно по схеме сополимер в соответствии с Примером 2 настоящего изобретения. Крысам шестой группы, также получившим нитрат плутония-239 в дозе, соответствующей 405 кБк/кг, внутримышечно по схеме вводили сополимер в соответствии с Примером 3 патента RU 2415876. Схема введения сополимеров: первый месяц - 0,5 мл 1 раз в неделю, второй месяц - 0,5 мл 1 раз в 2 недели, третий месяц - 0,5 мл 1 раз в 4 недели.

Через 420 суток после начала исследования в группе негативного контроля (группа 1) осталось 37 крыс (смертность: 26%). В группах 2 и 3 осталось 27 и 28 крыс соответственно (смертность: 10 и 7%). В группе позитивного контроля выжило 2 крысы (смертность: 93%), тогда как в группах 4 и 5, получавших сополимеры внутримышечно и перорально, выжило по 5 крыс (смертность: 83%).

Показатели периферической крови по группам крыс приведены в таблице 4.

Таблица 4
Тип воздействия Лейкоциты, тыс./мм 3Эритроциты, млн./мм3 Гемоглобин
1Негативный контроль 8,5±1,1 4,723180
2 Сополимер Примера 2* 7,2±0,64,310 175
3Сополимеры Примера 3**7,7±0,7 4,508 174
4 Позитивный контроль 21, 8±3,3 5,170155
5 239Pu+сополимеры Примера 2* 15,2±2,24,863 164
6239 Pu+сополимеры Примера 3** 15,2±2,24, 863164
* Пример 2 настоящего изобретения.
** Пример 3 патента RU 2415876.

Результаты некропсии крыс, умерших до момента окончания исследования, а также животных, умерщвленных по окончании исследования, показывают, что опухоль в подмышечной впадине в группах 5 и 6, в среднем, имеет объем в 2-3 раза меньший, чем в группе позитивного контроля. Злокачественные изменения печени и/или почек в этих группах также зарегистрированы в 2-3 раза реже по сравнению с группой позитивного контроля.

В результате проведенных исследований констатируется, что введение сополимеров в соответствии с настоящим изобретением оказывает статистически значимое подавляющее действие на развитие злокачественных опухолей в печени и почках подопытных животных, а также улучшает общие показатели анализа крови. При этом, введение сополимера в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения по показателям общего анализа крови (снижение выраженности лейкопении, снижение содержания эритроцитов) способствует улучшению состояния подопытных животных в большей степени, чем введение его известного аналога.

Пример 14. Исследование активности перитонеальных макрофагов в присутствии красителя Нейтрофильного красного

Оценку фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов проводили по интенсивности поглощения ими красителя Нейтрофильного красного (Таблица 5) или коллоидной туши (Таблица 6). Сополимеры применяли в дозе 50 мг/кг в объеме 250 мкл. Животным контрольной группы вводили равный объем воды для инъекций.

Краситель вводили мышам внутрибрюшинно в виде 0,05% суспензии в объеме 2 мл. Исследование проводили через 24 часа после завершения курса введения сополимера или воды. Количество поглощенного красителя определяли по оптической плотности перитонеального лизата при длине волны 620 нм.

Таблица 5
Препарат Показатели фагоцитарной активности (ФА)
3 сутки 5 сутки
ФА, %Изменение ФА, %ФА, % Изменение ФА, %
Сополимер Пример 1*67 16352 149
Сополимер Пример 4*58 141 49138
Сополимер Пример 6*63 15453 151
Сополимер Пример 3**59 144 48137
Контроль 41100 35100
* Примеры 1, 4 и 6 настоящего изобретения.
** Пример 3 патента RU 2415876.

В аналогичных условиях мышам внутрибрюшинно вводили 2 мл 0,05% суспензии коллоидной туши. Исследование проводили через 24 часа после введения сополимера мышам. Через 10 минут после введения туши брюшную полость мышей промывали 5 мл изотонического раствора NaCl. Собранные клетки перитонеального экссудата трижды отмывали и суспендировали в 1 мл изотонического раствора NaCl. Процент фагоцитирующих клеток (%ФК) определяли по результатам микроскопического подсчета. После этого клетки осаждали центрифугированием, удаляли супернатант, и осадок клеток лизировали водой для инъекций. Лизаты помещали в фотометрические планшеты и определяли светопоглощение при длине волны 620 нм, пропорциональное количеству туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами. Фагоцитарный индекс (ФИ), вычисляемый как отношение светопоглощения к числу фагоцитирующих клеток, отражает степень активации фагоцитоза. Индекс завершенности фагоцитоза, т.е. отношение среднего числа частиц (ФК), поглощенное одной фагоцитирующей клеткой за 1 ч, к ФК за 2,5 ч, отражает переваривающую способность фагоцитов.

