выделенный пептид для усиления ранозаживляющей активности кератиноцитов, композиция для заживления ран у млекопитающего и лекарственное средство для применения при заживлении ран у млекопитающего

Формула изобретения

1. Выделенный пептид, пригодный для усиления ранозаживляющей активности кератиноцитов по сравнению с SEQ ID NO:1, где последовательность пептида состоит из от четырех до четырнадцати смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO:1 и где пептид характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:15.

2. Пептид по п.1, где пептид содержит или L-, или D-энантиомерную форму аминокислот или их сочетание.

3. Пептид по п.1, где пептид амидирован или липидизирован.

4. Пептид по п.1, в котором на N-конце находится остаток метионина, валина, лизина или глутаминовой кислоты.

5. Пептид по п.1, в котором на С-конце находится остаток лизина, валина, глицина или аспарагина.

6. Композиция для заживления ран у млекопитающего, содержащая эффективное количество, по меньшей мере, одного пептида по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Композиция по п.6, где пептид присутствует в концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.

8. Композиция по п.6, где пептид присутствует в концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 20 мкг/мл.

9. Композиция по п.6, где композиция находится в форме аэрозоля, эмульсии, жидкости, лосьона, крема, пасты, мази, порошка или пены.

10. Лекарственное средство для применения при заживлении ран у млекопитающего при применении в терапевтически эффективном количестве в течение эффективного количества времени, где указанное лекарственное средство содержит фармацевтически приемлемый носитель и пептид, где последовательность пептида состоит из от четырех до четырнадцати смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO:1 и, где пептид содержит SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:15.

11. Лекарственное средство по п.10, где рана затрагивает кожу или связанные ткани слизистых указанного млекопитающего.

12. Лекарственное средство по п.10, где причинами раны являются истирание, волдырь, ожог, разрыв, язва, синяк, сыпь, рубец или влияние старения или воздействие факторов окружающей среды.

13. Лекарственное средство по п.10, где терапевтически эффективное количество композиции содержит пептид в концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.

14. Лекарственное средство по п.10, где пептид амидирован или липидизирован.

Описание изобретения к патенту

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 60/878849, поданной 5 января 2007 г., которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

Изобретение относится к пептидам, обладающим биологической и терапевтической активностью. В частности, изобретение относится к коротким пептидам, имеющим от четырех до четырнадцати смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO:1, которые проявляют пролиферативную, миграционную и противовоспалительную активности по отношению к клеткам, таким как кератиноциты. Кроме того, изобретение относится к способам применения этих пептидов для лечения различных поражений, затрагивающих кожу и другие относящиеся к организму поверхности, например ротовую полость.

Предпосылки изобретения

Эпидермис кожи состоит из четырех-пяти раздельных слоев, каждый из которых в основном содержит кератиноциты; в эпидермисе также присутствуют другие типы клеток, такие как фибробласты. Большинство кератиноцитов происходят из нижнего базального слоя эпидермиса и постепенно мигрируют в самую поверхностную часть кожи, где они ороговевают и, в конечном итоге, слущиваются. В процессе этой миграции кератиноциты дифференцируются для экспрессии ферментов и структурных белков, необходимых для ороговения (Presland and Dale, 2000). Исходя из их значительной роли в формировании эпидермиса кератиноциты представляют собой основную мишень для лечения поврежденной кожи.

Кератиноциты также являются основным компонентом тканей слизистых оболочек, которые сопряжены с эпидермисом (Presland and Dale, 2000). Такие ткани нуждаются в непроницаемом ороговевающем слое эпидермиса и формируют внутренние выстилающие поверхности, относящиеся к полости рта, носа, горла, уха, анальному отверстию и гениталиям. Аналогично коже поверхности слизистых оболочек важны для предотвращения проникновения возбудителей инфекции в организм; таким образом, повреждение любого из этих типов ткани может подвергнуть риску здоровье индивидуума.

Повреждение кожи и ткани слизистой происходит, когда нарушена целостность эпидермального слоя, например, из-за разрыва, ожога или волдыря. Повреждение может также включать сдавливание или ушиб, которые включают повреждение ткани без одновременного разрыва эпидермиса. Кожные инфекции, а также некоторые хронические заболевания, такие как злокачественная опухоль и аутоиммунные заболевания, также могут вызывать повреждения на поверхности эпидермиса. Язвы, такие как те, которые поражают диабетиков, или те, которые связаны с пролежнями, представляют собой другую форму повреждения кожи; эти раны часто являются действительно трудноизлечимыми, воспаляемыми, подверженными инфекции и требующими длительного заживления. Как правило, считают, что присутствие язвы или каких-либо других хронических ран является следствием нарушения клеточных процессов, вовлеченных в заживление, таких как клеточная сигнализация (Enoch and Price, 2004; Sweitzer et al., 2006). Одним из нарушений является невозможность эпителизации участка повреждения - кератиноциты у края раны, несмотря на способность к пролиферации, не способствуют закрытию язвы (Enoch and Price, 2004). Другим нарушением в отношении диабетических язв является отсутствие определенных сигнальных молекул; этот дефект может препятствовать процессам ремоделирования, которые необходимы для контроля за закрытием раны (Sweitzer et al., 2006).

Другие формы повреждения эпидермиса малозаметны и возникают в течение длительного времени, нарушая, в конечном итоге, функцию кожи при наличии острого повреждения; заживление раны длительно по времени и может происходить неидеально (например, с образованием рубца). Косметические проблемы, такие как образование морщин, сухость, истончение, обвисание и повышенная чувствительность к образованию синяков, являются обычными внешними проявлениями таких нарушений. Неудивительно, что эти проявления изношенности обычно связаны со старением, но также могут возникать преждевременно в результате длительного воздействия повреждающих средств, таких как ультрафиолетовое излучение (фотостарение). Фотореактивные процессы, вызванные солнечным светом, могут способствовать уменьшению толщины и эластичности кожи, а также повышению жесткости кожи (Pelicci, 2004; Fisher et al., 2002).

Заживление острых ран кожи и слизистой контролируется частично через активацию базальных кератиноцитов, которая сопровождает путь пролиферации, миграции и дифференцировки для обеспечения закрытия раны. Этот процесс сопровождается рядом ремоделирующих видов активности в участке повреждения (Enoch and Price, 2004). Кератиноциты, расположенные по периметру раны, пролиферируют и мигрируют для формирования одного слоя над раной в процессе, называемом эпителизацией. Затем при пролиферации и дифференцировке кератиноцитов образуется слой эпидермиса, содержащий нормальные чередующиеся слои. Воспалительные процессы могут способствовать заживлению раны; инфильтрующие моноциты борются с инфекцией, а также высвобождают факторы, которые стимулируют эпителизацию раны. Однако воспалительные процессы могут также затруднять заживление; например, отложение фибрина макрофагами способствует образованию рубца. При условии поддержания антисептических условий было показано, что закрытие раны эпидермисом происходит быстрее и с менее выраженным рубцеванием, если вовлечение иммунитета ограничено (Martin and Leibovich, 2005). Именно благодаря этим взглядам в настоящее время рассматривают способы подавления воспаления при повреждении эпидермиса.

Было показано, что некоторые факторы, включая эпидермальный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста кератиноцитов (KGF) и факторы роста тромбоцитов (PDGF), стимулируют эпителизацию кератиноцитами в процессе заживления раны в коже и связанных тканях слизистых (Enoch and Price, 2004). Интересно, что про некоторые антибактериальные белки, присутствующие на коже и поверхностях слизистых, также известно, что они играют роль в стимуляции клеточной пролиферации и миграции, необходимых для заживления ран эпидермиса (Shaykhiev et al., 2005; Braff and Gallo, 2006; Zhang and Falla, 2006).

