синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа

Формула изобретения

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участку NS-гена вируса лихорадки долины Рифт, используемые для инициации синтеза ПЦР-продукта для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт и имеющие следующий нуклеотидный состав:

Е-31 5' - ate aga att ccc ata ccg agt eg

E-32 5' - cgcaac etc taa tea ace tea ac

Е-33 5' - att etc act ggc ttt ctt cga cc

Е-34 5' - cga taa gaa caa tga ggg ctg ag.

2. Способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины Рифт для идентификации эпизоотических и аттенуированных штаммов, включающий амплификацию участка NS-гена методом ПЦР, отличающийся тем, что используют праймеры по п.1 и применяют рестрикционный анализ амплификатов, предусматривающий расщепление фрагментов ПЦР с применением подобранного комплекса эндонуклеаз Рае I, Vne I и Pst I, разделение полученных рестриктов электрофорезом в геле 2%-ной агарозы, сравнение фрагментов рестрикции по размеру со специфическими фрагментами плазмидного положительного контроля размерами 432 и 189 п.о. (Рае I) и отсутствием сайтов для Vne I и Pst I, затем проводят учет результатов реакции путем выявления наличия или отсутствия специфических сайтов узнавания рестриктаз у исследуемых штаммов для их дифференциации по определению длин фрагментов после обработки полученного ПЦР-продукта рестриктазами Vne I, Pst I и Рае I, при этом, если фрагментов не образуется, то делается вывод о наличии штамма 1974-ВНИИВВ и М, если рестриктаза Рае I расщепляет на два фрагмента длиной 432 и 189 и.о., то делается вывод о наличии штамма RVF(s) 113, а если на два фрагмента длиной 421 и 200 п.о., то делается вывод о наличии штамма Энтеббе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к применению методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа для выявления и дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов (изолятов) вируса лихорадки долины Рифт (ЛДР), и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях с целью эпизоотологического контроля и мониторинга болезни.

Во время вспышки ЛДР при проведении противоэпизоотических мероприятий необходимо проведение быстрых и точных экспертизных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки идентифицировать возбудитель.

Для лабораторной диагностики ЛДР и дифференциации штаммов (изолятов), как правило, используют вирусологические и серологические методы исследований: выделение вируса в культуре клеток, биопроба на мышах, реакция нейтрализации (РН), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), методы флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА). (Сюрин В.Н. и др., 1998). Однако эти методы не всегда удовлетворяют требованиям диагностики, в частности, возможности быстрого обнаружения и типирования вируса (Clarke D.H. 1958, Megan J.M., 1989). Кроме того, с целью обеспечения безопасности при работе с возбудителем указанной болезни необходимо использовать специально оборудованные помещения для работы с возбудителями 2-й группы патогенности.

В настоящее время разработаны способы диагностики с использованием методов молекулярной биологии, позволяющие оперативно выявлять геном возбудителя болезни (Garcia S., Crance J.M. et al., 1999).

Одним из путей оперативной и ретроспективной диагностики болезни, эпизоотологического мониторинга и изучения вариабельности вируса является использование методов на основе ПЦР, во многом определяющих направление для разработки комплексной программы профилактики и оценки эпизоотологической ситуации по ЛДР. По чувствительности обнаружения вируса ПЦР в десятки и сотни раз превышает, например, традиционно используемые серологические тесты и методы выделения на культуре или лабораторных животных, а экономичность, экспрессность и биологическая безопасность при работе с возбудителем болезни ставит этот метод вне конкуренции по сравнению с вышеуказанными (Белов А. и др., 2006 г.). Наряду с перечисленными преимуществами метод ПЦР позволяет обнаруживать вирус в пробах органов больных и павших овец, в разложившихся тканях, а также в фекалиях, объектах внешней среды и ветеринарного надзора. Например, в 2000 году Jupp P.G. et al., разработали способ выявления генома вируса ЛДР с помощью гнездовой ОТ-ПЦР, чувствительность которого достигала 0,5 БОЕ₅₀/см ³. Espash A. et al., (2002) разработали способ выявления генома вируса ЛДР с помощью однораундовой ОТ-ПЦР. Праймеры в данной реакции были подобраны на М-сегмент.Размер продукта составлял 363 п.о., а чувствительность метода составила 0, 25 ТЦД₅₀ /см³. М - сегмент кодирует наиболее консервативные белки, обладающие протективными свойствами.