Таблица 6
Препарат%ФК ФИ ИЗФ
Сополимер Пример 1*71,2±1,7 8,9±1,2 34,7±9,4
Сополимер Пример 4* 67,1±2,28,2±1,1 30,7±8,3
Сополимер Пример 6*70,9±1,4 8,5±1,1 32,6±9,7
Сополимер Пример 3** 68,7±1,38,3±1,0 31,4±12,8
Контроль 56,0±5,77,0±1,0 13,5±5,1
* Пример 2 настоящего изобретения;
** Пример 3 патента RU 2415876;
%ФК - процент фагоцитирующих клеток;
ФИ - фагоцитарный индекс;
ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза.

Исследованные соединения, вводимые внутримышечно в дозе 50 мг/кг, статистически достоверно увеличивали фагоцитарную активность на 15-45% по сравнению с контролем в исследованиях с красителем Нейтрофильным красным, а также повышали долю фагоцитирующих клеток на 8-23%, а индекс завершенности фагоцитоза - на 85-138% в исследованиях с частицами коллоидной туши. В последнем случае отмечалось, что введение сополимеров, практически не изменяя числа фагоцитирующих клеток, в 1,5-2 раза увеличивает переваривающую способность макрофагов. Сополимеры, полученные в соответствии с Примерами 1 и 6 настоящего изобретения, обладают несколько более высокой активностью, чем их известный аналог. Активность сополимера Примера 4 сопоставима с активностью аналога.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2459838

patent-2459838.pdf

Класс C08F226/10 N-винилпирролидон

композиция для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах -  патент 2461625 (20.09.2012)
сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и n-винилпирролидона, обладающие свойствами активаторов фагоцитоза -  патент 2430933 (10.10.2011)
сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и n-винилпирролидона, активирующие продуцирование интерлейкина-1, и их применение в качестве противораковых агентов -  патент 2430932 (10.10.2011)
сополимеры на основе n-винилпирролидона -  патент 2415876 (10.04.2011)
способ получения полимерного водорастворимого производного бетулоновой кислоты -  патент 2393174 (27.06.2010)
сополимеры n-виниламидов с ненасыщенными эфирами сорбозы -  патент 2381239 (10.02.2010)
способ получения поливинилпирролидона -  патент 2374268 (27.11.2009)
способ изготовления тонированных мягких контактных линз -  патент 2369888 (10.10.2009)
способ получения биосовместимых сополимеров n-винилпирролидона с алкилакрилатами -  патент 2345096 (27.01.2009)
водорастворимые полимерные комплексы антибиотиков-аминогликозидов -  патент 2335510 (10.10.2008)

Класс A61K31/79 полимеры винилпирролидона

вискоэластичный раствор для контрастирования задней гиалоидной мембраны -  патент 2527767 (10.09.2014)
средство для профилактики мастита у дойных коров в сухостойный период -  патент 2521401 (27.06.2014)
водорастворимая бактерицидная репаративная композиция -  патент 2521209 (27.06.2014)
водорастворимая бактерицидная композиция -  патент 2517063 (27.05.2014)
композиция для лечения инфекций бактериальной этиологии у животных -  патент 2514647 (27.04.2014)
офтальмологический препарат в виде глазных капель, содержащий разветвленные полигексаметиленгуанидины и сополимер на основе n-винилпирролидона -  патент 2509562 (20.03.2014)
имплантируемое лекарственное средство на основе налтрексона для лечения пациентов, зависимых от алкоголя или опиатов -  патент 2476209 (27.02.2013)
биоцидные капсулы, содержащий их препарат и тампон, содержащий препарат -  патент 2474417 (10.02.2013)
состав, имитирующий внутрисуставную жидкость, и способ получения добавки к ней -  патент 2473352 (27.01.2013)
способы получения антибактериальных контактных линз -  патент 2471505 (10.01.2013)
Наверх