Зная, что определенные факторы роста естественным образом вовлечены в процесс заживления ран, работа была направлена на разработку основанных на факторах роста способов лечения ран, особенно тех, которые, в общем, являются хроническими. Например, способ лечения диабетических язв с помощью PDGF-BB (Mustoe et al., 1994; Steed, 1995) получил одобрение FDA. Однако большинство попыток применения такой стратегии потерпело неудачу в достижении клинически значимых результатов частично из-за затруднений, связанных с использованием терапевтических белков. Одна из проблем связана с неэффективной доставкой факторов роста в область раны; местное применение этих белков позволяет воздействовать только на наружную, в основном мертвую ткань. Другие препятствия связаны с высокой лабильностью и низкой способностью удержания белков факторов роста после доставки в область раны.

Трудности в применении факторов роста и других белков для лечения ран эпидермиса связаны с большим размером используемых белков. Широкое применение способов лечения факторами роста также затруднительно из-за сложности и высокой стоимости, связанных с получением белков большого размера. Таким образом, в настоящее время проводят поиск менее дорогих и более эффективных лекарственных средств в том, что относится к применению белковых факторов в схемах лечения при заживлении ран. Короткие пептиды, которые поддерживают активность крупных белков, из которых они были получены (т.е. исходный белок), удовлетворяют эту потребность. Имеются сообщения о предыдущих примерах таких коротких пептидов (патенты США № № 6861406 и 6693077; Lee et al., 2004). Помимо непосредственной выгоды от меньшей стоимости, более простого получения, обработки и применения, маленькие биологически активные пептиды также лучше абсорбируются и удерживаются тканью раны. Улучшенные абсорбционные свойства коротких биологически активных пептидов также делают их практически осуществленным вариантом использования не только для обработки острых и хронических ран, а также для лечения проблем кожи, связанных со старением и ультрафиолетовым облучением.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к коротким биологически активным пептидам, пригодным для стимуляции заживления ран у млекопитающих. Раны, преимущественно являющиеся мишенями для выделенных пептидов, представляют собой пораженную кожу и связанные поверхности слизистых. Чтобы не ограничиваться какими-либо конкретными механизмами, пептиды по изобретению обладают способностью влиять на заживление ран путем стимуляции клеточной пролиферации и миграции, а также путем ингибирования воспаления, которое может нарушить оптимальные процессы заживления. Пептиды по изобретению применимы обоими способами: in vitro и in vivo и способны индуцировать упомянутые выше виды активности в кератиноцитах.

Один из вариантов осуществления по настоящему изобретению относится к выделенным пептидам, которые содержат от четырех до четырнадцати смежных аминокислотных остатков SEQ ID NO:1. Такие пептиды представляют собой короткие фрагменты пептида HB-107. Выделенные пептиды могут содержать или L-, или D-энантиомерные формы аминокислот или их сочетание. Кроме того, согласно другому варианту осуществления изобретения выделенные пептиды могут быть конъюгированы с белком-носителем или модифицированы амидированием или липидизацией. Эти дополнения усиливают биологическую активность пептидов при нанесении их на кожу и раны.

Согласно конкретным предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения выделенные пептиды могут содержать аминокислотные остатки метионина, валина, лизина или глутаминовой кислоты на N-конце. Выделенные пептиды могут также содержать аминокислотные остатки лизина, валина, глицина или аспарагина на С-конце. В других предпочтительных вариантах осуществления выделенные пептиды могут содержать SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:12. Конкретные варианты осуществления выделенных пептидов представляют собой SEQ ID NO:2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 15, каждый из которых проявляет один или несколько стимулирующих видов активности в отношении клеточной пролиферации, миграции и противовоспалительного эффекта. Из этих конкретных пептидов SEQ ID NO:2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11 и 12 обладают пролиферативной активностью в отношении клетки; и из этих пептидов SEQ ID NO:2, 3, 5, 6 и 9 проявляют самую высокую пролиферативную активность. Пептиды SEQ ID NO:3 и 6 проявляют оба вида активности в отношении клетки: пролиферативную и миграционную. SEQ ID NO:12 проявляет в отношении клетки оба вида активности: пролиферативную и противовоспалительную, тогда как SEQ ID NO:8 и 15 проявляют противовоспалительную активность в отношении клетки.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям, которые содержат фармацевтически приемлемый носитель и один или несколько из указанных выше пептидов. В таких композициях пептид присутствует в концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 20 мкг/мл или от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. Предпочтительными формами композиции являются аэрозоли, эмульсии, жидкости, лосьоны, кремы, пасты, мази, порошки и пены.

Настоящее изобретение также относится к способам применения указанных выше композиций для заживления ран у млекопитающих. Как правило, способ лечения включает введение эффективного количества содержащих пептид композиций в раны, особенно раны кожи (эпидермиса) и связанных тканей слизистых, в течение эффективного количества времени. Такие раны включают истирания, волдыри, ожоги, разрывы, язвы, синяки, сыпи, рубцы и проявления старения и воздействия факторов окружающей среды.

Краткое описание фигур

Фиг.1: Приведено расположение пептидов по изобретению относительно исходного пептида HB-107 (SEQ ID NO:1).

Фиг.2: Экспрессия IL6 эпителиальными клетками кожи в ответ на воздействие ультрафиолетовых лучей спектра B (UVB). Клетки подвергали облучению UVB в течение определенного периода времени (0-35 секунд) и измеряли экспрессию IL6 с помощью ELISA спустя двадцать четыре часа после UVB облучения. Каждый опыт повторяли трижды. Относится к примеру 4.

Фиг.3: Влияние коротких пептидов на индуцированную UVB экспрессию IL6 в эпителиальных клетках кожи. Клетки подвергали облучению UVB в течение 35 секунд, после чего клетки инкубировали в полной среде (без сыворотки) с 40 мкг/мл пептида [HB-107 (SEQ ID NO:1), HB-802 (SEQ ID NO:12), HB-1410 (SEQ ID NO:15), HB-801 (SEQ ID NO:31)] в течение двадцати четырех часов. Экспрессию IL6 измеряли с помощью ELISA. Относится к примеру 4.

Подробное описание изобретения

Патенты США № 5962410 и 5861478 содержат информацию, пригодную для понимания настоящего изобретения, и включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Изобретение относится к коротким биологически активным пептидам, которые, например, получают из пептида HB-107 (SEQ ID NO:1), и способам их применения. Сам по себе пептид HB-107 входит в состав фрагмента цекропина B, который представляет собой антибактериальный белок, присутствующий у разновидности моли. Хотя HB-107 не проявляет бактериостатического действия белка, из которого он был получен, он проявляет свойства заживления ран эпидермиса (Lee at al., 2004).

Пептиды по настоящему изобретению проявляют виды активности, которые важны для активации процессов заживления в эпидермальных тканях, таких как кожа и связанные слизистые (например, ротовая полость). Чтобы не ограничиваться какими-либо конкретными механизмами, эти виды активности направлены на кератиноциты, эпителиальные клетки, ответственные за закрытие раны (т.е. эпителизацию) и образование эпидермальных покровов. Конкретными видами активности, которые пептиды по изобретению проявляют в отношении кератиноцитов, которые непосредственно обусловливают заживление раны, являются стимуляция клеточной пролиферации и миграции, а также способность подавления сигналов воспаления кератиноцитами. Несмотря на то, что HB-107 способен стимулировать все эти виды активности в кератиноцитах, к удивлению, пептиды по настоящему изобретению проявляют эту способность на эквивалентном или более высоком уровнях, чем HB-107. Эти результаты являются и поразительными, и значимыми, так как пептиды по изобретению составляют только 26%-74% от длины HB-107.