Наиболее близким аналогом по сути и назначению является способ, сочетающий амплификацию участков консервативного S-сегмента генома, коррелирующего с основными свойствами вируса ЛДР и секвенирование полученных ампликонов с целью выявления различий и определения особенностей их генетической структуры (Sail A.A. et al., 2000). Основным недостатком данного способа является то, что для определения нуклеотидной последовательности (сиквенса) требуются значительные материальные затраты, а общее время анализа составляет не менее 16 часов. Из-за необходимости использования специального дорогостоящего оборудования (секвенатор и др.) существенно ограничиваются возможности широкого применения данного способа в диагностических ветеринарных лабораториях. Для устранения указанных недостатков необходимым условием является повышение экономичности и экспрессности способа, позволяющего значительно сократить затраты и сроки исследования генома вируса ЛДР при идентификации и дифференциации различных штаммов (изолятов) данного возбудителя.

Целью данного изобретения является разработка высокочувствительного, экономичного и экспрессного способа лабораторной диагностики, позволяющего в короткие сроки (в течение 5-6 часов) и при небольших затратах выявлять РНК вируса ЛДР и проводить дифференциацию штаммов (изолятов) вируса, снижая до минимума опасность для работающих с ним людей, особенно при исследовании разложившихся патматериалов, когда выявление специфического антигена другими методами не дает четких результатов.

Поставленная цель достигается тем, что для ускорения процесса выявления генома и дифференциации изолятов (штаммов) вируса ЛДР, а также снижения затрат на исследование и обеспечение безопасности здоровья работающего персонала, используют сочетание методов ПЦР и рестрикционного анализа, синтезированных амплификатов генома. Применение ПЦР метода с последующим рестрикционным анализом имеет большое значение для идентификации вируса ЛДР, а также для определения его филогенетического родства с другими штаммами. Специфические праймеры для проведения ПЦР имеют следующий нуклеотидный состав:

Е-31 5'-ate aga att ccc ata ccg agt eg

E-32 5"-cgcaac etc taa tea ace tea ac

E-33 5'-att etc act ggc ttt ctt cga cc

E-34 5'-cga taa gaa caa tga ggg ctg ag

Использование рассчитанных пар праймеров для инициации позволяет синтезировать специфический продукт с помощью двухраундовой ПЦР.

Применение ПЦР позволяет накапливать необходимые участки для исследования фрагментов генома вируса ЛДР, а с помощью рестрикционного анализа - выявлять различия последовательностей нуклеотидов вплоть до точечных мутаций в амплифицированном фрагменте. Выбор области генома для исследований обусловлен тем, что изменения в консервативном NS-гене коррелируют с такими признаками (свойствами) вируса как патогенность, тропизм и т.д. Для выявления и дифференциации изолятов и штаммов вируса ЛДР применяется расщепление фрагментов ПЦР набором эндонуклеаз (Рае I, Vne I и Pst I), разделение рестриктов электрофорезом в геле 2% агарозы и сравнение профилей рестрикции с профилем специфического фрагмента плазмидного положительного контроля, что позволяет проводить анализ структуры консервативного участка S-сегмента (NS-гена) и выявлять наличие изменений.

Сущность предложенного способа заключается в том, что для идентификации вируса ЛДР подобраны праймеры, имеющие следующий нуклеотидный состав:

Е-31 5'-ate aga att ccc ata ccg agt eg

E-32 5'-cgcaac etc taa tea ace tea ac

E-33 5'-att etc act ggc ttt ctt cga cc

Е-3 4 5'-cga taa gaa caa tga ggg ctg ag,

комплементарные нуклеотидным последовательностям S-сегмента генома вируса, кодирующего неструктурный белок NSs. Подобранные праймеры комплементарны участку S-сегмента РНК всех исследованных штаммов вируса и расположены в нуклеотидных позициях с 203 по 818 нуклеотид (прямой-внешний Е-31 и обратный-внешний E-32) и с 388 по 670 нуклеотид (прямой-внутренний E-33 и обратный-внутренний Е-34), ограничивая продукты амплификации размером 615 п.о. и 285 п.о. соответственно. Рассчитанные пары праймеров позволяют синтезировать специфический продукт с помощью двух раундов ПЦР. В качестве контроля для обеспечения безопасности использования предложенного метода используется рекомбинантная плазмида со встройкой NS-гена. На основе полученных экспериментальных данных разработан способ выявления РНК вируса ЛДР с помощью ПЦР и дифференциации штаммов (изолятов) с использованием комплекса рестриктаз, который может быть включен в схему ранней диагностики болезни для обнаружения РНК в пробах органов и тканей больных и подозреваемых в заражении животных, а также в вируссодержащих культуральных материалах и объектах ветеринарного надзора. С помощью рестрикционного анализа амплификатов генома вируса можно проводить идентификацию возбудителя ЛДР и паспортизацию производственных референс-штаммов с использованием подобранного комплекса рестриктаз.

