способ клонального микроразмножения сирени in vitro

Формула изобретения

1. Способ клонального микроразмножения сирени in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений на одноузловые сегменты, высадку их на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы, хелат железа, витамины, сахарозу, агар-агар и цитокинины, получение микропобегов, их черенкование и укоренение на среде, содержащей ауксины, отличающийся тем, что высадку одноузловых сегментов осуществляют на питательную среду Quorin & Lepoivre или Woody Plant Medium, или Driver & Kuniyuki с добавлением 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламиноурина, и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина, и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина, 50-1000 мг/л антибиотика из группы -лактамных антибиотиков, и/или 5-500 мг/л антибиотика из группы аминогликозидов, и/или 10-1000 мг/л антибиотика из группы тетрациклинов, и/или 1-100 мг/л антибиотика из группы циклических гликопептидов, а укоренение осуществляют на среде, содержащей 1/2 концентрации микросолей по прописи Murashige & Skoog с добавлением 50-1000 мг/л антибиотика из группы -лактамных антибиотиков, и/или 5-500 мг/л антибиотика из группы аминогликозидов, и/или 10-1000 мг/л антибиотика из группы тетрациклинов, и/или 1-100 мг/л антибиотика из группы циклических гликопептидов, 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,01 мг/л -нафтилуксусной кислоты или 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду в качестве антибиотика группы -лактамных антибиотиков добавляют пенициллин, или ампициллин, или цефотаксим, или тикарциллин, в качестве антибиотика из группы аминогликозидов - стрептомицин, в качестве антибиотика из группы тетрациклинов - тетрациклин, в качестве антибиотика из группы циклических гликопептидов - ванкомицин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности цветоводству, и может быть использовано для оздоровления и микроразмножения растений сирени in vitro.

Известен способ микроразмножения сирени, включающий черенкование выращиваемых in vitro растений на одноузловые сегменты, посадку черенков на питательную среду для мультипликации, содержащую микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [2], 1,5 концентрацию макроэлементов MS, 35 г/л сахарозы, 8 г/л Difco бакто-агара и 1 мг/л 2-изопентениладенина (2ip), получение пробирочных микрорастений, повторное их черенкование и высадку полученных регенерантов на среду укоренения с ауксинами (R.L.M.Pierik; H.H.M.Steegmans; A.A.Elias; O.T.J.Stiekema; A.J.van der Velde. Vegetative propagation of Syringa vulgaris L. in vitro. // Acta Hort., 226 (1988) 195-204.).

Недостатком данного способа размножения является то, что растения по окончанию этапа размножения получаются утолщенными и укороченными со скрученными листьями вдоль центральной жилки (витрифицированными) (Рисунок 1). Эти микропобеги плохо укореняются (Рисунок 2). Укорененные микрорастения такого качества неспособны адаптироваться к условиям ex vitro.

Технический результат изобретения заключается в повышении выхода нормально сформированных корнесобственных микрорастений, улучшении роста и развитии эксплантов при положительном влиянии оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, регуляторов роста растений и антибиотиков.

Сущность изобретения заключается в том, что одноузловые сегменты выращиваемых in vitro растений помещают на среду для мультипликации, содержащую макро-, микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) или или Кворина-Лепорье (1977) (QL) (Quorin M. & Lepoivre P., Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. // Acta Hort., 78 (1977) 437-442) или Вуди Плант Медиум (WPM) (Lloyd G. & McCown В., Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by shoot tip culture. // Comb. Proc. Int. Plant Prop.Soc, 30 (1980) 421-427) или Драйвер и Куниюки (DKW) (Driver J.A., Kuniyuki A.H., In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. // Hort. Science, 19 (4), August (1984).), 30-40 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина (Z) и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина (kin) и антибиотики (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах при освещении белыми люминесцентными лампами общей интенсивностью 2000-4000 люкс при 16-часовом фотопериоде и температуре 21-25°C. Полученные пробирочные микрорастения повторно черенкуют на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Одноузловые сегменты повторно выращиваются на среде мультипликации, а апикальные высаживают на среду укоренения. Она содержит ½ макроэлементов, полные микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи MS, 10-30 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, перечисленные выше антибиотики, 0,1 мг/л ИМК, а также 0,01 мг/л НУК или 0,1 мг/л ИУК.

Добавление сахарозы в питательные среды в концентрациях более 40 г/л снижает интенсивность роста растений и приводит к их витрификации. Добавление в питательные среды регуляторов роста и антибиотиков в предложенных концентрациях наиболее оптимально подходят для роста эксплантов и не оказывают токсического воздействия и эффекта угнетения культуры.

Предлагаемый способ клонального микроразмножения сирени реализуется следующим образом:

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, pH 5,6-5,8. После этого растворяется навеска агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 ати (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста и антибиотиков. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам.

Все манипуляции с растительным материалом производится в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 штук.