Из-за различия в размере пептиды по настоящему изобретению являются более простыми и, таким образом, менее дорогими для получения по сравнению с получением HB-107 и полноразмерных белков, таких как PDGF-BB. Также в отличие от более крупных пептидов раскрываемые пептиды растворяли, подвергали обработке (например, химическому модифицированию) и хранили при более простых условиях. Простота манипуляций с ними реализует большее число вариантов доставки лекарственного средства, например использование носителя, и способов применения. Размер и лучшая растворимость пептидов по изобретению обусловливает их повышенную эффективность для заживления посредством увеличения абсорбции и удержания в области раны; локальные кератиноциты и другие клетки подвергаются воздействию повышенных концентраций пептидов в течение более длительного периода времени.

Биологическими видами активности, проявляемыми пептидами по настоящему изобретению, являются клеточная пролиферация и миграция, а также ингибирование воспаления. Два упомянутых выше процесса играют большую роль в опосредовании функции пептидов при заживлении ран. Пептиды обладают способностью, во-первых, стимулировать миграцию кератиноцитов, находящихся у границы раны, и, во-вторых, стимулировать пролиферацию этих клеток для образования нового слоя эпидермиса над областью раны. Третий вид активности, ингибирование воспаления, достигается посредством раскрытого эффекта подавления пептидами секреции цитокина интерлейкин-6 (IL6) клетками в ране. Было показано, что IL6 секретируется эпидермальными кератиноцитами в ответ на факторы, связанные с повреждением тканей (Sugawara et al., 2001); этот цитокин вызывает инфильтрацию иммунных клеток в ране, процесс, который фактически может затруднять заживление и приводить к образованию рубца (Martin and Leibovich, 2005; Liechty, 2000). Так как воспаление важно для предотвращения инфицирования раны, обеспечение качественных антисептических мероприятий при стандартной обработке раны устраняет любые препятствия, связанные с подавлением воспаления. Хотя упомянутые выше виды активности похожи на те, посредством которых изобретение способствует заживлению раны, отмечено, что применение не ограничено каким-либо одним конкретным спектром биологических механизмов.

В отношении стимулирования клеточной пролиферации и миграции, предпочтительными являются пептиды SEQ ID NO:3 (HB-1061) и SEQ ID NO:6 (HB-1072). Эти пептиды вызывают значительное повышение пролиферации клеток по сравнению со стимулированием посредством HB-107, но пока более кратковременное, чем HB-107 (относится к примерам 1 и 2). Они точно так же, как HB-107, способны к индукции клеточной миграции. Пептиды SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:12 являются предпочтительными в отношении индукции противовоспалительной клеточной активности (относится к примеру 3).

Пептиды по изобретению также проявляют лечебные эффекты относительно проблем, связанных со старением кожи или значительной подверженностью кожи действию повреждающих средств, таких как солнечное излучение. Сами короткие пептиды не изменяют, но посредством химического модифицирования и/или специализированной доставки могут быть подготовлены для абсорбции через эпидермис для воздействия на процессы, противоположные тем, которые являются причиной истончения кожи, появления морщин, хрупкости и огрубления/уплотнения. Основным способом, которым изобретение стимулирует сохранение кожи, является положительный эффект пептидов на рост кератиноцитов. Так как эти клетки являются основным компонентом эпидермальных покровов, а с возрастом и в поврежденной коже их количество снижается (Enoch и Price, 2004), то их восстановление пептидной стимуляцией предполагает обратное развитие указанных выше проблем. Экспрессия IL6 связана с процессами, лежащими в основе аномального утолщения эпидермиса у пациентов с некоторыми аутоиммунными нарушениями (Sato et al., 2001; Oyama et al., 1998); пептиды по изобретению могут блокировать такой исход, связанный с воспалением, ингибированием экспрессии IL6.

Пептиды

Единственно, в качестве направляющей точки, пептиды по изобретению можно получать из фрагмента HB-107 (таблица 1) из белка цекропин B моли. Метаболическими особенностями, связанными с этими пептидами, является их способность индуцировать клеточную пролиферацию, миграцию и/или противовоспалительную активность. Все пептиды по изобретению объединены общей особенностью наличия от четырех до четырнадцати смежных аминокислотных остатков из HB-107 (SEQ ID NO:1). Таким образом, пептиды по изобретению могут состоять из четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати или четырнадцати смежных аминокислотных остатков из HB-107 (SEQ ID NO:1).

Помимо наличия описанных выше композиций аминокислот, описанные выше пептиды могут дополнительно содержать следующие аминокислоты (полное название/трехбуквенная аббревиатура/однобуквенная аббревиатура): аланин/ala/A, аргинин/arg/R, аспарагин/asn/N, аспартат/asp/D, цистеин/cys/C, глутамин/gln/Q, глутамат/glu/E, глицин/gly/G, гистидин/his/H, изолейцин/ile/I, лейцин/leu/L, лизин/lys/K, метионин/met/M, фенилаланин/phe/F, пролин/pro/P, серин/ser/S, треонин/thr/T, триптофан/trp/W, тирозин/tyr/Y и валин/val/V. Эти аминокислотные остатки характеризуют следующим образом: алифатические (аланин, глицин, изолейцин, лейцин, пролин, валин), ароматические (фенилаланин, триптофан, тирозин), кислые (аспартат, глутамат), основные (аргинин, гистидин, лизин), содержащие гидроксильную группу (полярные) (серин, треонин), серосодержащие (полярные) (цистеин, метионин) и амиды (аспарагин, глутамин). В описанный пептид можно включать, но не ограничиваясь ими, нестандартные аминокислотные остатки селенооцистеин, пиролизин и различные циклические формы аминокислот.

Следующие пептиды представляют собой неограничивающие примеры настоящего изобретения и приведены с целью иллюстрации (таблица 1).

Таблица 1 Пептиды по настоящему изобретению
SEQ ID NO:	Пептид	Последовательность
1	HB-107	MPKEKVFLKIEKMGRNIRN
2	HB-1059	EKMGRNIRN
3	HB-1061	MGRNIRN
4	HB-1062	GRNIRN
5	HB-1071	VFLKIEKMG
6	HB-1072	KIEKMG
7	HB-1074	VFLKIEK
8	HB-1076	KEKVFLKIE
9	HB-1057	KIEKMGRNIRN
10	HB-912	MPKEKVFLKIEKMG
11	HB-801	PKEKV
12	HB-802	MPKEK
13	HB-1056	LKIEKMGRNIRN
14	HB-1060	KMGRNIRN
15	HB-1410	PKEK

Пептиды SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:15 представляют собой примеры пептидов, ассоциированных с одним или несколькими описанными выше видами активности (пролиферативной, миграционной, противовоспалительной). Пептиды SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 представляют собой примеры пептидов, которые могут индуцировать клеточную пролиферацию. Пептиды SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:6 представляют собой примеры пептидов, которые могут индуцировать клеточную пролиферацию и миграцию. Пептид SEQ ID NO:12 представляет собой пример пептида, который проявляет обе активности: пролиферативную и противовоспалительную. Пептиды SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:15 представляют собой примеры пептидов, обладающих противовоспалительной активностью.

Каждый из описанных выше пептидов может содержать L- или D-энантиомеры аминокислот либо остатки одной энантиомерной формы или сочетание обеих форм. Пептиды можно дополнительно наращивать или модифицировать или химически, или ферментативно, как описано в следующих неограничивающих примерах. C-конец пептидов может быть кислым (-COOH) или амидированным (например, -CONH₂, -CONHR или -CONR₂). Амидирование C-конца может обеспечить пептидам по изобретению меньшую чувствительность к протеолитической деградации, повысить их растворимость по сравнению со свободными формами кислот, обеспечивая таким образом повышение терапевтического потенциала. Пептиды также можно подвергнуть липидизации, что может обеспечить улучшенное проникновение через кожу. Модификации пептида можно осуществлять заменой водорода N-концевой аминогруппы, заменой гидроксильной группы (OH) C-концевой карбоксильной группы, полной заменой N-концевой аминогруппы или полной заменой C-концевой карбоксильной группы. Одна или несколько межмолекулярных связей, соединяющих аминокислоты каждого пептида, могут не являться пептидной связью. Такие связи, не являющиеся пептидными, в качестве неограничивающих примеров включают имидо-, сложный эфир гидразина, семикарбазид и азосвязи.

Различные модификации пептидов можно осуществлять до тех пор, пока сохраняются их свойства пролиферации, миграции и противовоспалительного вида активности. Некоторые модификации можно использовать для повышения активности пептида, в то же время другие модификации могут облегчать применение пептида. Функциональные группы пептида, которые обычно подвергают модификации, включают гидроксил, амино, гуанидин, карбоксил, амид, фенол, имидазольные кольца или сульфгидрил. Стандартные, не лимитирующие реакции с этими группами, включают следующие: ацетилирование гидроксильных групп алкилгалогенидами; образование сложных эфиров, амидирование или гидрогенизацию (т.е. превращение в спирт) карбоксильных групп; дезаминирование, ацилирование, алкилирование, арилирование аминогрупп (например, первичная аминогруппа пептида или аминогруппа остатков лизина); галогенирование или нитрирование фенольных групп тирозина.

Пептиды можно подвергать конъюгированию с растворимыми или нерастворимыми молекулами-носителями для модификации их свойств растворимости по мере необходимости и для повышения локальной концентрации пептидов в тканях-мишенях. Примеры растворимых молекул-носителей включают полимеры полиэтиленгликоль (ПЭГ) и поливинилпирролидон; примеры нерастворимых полимеров включают соли кремниевой кислоты, полистирол и целлюлозу. Пептиды также можно подвергать микрокапсулированию для усиления их стабильности в течение и после терапевтического применения; обычно для инкапсулирования и стабилизации пептидов используют микрогранулы полиэфира и ПЭГ.

В зависимости от гидрофильной или гидрофобной природы композиции пептида, подлежащего инкапсулированию, можно использовать различные способы получения микрогранул для инкапсулирования пептида. Примерами протоколов таких способов являются найденные в Wang H.T. et al. (1991, J. Control. Release 17:23-25) и патенте США № 4324683, оба из которых приведены здесь в полном объеме. Исследования высвобождения пептида in vitro можно проводить для определения относительной доступности пептида после инкорпорирования его в микрогранулу. Микрогранулы (200 мг) суспендируют при pH 7,2 в фосфатно-солевом буфере (PBS) (2,5 мл) и перемешивают при 37 градусах C и 100 об/мин в климатическом шейкерном инкубаторе (G-24, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.). В конкретное время проведения измерения (каждые сутки в течение первых 4 суток и все остальные сутки после этого) буферный раствор полностью удаляли и заменяли свежим PBS. Содержание пептида в PBS измеряли c использованием метода Бредфорда или другого подходящего количественного анализа, используемого обычно для анализа белков.

Все раскрываемые пептиды можно синтезировать с использованием так называемой стандартной твердофазной химии Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил) на синтезаторе Advanced ChemTech Apex 396 Multiple Peptide Synthesizer. Apex 396 оснащен 40-луночным реакционным блоком для получения до 40 пептидов одновременно в количестве 0,15 ммоль. Пептиды можно получать или амидированными, или в качестве последовательностей свободных кислот с использованием стандартных аминокислот. Сначала смолу промывали и заранее подвергали набуханию с помощью N,N-диметилформамида (DMF). Время набухания для смолы Rink-amide составляло один час. Защитную группу Fmoc удаляли с помощью 25% пиперидина в DMF в течение 25 минут, после чего пиперидин полностью удаляли из смолы. Для контроля за процессом рацемизации Fmoc мономеры аминокислот заранее активировали в эквимолярном растворе 1-гидрокси-бензотриазола (HOBt) или 1-гидрокси-7-аза-бензотриазол (HOAt) в DMF с концентрацией 0,5 M. Получение амидных соединений выполняли с использованием 0-(7-аза-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфата (HATU) PyBop® или 2-(1H-бензотриазол-1-ил-)-1,1,3,3-тетраметилуоний гексафторфосфата (HBTU) в качестве активирующего соединения и с 2,5-5,0-кратным молярным избытком аминокислоты при нормальных условиях с использованием пространственно-затрудненного основания (диизопропилэтиламин). Время связывания составляло 1-1,5 часа с последующим промыванием и повторным связыванием для получения двойного или тройного соединения перед удалением защитных групп и удлинением растущей цепи пептида. Эффективность связывания измеряли с использованием стандартного теста Кайзера. Как только синтез пептида с использованием смолы завершали, последнюю группу Fmoc удаляли, как описано выше, и оставляли последовательности в качестве свободных оснований.

Расщепление пептидных связей, неустойчивых к действию кислот, со смолой проводили с использованием 95% трифторуксусной кислоты (TFA) и воды с добавлением подходящего акцептора. После того как позволяли пройти расщеплению в течение приблизительно от 30 минут до одного часа, свободные пептиды немедленно удаляли из блока для расщепления и перемещали в пробирки для удаления TFA при пониженном давлении. Таким образом, пептиды были готовы для очистки и анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием колонок с обращенной фазой C18 и масс-спектрометрией. Подтверждение первичной последовательности и предварительную очистку проводили с использованием системы LC/MS/MS (ABI API2000).

Согласно приведенному выше протоколу пептиды можно получать с использованием любых способов, известных специалистам в данной области, таких как те, которые описаны в Merrifield, R.B., Solid Phase Peptide Synthesis I., J. AM. CHEM. SOC. 85:2149-2154 (1963); Carpino, L.A. et al., [(9-Fluorenylmethyl)Oxy]Carbonyl (Fmoc) Amino Acid Chlorides: Synthesis, Characterization, And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides, J. ORG. CHEM. 37:51:3732-3734; Merrifield, R.B. et al., Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, ANAL. CHEM. 38:1905-1914 (1966); или Kent, S.B.H. et al., High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson U., ed.) Almqvist and Wiksell Int., Stockholm (Sweden), p.185-188, которые все в полном объеме включены в настоящий документ в качестве ссылки. Предпочтительно пептиды будут получены автоматическим способом, допускающим последовательное присоединение аминокислот к растущей цепи пептида. Однако пептиды также можно получать с использованием способа в жидкой фазе, который можно применять в целях массового производства.

Способы использования

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам применения описанных выше пептидов, например, в качестве композиций или в качестве терапевтических средств. Эти способы могут включать применение отдельного пептида или множества пептидов в сочетании.