2. Размножение растительного материала проводят на средах мультипликации, приготовленных по прописи MS или QL или WPM или DKW, дополненных сахарозой (30-40 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), БАП и/или зеатином (0,2-2,0 мг/л) или кинетином (0,5-1,5 мг/л) и антибиотиками (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). При этом наиболее оптимальными минеральными композициями являются MS и QL. Для цитокининов наиболее удачны концентрации 0,2-1,0 мг/л как для БАП, так и для зеатина, для кинетина - 0,9-1,1 мг/л, а для антибиотиков - пенициллин (50-100 мг/л) и/или ампициллин (50-100 мг/л) и/или цефотаксим (50-200 мг/л) и/или тикарциллин (10-50 мг/л) и/или стрептомицин (5-50 мг/л) и/или тетрациклин (10-100 мг/л) и/или ванкомицин (1-15 мг/л).

3. Полученные микропобеги черенкуются на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Серединные сегменты повторно переносятся на среды мультипликации. Апикальные части высаживают на среду укоренения. В качестве среды для укоренения используется редуцированная до ½ по макросолям среда MS, дополненная сахарозой (10-30 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), антибиотиками (перечень и концентрации указаны в п.2).

Эффективность укоренения оценивается долей укорененных хорошо сформированных микрорастений от числа всех эксплантов, выраженной в процентах.

В таблицах 1-3 представлены результаты исследований по влиянию на укореняемость микропобегов условий предшествующего этапа культивирования, а именно: концентрация цитокининов (БАЛ, зеатин и кинетин), минеральный состав питательной среды (MS, QL, WPM и DKW), наличие антибиотиков в среде. В качестве контрольного варианта использовались среда и концентрация цитокинина (2-изопентениладенин), описанные в прототипе.

Таблица 1
Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от концентраций фитогормонов, применяемых на этапе мультипликации (при использовании среды MS)
Среда укоре нения	Среда мультипликации
Прото тип	Z 0,5 мг/л	БАП 0,2 мг/л	Z 0,2 мг/л; БАП 0,5 мг/л	Z 0,5 мг/л; БАП 0,2 мг/л	БАП 1,0 мг/л	БАП 2,0 мг/л	Z 1,0 мг/л	Z 2,0 мг/л	kin 0,5 мг/л	kin 1 мг/л	kin 1,5 мг/л
Примроуз
R 10*	45	60	43	63	50	60	37	95	79	53	57	39
R20*	51	43	40	72	30	63	42	95	77	50	63	43
R30*	47	45	39	57	35	60	40	90	81	46	53	30
Богдан Хмельницкий
R10	54	75	40	90	50	80	61	84	74	54	81	28
R20	51	95	35	93	95	85	57	97	79	62	92	30
R30	62	80	35	89	70	82	63	94	83	63	76	35
Надежда
R10	48	65	50	65	88	73	64	93	83	61	60	58
R20	48	70	50	62	92	76	71	87	85	67	64	61
R30	45	70	45	70	87	74	59	78	79	67	68	66
* - где R - редуцированная по макросолям до ½ среда MS, цифровой индекс после R означает концентрацию сахарозы в среде в граммах на 1 литр (Здесь и далее)

Таблица 2
Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на различных питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды
Среда укоренения	Минеральный состав среды на этапе мультипликации
MS	QL	WPM	DKW
Цитокинин (концентрация 1 мг/л)
Z	БАП	Kin	Z	БАП	Kin	Z	БАП	Kin	Z	БАП	Kin
R10	95	60	57	90	90	65	80	75	69	89	67	65
R20	95	63	63	97	93	71	79	73	70	92	72	64
R30	90	60	53	95	95	70	75	77	68	94	70	65
Результаты представлены на примере сорта Примроуз.

Таблица 3
Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды и наличия антибиотика, применяемых на этапе мультипликации
Среда укоренения	Среда мультипликации
MS; Z 1,0 мг/л	MS; Z 1,0 мг/л; CEF	QL; Z 1,0 мг/л;	QL; Z 1,0 мг/л; CEF
R10	75	80	80	85
R20	70	75	68	81
R30	80	95	84	100
Результаты представлены на примере сорта Президент Греви. Статистически достоверные различия отсутствуют в вариантах питательных сред, где цевотаксим содержится в концентрациях от 50 до 150 мг/л.

При добавлении индивидуальных антибиотиков в среду культивирования в следующих концентрациях: ванкомицин 1-15 мг/л и/или цефотаксим 50-150 мг/л и/или тикарциллин 10-50 мг/л и/или пенициллин 50-100 мг/л и/или ампициллин 50-100 мг/л и/или стрептомицин 5-50 мг/л и/или тетрациклин 10-100 мг/л - статистически достоверных различий не выявлено (данные не представлены).

Добавление НУК или ИУК в заявленных концентрациях не вызывало статистически достоверных различий процента укоренения (данные не представлены).

Использование перечисленных концентраций фитогормонов позволяют увеличить эффективность укоренения микропобегов сирени в культуре in vitro относительно прототипа до 2 раз.