Пептиды по настоящему изобретению можно использовать для лечения ран кожи (эпидермис, дерма и гиподерма) и связанных тканей слизистых. Как применяют в настоящем документе, термин "связанные ткани слизистых" относится к любой ткани, организованной сходным с кожей образом и содержащей эпителиальные клетки. Кератиноциты представляют собой неограничивающий пример таких эпителиальных клеток. Примерами таких тканей являются ротовая, носоглоточная, ушная и урогенитальная поверхности, а также пальпебральная конъюнктива глаза. Другие примеры связанных тканей слизистых включают внутреннюю выстилку (т.е. просвет) желудочно-кишечного тракта, включая пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник (толстую кишку) и прямую кишку. Эти последние примеры подвергаются тем же ранениям/повреждениям, которые поражают кожу, и поэтому могут являться мишенями для настоящего изобретения. Примерами ран/поражений/повреждений, которые могут поражать эти ткани и подлежат лечению пептидами по изобретению, являются истирания, волдыри, ожоги, разрывы, колотые раны, язвы, синяки, сыпи и рубцы. Послеоперационные повреждения ткани также подлежат лечению пептидами.

Пептиды по изобретению также можно использовать для предотвращения или обращения влияний возраста на все указанные выше ткани. Сходным образом пептиды можно применять на поврежденной ткани, подвергшейся действию различных внешних факторов, таких как солнечное излучение. Примерами истощений, связанных со старением и облучением, являются образование морщин, сухость, истончение, обвисание и повышенная чувствительность к образованию синяков. Учитывая это, изобретение также можно использовать в качестве косметического средства для достижения более молодого внешнего вида и текстуры кожи и для обеспечения здорового функционирования.

Другие затрагивающие ткани проблемы, которые эффективно лечатся с использованием пептидов по настоящему изобретению, связаны с аллергией или аутоиммунитетом. Такие расстройства включают дерматит, псориаз, склеродермию, пузырчатку и воспалительные заболевания кишечника.

Композициями для доставки пептидов в приведенных выше терапевтических способах могут быть аэрозоли, эмульсии, жидкости, лосьоны, кремы, пасты, мази, порошки или пена или другой фармацевтически приемлемый препарат. Кроме того, пептиды можно доставлять с использованием нерассмотренных препаратов, таких как деионизированная/дистиллированная вода, PBS или обычный медицинский физиологический раствор. Как правило, фармацевтически приемлемый препарат включает любой носитель, пригодный для использования на коже человека. Такие фармацевтически приемлемые носители включают этанол, диметилсульфоксид, глицерин, диоксид кремния, оксид алюминия, крахмал и аналогичные носители и разбавители. Препарат необязательно обладает косметическим назначением и/или содержит такие соединения, как ретиноиды или другие пептиды, которые могут служить в качестве адъювантов для терапевтического действия пептидов по изобретению. К препарату также можно добавлять антибиотики для предотвращения инфицирования, позволяя процессу заживления таким образом протекать максимально. Концентрация пептида в композиции составляет от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл или от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 20 мкг/мл; однако конечная используемая концентрация может варьировать вне этих пределов в зависимости от природы происхождения раны/ткани, биологической активности пептида по изобретению и применения каких-либо адъювантов или способов достижения композицией повышенной абсорбции.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько дополнительных соединений, которые обладают активностью ухода за кожей.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, где композиция подлежит контактированию с ороговевающим слоем ткани человека, любые дополнительные соединения, помимо пептидов по изобретению, должны быть применимы для нанесения на ороговевающую ткань; то есть если другие такие компоненты, включенные в композицию, проявляют несоответствующую токсичность, несовместимость, неустойчивость, аллергическую реакцию и т.п. в пределах границ тщательной медицинской оценки. В CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992) описано большое разнообразие неограниченных косметических и фармацевтических компонентов, общеупотребительных в промышленности по уходу за кожей, которые пригодны для использования в композициях по настоящему изобретению. Примеры таких классов компонентов включают: абразивы, абсорбенты, эстетические компоненты, такие как ароматические композиции, пигменты, красящие вещества/красители, эфирные масла, вещества, усиливающие чувствительность кожи, вяжущие средства и т.д. (например, гвоздичное масло, ментол, камфара, эвкалиптовое масло, эвгенол, ментил лактат, дистиллят гамамелиса), средства против угревой сыпи, средства против обезвоживания, противовспениватели, антибактериальные средства (например, йодопропил бутилкарбамат), антиоксиданты, связующие вещества, биологические добавки, буферные средства, наполнители, хелатирующие средства, химические добавки, косметические антисептики, денатурирующие средства, вяжущие лекарственные средства, наружные анальгетики, пленкообразующие соединения или вещества, замутняющие компоненты, регуляторы pH, пропелленты, восстановители, отшелушивающие вещества, средства для отбеливания и осветления кожи (например, гидрохинон, койевая кислота, аскорбиновая кислота, аскорбилфосфат магния, аскорбилглюкозамин), средства для ухода за кожей (например, увлажнители), средства для смягчения и/или заживления кожи (например, пантенол и его производные, алоэ вера, пантотеновая кислота и ее производные, аллантоин, бисаболол и глицирризинат калия двойной), средства для лечения кожи, загустители и витамины и их производные.

Применение пептидов по изобретению и соответствующих композиций можно осуществлять у человека и животных, включая всех млекопитающих. Применение также можно осуществлять в сочетании со стандартными и/или экспериментальными материалами, такими как тканевые лоскуты, препараты культуры клеток ткани, кислород и перевязочные средства. В основном композицию можно вводить местно, перорально, трансдермально, системно или любым другим способом, известным специалистам в данной области, пригодным для доставки пептидов по изобретению в место повреждения. Композиции также можно применять способом in vitro или ex vivo, например, или на клетках, или на растущем в культуре трансплантате пациента.

Подразумевают, что из-за своего маленького размера пептиды способны самостоятельно достигать некоторого уровня проницаемости через кожу; однако можно использовать конкретные способы для усиления этого процесса. Например, к пептидам можно добавлять липофильные (неполярные) группы, или пептиды можно доставлять к коже с помощью липофильного эксципиента для увеличения доступности пептида роговому слою для обеспечения перемещения в нижние слои эпидермиса. Таким образом, такие липофильные модификации можно рассматривать в качестве предшественника лекарственного средства. Усилители проницаемости, такие как известные растворители и поверхностно-активные вещества, можно использовать в составе эксципиента для обеспечения лучшей абсорбции пептида. Специальные способы, предлагаемые для применения, для увеличения доступности пептида ткани/повреждению, являющимся мишенью, включают ионофорез, электрофорез и ультразвук. Устройство для ионофореза состоит из двух электродов, погруженных в раствор электролита и размещенных на коже. Когда электрический ток проходит через электроды, через роговой слой создается электрическое поле, которое обеспечивает доставку пептидов. Электропорация включает применение электрических импульсов высокого напряжения для увеличения проникновения через липидный бислой. Это отличается по длительности и силе применения электрического тока от ионофореза (при ионофорезе используют относительно постоянное электрическое поле низкого напряжения). Полагают, что электрический импульс высокого напряжения при электропорации вызывает обратимое возникновение гидрофильных пор в липидном слое мембран, который обеспечивает высокую степень усиления проникновения. При использовании ультразвука на коже применяют звуковые волны с частотой более чем 16 кГц, которые являются причиной сдавливания и растяжения ткани, через которую проходят звуковые волны. Колебания конечного давления вызывают ряд процессов (например, образование полости, перемешивание, повышение температуры), которые могут усилить проникновение пептидов.

Все указанные выше препараты и способы применения пептида хорошо известны в данной области. Дополнительные способы получения и применения пептидов по изобретению описаны, например, в патентах США № 6492326 и 6974799, которые оба включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Следующие примеры включены для иллюстрации конкретных предпочтительных вариантов осуществления изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Идентификация пептидов, стимулирующих клеточную пролиферацию

Так как ранее было показано, что фрагмент пептида HB-107 (SEQ ID NO:1) стимулирует заживление ран in vivo (Lee et al., 2004), была выдвинута гипотеза о том, что внутри последовательности HB-107 могут находиться еще более маленькие фрагменты пептида, которые могут аналогично или лучше стимулировать заживление ран и относящиеся к нему процессы. Для изучения этого вопроса с использованием стандартной твердофазной химии пептидов получили множество пересекающихся фрагментов пептида HB-107. Затем анализировали действие этих пептидов на клеточную пролиферацию в концентрациях 0,22, 2,15, 21,5 и 46,4 мкг/мл. Ряд пептидов в низкой концентрации вызвали значимое повышение пролиферации эпидермальных кератиноцитов (таблица 2), включая пептиды HB-1061 (SEQ ID NO:3) и HB-1072 (SEQ ID NO:6), каждый из которых содержал только семь и шесть аминокислот соответственно. Несколько других пептидов проявляли стимулирующую активность на уровнях, равных или выше, чем у HB-107 (таблица 2). В заключение, клеточная пролиферация, индуцированная рядом пептидов по изобретению, превышала уровень пролиферации, индуцированный исходным пептидом HB-107. Важно, что некоторые из этих фрагментов значительно короче, чем HB-107.

Таблица 2 Индукция пролиферации эпидермальных кератиноцитов мыши PAM 212 пептидами по изобретению. Значения клеточной пролиферации представлены как процент от клеточной пролиферации в контроле (клетки, обработанные только PBS). Значения, выделенные жирным шрифтом, показывают уровни пролиферации, превышающие клеточную пролиферацию в контроле на 150%
SEQ ID NO:	Пептид	0,22 мкг/мл	2,15 мкг/мл	21,5 мкг/мл	46,4 мкг/мл
1	HB-107	57	75	121	126
12	HB-802	121	130	135	133
11	HB-801	101	100	113	131
10	HB-912	100	84	125	137
7	HB-1074	97	93	120	149
5	HB-1071	106	127	188	155
13	HB-1056	48	39	64	97
9	HB-1057	121	118	171	167
6	HB-1072	98	107	185	237
2	HB-1059	95	128	162	186
14	HB-1060	57	52	90	83
3	HB-1061	122	156	163	241

Анализ клеточной пролиферации выполняли по следующему экспериментальному протоколу.

Анализ клеточной пролиферации с использованием клеточной линии кератиноцитов мыши

Цель: определить антипролиферативную или цитотоксическую способность исследуемых образцов при использовании в культуре эпидермальных кератиноцитов.

Тест-система: Предпочтительными моделями являются либо клеточная линия кератиноцитов мыши PAM 212 или первичная линия нормальных эпидермальных кератиноцитов человека (NHEK, от Clonetics), хотя можно использовать другие клетки.

Реактивы:

1. Среда для выращивания клеток: среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, содержащая 10% сыворотки новорожденных телят (DMEM-10), пенициллин (100 единиц/мл), стрептомицин (0,1 мг/мл) и гентамицин (50 мкг/мл), или среда для выращивания кератиноцитов (KGM, от Clonetics) для клеток человека.

2. Среда для промывания: среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, содержащая 1,0% сыворотки новорожденных телят (DMEM-1), пенициллин (100 единиц/мл) и стрептомицин (0,1 мг/мл), или минимальная среда для кератиноцитов (KBM, от Clonetics) для клеток человека.

3. Матричный раствор нейтрального красного: порошок нейтрального красного в концентрации 3 мг/мл добавляют в фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS). Затем конечный раствор фильтруют в стерильных условиях.

4. Среда с нейтральным красным: матричный раствор нейтрального красного добавляют в DMEM или KBM до конечной концентрации 50 мкг/мл.

5. Среда с MTT: порошок MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтатразолия бромид) добавляют в DMEM или KBM до концентрации 1 мг/мл и фильтруют или центрифугируют для удаления какого-либо осадка. Раствор MTT используют в течение 24 часов.

6. Раствор для фиксации, состоящий из 1% формальдегида и 1% хлорида кальция в водном растворе.

7. Раствор для промывания, состоящий из PBS.

8. Лизирующий раствор: 1,0% ледяной уксусной кислоты и 50% этанола в водном растворе для нейтрального красного или кислый изопропанол для клеток, обработанных MTT.

Посев клеток

Кератиноциты регулярно осматривали через микроскоп. Когда культура достигала 50-75% конфлюентности, из планшета удаляли среду и добавляли 0,25% трипсин/ЭДТА (0,05% трипсин для клеток человека). Когда клетки округлялись, трипсин нейтрализовали добавлением равного объема DMEM или KBM, дополненных приблизительно 10% бычьей сывороткой, или с использованием раствора, нейтрализующего трипсин (TNS, от Clonetics). Затем клетки центрифугировали и осадок ресуспендировали в 1 мл DMEM-1 или KBM. Для подсчета клеток в суспензии использовали гемоцитометр, и общее количество клеток/мл доводили до 1,5-2,5×10 ⁴ клеток/мл с помощью DMEM-1 или KBM. Затем, добавляя по 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку, клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 3,0-5,0×10³ клеток/лунка. Обычно использовали центральные 60 лунок, а внешние лунки заполняли DMEM или PBS для минимизации эффектов испарения.

Получение образцов

Матричный раствор исследуемого образца получали с использованием DMEM-1 или KBM, и в дальнейшем все остальные разведения получали из этого раствора. Как правило, перед внесением в клеточную культуру каждое разведение фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Получали 1,0% (масс./об. или об./об.) раствор или суспензию и готовили 10-кратное или 3-кратное серийные разведения в среде для культивирования.

Дозирование

За клетками наблюдали в течение 18-24 часов после посева, чтобы убедиться в прикреплении и делении клеток, и затем удаляли 100 мкл среды, оставляя по 100 мкл в каждой лунке. Затем 100 мкл 2x концентрации разведения каждого исследуемого образца добавляли в параллельные лунки. Для отрицательного контроля в контрольные лунки добавляли 100 мкл среды для промывания (DMEM-1 или KBM). Затем микропланшет инкубировали при 37 градусах C и 5,0% CO₂ в течение 48-72 часов после дозирования, позволяя клеткам свободно пролиферировать. После такого воздействия в течение 48-72 часов всю среду удаляли и оценивали пролиферацию одним из приведенных ниже способов.

Вариант A: по поглощению нейтрального красного. После воздействия и удаления среды в каждую лунку сразу добавляли 200 мкл среды с нейтральным красным. Микропланшет возвращали в инкубатор дополнительно на три часа. После этого периода поглощения красителя микропланшет убирали из инкубатора и осторожно переворачивали, а среду с нейтральным красным сливали в емкость для сбора. Затем клетки фиксировали с помощью фиксирующего раствора в течение приблизительно одной минуты. Фиксирующий раствор сливали, и микропланшет осторожно промывали три раза раствором для промывания. Раствор для промывания сливали и добавляли 200 мкл лизирующего раствора. После, по меньшей мере, 15 минут содержимое каждой лунки заново пипетировали, чтобы убедиться в равномерном распределении красителя в каждой лунке, и анализировали аликвоту на спектрофотометре, как подробно описано ниже.

Вариант B: анализ конверсии MTT. После воздействия и удаления среды в каждую лунку сразу добавляли 200 мкл среды для анализа МТТ. (MIT следует использовать, только если исследуемый образец не восстанавливает MIT напрямую, как определено в эксперименте по определению диапазона или тесте на совместимость MIT). Микропланшет возвращали в инкубатор дополнительно на три часа. После этого периода поглощения красителя микропланшет убирали из инкубатора и осторожно переворачивали, а среду с MTT сливали в емкость для сбора. Затем клетки осторожно промывали раствором для промывания три раза. Раствор для промывания сливали и добавляли 200 мкл лизирующего раствора. После лизирования в течение, по меньшей мере, 60 минут содержимое каждой лунки заново пипетировали, чтобы убедиться в равномерном распределении красителя в каждой лунке, и измеряли коэффициент поглощения на спектрофотометре, как подробно описано ниже.

Вариант C: анализ с помощью проточной цитометрии. После воздействия в среду вносили до 10 мкМ бромдезоксиуридина (BrdU) и инкубировали при 37°C в течение 45 минут. В течение этой инкубации BrdU, аналог тимидина, встраивался в ДНК пролиферирующих клеток. Затем клетки снимали трипсинизацией. После центрифугирования осадок с клетками ресуспендировали в 0,5 мл PBS и фиксировали клетки добавлением 70% этанола. Затем клетки промывали и окрашивали с помощью специфичного к ДНК (красного) флуоресцентного красителя пропидиййодида. Пролиферирующие клетки окрашивали с помощью специфичных к BrdU флуоресцентных (зеленых) антител. Анализ клеточного цикла, а также количество пролиферирующих клеток, положительно окрашенных BrdU, определяли, используя проточную цитометрию. (Примечание: для исследований с помощью проточной цитометрии клетки культивировали в 24-луночных или 6-луночных планшетах).

Анализ данных

Исследования поглощения красителя: для конечных точек на основании окрашивания оптическую плотность в лунках измеряли с использованием Titertek Multiskan MCC/340 при длине волны 540 нм, вычитая коэффициент поглощения при длине волны 620 нм в контроле для нейтрального красного или при длине волны от 670 нм до 680 нм в контроле для MIT. Распечатку величин коэффициента поглощения выдает устройство для считывания микропланшетов. Среднюю величину коэффициента поглощения и стандартное отклонение вычисляли для каждой исследуемой группы, и результаты выражали как процент от коэффициентов поглощения в контроле. Вычисление значений EC50: графически данные представляют как процент от коэффициентов поглощения в контроле против концентрации для каждого исследуемого образца. Значения EC50 экстраполировали по линии регрессии, построенной по данным в Excel 5.0 graph. Кроме того, EC50 вычисляли, используя выравнивание для линии регрессии, обеспеченное Excel 5.0 graph, или используя Excel 5.0 macro.

Исследования с помощью проточной цитометрии: для анализа с помощью проточной цитометрии определяли процент положительно BrdU-меченных и вычисляли индекс пролиферации (т.е. % активно пролиферирующих клеток во время сбора клеток, выросших в культуре). Дополнительно можно определять другие параметры, такие как процент жизнеспособности клеток и процент апоптотических клеток в образцах.

Пример 2

Идентификация пептидов, стимулирующих клеточную миграцию

Сама по себе клеточная пролиферация недостаточно способствует заживлению раны. В результате получения повреждения клетки, находящиеся у границы раны, пролиферируют; миграция таких вновь образовавшихся клеток для закрытия повреждения (или хронические очаги более зрелой, неправильно функционирующей ткани) также является важной. Для изучения этого вопроса HB-107 и фрагменты этого пептида исследовали с использованием анализа клеточной миграция кератиноцитов, основанного на простом скарификационном тесте культуры ткани. Этот анализ показывает, что пептиды, такие как HB-1072 (SEQ ID NO:6) и HB-1061 (SEQ ID NO:3), способны усиливать миграцию клеток похожим образом, что и исходный пептид HB-107 (таблица 3). Интересно отметить, что пептиды HB-1072 и HB-1061 частично перекрываются с HB-107 и что аналог HB-1062 (SEQ ID NO:4) не проявляет миграционной активности в отношении клеток. Протокол для этого анализа является стандартным и описан Shanley et al. (2004, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45:1088-1094), чья публикация включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Таблица 3 Индукция миграции эпидермальных кератиноцитов человека пептидами по изобретению при измерении с помощью скарификационного теста. Величины представлены процентом затягивания царапины по сравнению с исходной шириной царапины клеточного монослоя после 6 или 10 часов воздействия пептида
SEQ ID NO:	Пептид	6 ч	10 ч
NA	Контроль PBS	11	33
1	HB-107	52	78
6	HB-1072	55	77
3	HB-1061	44	67
4	HB-1062	0	24

Пример 3

Идентификация пептидов, стимулирующих противовоспалительную активность у покоящихся клеток

В дополнение к возрастающей степени заживления также было показано, что пептид HB-107 снижает уровень воспаления, связанный с раной. Для идентификации маленьких фрагментов пептида, которые могут проявлять такую активность, фрагменты HB-107 проверяли на способность подавлять ключевой цитокин воспаления IL6. Обнаружили, что фрагменты пептида HB-802 (SEQ ID NO:12) и HB-1076 (SEQ ID NO:8) уменьшают уровень экспрессии IL6 до того же уровня, что и исходный пептид HB-107 (таблица 4). Протокол для этого анализа является стандартным и описан Murakami et al. (2004, J. Immunol. 172:3070-3037), чья публикация включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Таблица 4 Подавление экспрессии IL6 в эпителиальных клетках под действием пептидов по изобретению. Количество IL6, экспрессируемого в пг/мл (колонки 3-5), определяли через 24 и 48 часов после добавления среды, содержащей 20 мкг/мл пептида. Относительное изменение экспрессии IL6 в процентах приведено в колонке 8
24 ч
SEQ ID NO:	Образец	Лунка 1	Лунка 2	Среднее	SD	Изменение	% изменения
	Контроль PBS	334,26	292,09	313,175	21,085	NA	NA
	Контроль PBS	311,02	335,98	323,5	12,48	NA	NA
	Контроль PBS	319,63	349,75	334,69	15,06	NA	NA
12	HB-802	278,32	288,65	283,485	5,165	-40,435	-12,50%
1	HB-107	307,58	264,55	286,065	21,515	-37,435	-11,60%
8	HB-1076	278,32	255,08	266,7	11,62	-56,8	-17,60%
48 ч
SEQ ID NO:	Образец	Лунка 1	Лунка 2	Среднее	SD	Изменение	% изменения
	Контроль PBS	1049,2	1007,3	1028,25	20,95	NA	NA
	Контроль PBS	927,27	1022,8	975,035	47,765	NA	NA
	Контроль PBS	1002,1	904,89	953,495	48,605	NA	NA
12	HB-802	774,07	762,02	768,045	6,025	-206,99	-21,20%
1	HB-107	690,58	786,12	738,35	47,77	-236,685	-24,30%
8	HB-1076	726,73	728,45	727,59	0,86	-247,445	-25,40%

Пример 4

Идентификация пептидов, ингибирующих воспалительную активность, индуцированную ультрафиолетовыми лучами спектра B (UVB), в клетках

При условии, что конкретные маленькие пептиды способны поддерживать противовоспалительную активность в покоящихся клетках (см. пример 3), представляет интерес понимание, могут ли маленькие пептиды поддерживать такую активность в клетках, облученных ультрафиолетовыми лучами спектра В. Ультрафиолетовые лучи спектра В повреждают кожу и вызывают ее старение. Так как воспаление в поврежденной ткани способствует старению этой ткани, подавление воспаления в эпидермисе, обусловленное повреждением, вызванным ультрафиолетовым излучением, снизит вызываемые им эффекты старения.

Анализ проводили для определения способности фрагментов пептида HB-107 стимулировать противовоспалительную активность в клетках, облученных ультрафиолетовым излучением. Эпителиальные клетки человека (ATCC CRL-2592) высевали в 6-луночные планшеты и выращивали до достижения более чем 95% конфлюентности в DMEM с 4 мМ L-глутамина, доведенной до содержания 1,5 г/л бикарбоната натрия и 4,5 г/л глюкозы (полная среда), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки находились в среде без сыворотки в течение 5 часов перед воздействием ультрафиолетовых лучей спектра В. Ультрафиолетовые лучи спектра В получали с использованием лампы UVLMS (4W model, 3UV assembly, Upland, CA) с установленной длиной волны излучения 302 нм. Лампу ультрафиолетового излучения помещали на 12 см выше планшета с культурой ткани (6-луночный планшет) и одновременно подвергали воздействию две лунки, обеспечивая гомогенное излучение ультрафиолетовых лучей спектра В. Клетки подвергали облучению ультрафиолетовыми лучами спектра В (450 мкВ/см², измеряли с использованием радиометра) в PBS во избежание индуцированного ультрафиолетовым излучением накопления токсических фотохимикатов. Экспрессию IL6 измеряли как индикатор активности клеточного воспаления в ответ на действие ультрафиолетовых лучей спектра В. Как показано на фиг.2, экспрессию IL6 в эпителиальных клетках кожи индуцировали зависимым от дозы ультрафиолетовых лучей спектра В способом, таким образом показывая, что ультрафиолетовое излучение стимулирует клеточный воспалительный процесс в эпителиальных клетках кожи.

Выделенные пептиды проверяли для определения их действия на экспрессию IL6 в эпителиальных клетках кожи, индуцированную ультрафиолетовыми лучами спектра В. На клетки воздействовали ультрафиолетовыми лучами спектра В (450 мкВ/см ²) в течение 35 секунд в PBS, после чего PBS замещали полной средой без сыворотки в присутствии или в отсутствие 40 мкг/мл пептида и инкубировали при 37 градусах C/5% CO₂ в течение двадцати часов. Затем, перед началом ELISA для IL6 человека (CellSciences, MA) супернатант среды собирали и центрифугировали при 10000 об/мин для удаления дебриса. Обнаружили, что конкретные последовательности внутри пептида HB-107 способны значительно снижать экспрессию IL6 в клетках, подвергнутых действию мощного воспалительного сигнала (таблица 5, результаты представлены графически на фиг.3).

Таблица 5 Эффект коротких пептидов на экспрессию IL6 в эпителиальных клетках кожи, индуцированную ультрафиолетовыми лучами спектра В. На клетки воздействовали ультрафиолетовыми лучами спектра В с последующей инкубацией с пептидом. Контрольные клетки не обрабатывали ни ультрафиолетовыми лучами спектра В, ни пептидами. Экспрессию IL6 измеряли с помощью ELISA, используя оптический спектрометр (OD 450)
SEQ ID NO	Обработка УФ/пептид	IL6 (OD 450)	SD
	Контроль	0,0730	0,001414
	Только УФ	0,7305	0,062933
1	HB-107	0,7315	0,043134
12	HB-802	0,6500	0,035423
15	HB-1410	0,5105	0,013435
11	HB-801	0,8275	0,204354

Результаты этого исследования показывают, что пептиды, такие как HB-1410 (PKEK, SEQ ID NO:15), способны значительно снижать уровень IL6, продуцируемого эпителиальными клетками кожи в ответ на ультрафиолетовое облучение. Эта активность представляет собой конкретное применение для ухода за кожей после воздействия солнца, а также широко применяется для снижения воспаления, обусловленного различными состояниями кожи, возникающими вследствие ранений и старения. Интересно отметить, что даже незначительные модификации в последовательности пептида могут значимо изменять ингибирующую активность пептида в отношении экспрессии IL6 в эпителиальных клетках кожи [например, при сравнении видов активности HB-801 (PKEKV) и HB-802 (MPKEK) с ингибирующей активностью HB-1410]. Интересно, что HB-802 проявляет способность подавлять IL6 в покоящихся клетках (относится к примеру 3, таблица 4).

Все композиции или способы, описанные и заявленные в этом документе, можно получать и осуществлять без излишнего экспериментирования с учетом настоящего описания. В то время как композиции и способы по данному изобретению описаны в терминах предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области очевидно, что вариации можно применять к композициям и/или способам и на этапах или в последовательности этапов в способах, описываемых в настоящем документе, не отступая от идеи, сущности и объема изобретения. Более конкретно, очевидно, что конкретные соединения, которые связаны как химически, так и физиологически, можно заменять на соединения, описываемые в настоящем документе, до тех пор, пока будут достигнуты такие же или похожие результаты. Считают, что такие похожие замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, находятся в пределах объема изобретения.

Все патенты и публикации, указанные в этой заявке, включены, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме.

Список литературы

Braff M.H, Gallo R.L, (2006). Antimicrobial peptides: an essential component of the skin defensive barrier. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 306:91-110.

Enoch S, Price P. (2004). Cellular, molecular and biochemical differences in the pathophysiology of healing between acute wounds, chronic wounds and wounds in the aged. World Wide Wounds. Online: http://www.worldwidewounds.com.

Fisher G.J, Kang S, Varani J, Bata-Csorgo Z, Wan Y, Datta S, Voorhees J.J, (2002). Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. Arch. Dermatol. 138:1462-1470.

Kyte J, Doolittle R.F, (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105-132.

Lee P.H, Rudisill J.A, Lin K.H, Zhang L, Harris S.M, Falla T.J, Gallo R.L (2004). HB-107, a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B, accelerates murine wound repair. Wound Repair Regen. 12:351-358.

Liechty K.W, Adzick N.S, Crombleholme T.M, (2000). Diminished interleukin 6 (IL-6) production during scarless human fetal wound repair. Cytokine. 12:671-676.

Martin P, Leibovich S.J, (2005). Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends Cell Biol. 15:599-607.

Mustoe T.A, Cutler N.R, Allman R.M, Goode P.S, Deuel T.F, Prause J.A, Bear M, Serdar C.M, Pierce G.F, (1994). A phase II study to evaluate recombinant platelet-derived growth factor-BB in the treatment of stage 3 and 4 pressure ulcers. Arch. Surg. 129:213-219.

Oyama N, Sekimata M, Nihei Y, Iwatsuki K, Homma Y, Kaneko F. (1998). Different growth properties in response to epidermal growth factor and interleukin-6 of primary keratinocytes derived from normal and psoriatic lesional skin. J. Dermatol. Sci. 16:120-128.

Pelicci P.G, (2004). Do tumor-suppressive mechanisms contribute to organism aging by inducing stem cell senescence? J. Clin. Invest. 113:4-7.

Presland R.B, Dale B.A, (2000). Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11:383-408.

Sato S, Hasegawa M, Takehara K. (2001). Serum levels of interleukin-6 and interleukin-10 correlate with total skin thickness score in patients with systemic sclerosis, J. Dermatol. Sci. 27:140-146.

Shaykhiev R, Beisswenger C, Kandler K, Senske J, Puchner A, Damm T, Behr J, Bals R, (2005). Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure. Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 289:L842-L848.

Steed D.L, (1995). Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic Ulcer Study Group. J. Vasc. Surg. 21:71-78.

Sugawara T, Gallucci R.M, Simeonova P.P, Luster M.I, (2001). Regulation and role of interleukin 6 in wounded human epithelial keratinocytes. Cytokine. 15:328-336.

Sweitzer S.M, Fann S.A, Borg T.K, Baynes J.W, Yost M.J, (2006). What is the future of diabetic wound care? Diabetes Educ. 32:197-210.

Zhang L, Falla T.J, (2006). Antimicrobial peptides: therapeutic potential. Expert Opin. Pharmacother. 7:653-663.