Техническим результатом данного изобретения является повышение экономичности, сокращение времени проведения диагностической работы в пробах органов и крови от больных животных, а также в вируссодержащих материалах и других объектах. Кроме того, за счет применения рестрикционного анализа, вместо дорогостоящего сиквенса можно использовать способ в любой диагностической ветеринарной лаборатории.

Существенным отличием предложенного способа является следующее.

1. Сокращение времени постановки реакции позволяет в 2-3 раза быстрее (в течение 5-6, вместо 14-16 часов) обнаружить различия в РНК вирусных штаммов и изолятов возбудителя ЛДР.

2. Не применяется сиквенс, что в 8-10 раз экономичнее, так как вместо дорогостоящей аппаратуры (секвенатора и др.) используются сравнительно недорогие реактивы (рестриктазы и др.).

3. Доступность и перспективность применения данного способа в любой ветеринарной лаборатории за счет использования рестрикционного анализа без снижения чувствительности и специфичности метода.

4. Использование рекомбинантной плазмиды со встройкой NS-гена в качестве положительного контроля в предложенном способе обеспечивает биологическую безопасность проведения исследований для идентификации и дифференциации вирусных изолятов в пробах органов больных и павших животных, в том числе в разложившихся тканях, где практически невозможно выявить антиген другими методами, а также в вируссодержащих культуральных материалах и в объектах ветеринарного надзора.

Таким образом, разработан высокочувствительный, специфичный, экономичный и биологически безопасный способ на основе ОТ-ТЦР и рестрикционного анализа для выявления и дифференциации штаммов (изолятов), позволяющий в течение 5-6 часов определить индивидуальные характеристики структуры NS-гена вируса ЛДР. Кроме того, он безопасен для работающего с вирусом персонала и может быть включен в программу профилактики и эпизоотологического контроля распространения болезни и, что очень важно, использоваться в любой диагностической лаборатории, оснащенной амплификатором.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Оценка специфичности способа

Подобран оптимальный режим амплификации при использовании внешних и внутренних праймеров.

Для внешних праймеров:

денатурация	95°С	2 мин
отжиг	50°С	1 мин	} 1 цикл
синтез	72°С	1 мин
денатурация	94°С	1 мин	}35 циклов
отжиг	50°С	1 мин
синтез	72°С	1 мин
заключительный синтез	72°С	3 мин	}1 цикл

Для внутренних праймеров:

денатурация	95°С	1 мин
отжиг	50°С	1 мин	} 1 цикл
синтез	72°C	1 мин
денатурация	94°С	35 сек
отжиг	55°С	35 сек	}35 1 мин
синтез	72°С	1 мин
заключительный синтез	72°С		} 1 цикл

Для проверки специфичности ОТ-ПЦР использованы различные препараты РНК с соответствующими контролями (таблица 1). Реакция высокоспецифична, так как не было выявлено наличие амплификатов при использовании в качестве матрицы нуклеиновых кислот других представителей буньявирусов или гетерологичных вирусов овец.

Разработанная ПЦР с наружными и гнездовыми праймерами позволяет одинаково четко идентифицировать эпизоотический штамм «Энтеббе» и аттенуированные штаммы «1974-ВНИИВВиМ» и «RVF (s) 113» в пробах инфицированных органов и тканей и культурах клеток.

Таблица 1
Результаты определения специфичности ПЦР с праймерами, комплементарными гену NSs
			(n=6)
№ про б	Наименование препаратов РНК	Характеристика проб.	Peзультат
1	РНК, выделенная из культурального вируса ЛДР (штамм «1974-ВНИИВВиМ», 3 пассаж ПС);	7,25 1g ТЦД	+
2	РНК, выделенная из культурального вируса ЛДР (штамм «1974-ВНИИВВиМ», 3 пассаж ПСГК);	6,75 1g ТЦД	+
3	РНК, выделенная из культурального вируса ЛДР (штамм «RVF(s)113, 3 пассаж ПС);	5,65 1g ТЦД	+
4	РНК, выделенная из культурального вируса ЛДР (штамм «RVF(s)113, 3 пассаж ПСГК);	6,68 1g ТЦД мл	+
5	РНК, выделенная из 10% суспензии органного материала мышей (мозг), зараженных вирулентным штаммом «Энтеббе» вируса ЛДР	4,33 1g MLD 50/мл	+
6	РНК, выделенная из 10% суспензии органного материала мышей (печень), зараженных вирулентным штаммом «Энтеббе» вируса ЛДР	7,54 1g MLD 50/мл	+
7	РНК выделенная из культурального вируса блютанга (ПСГК), серотип 4,	6,0-6,5 1g ТЦД 0/мл I	-
8	РНК, выделенная из 10% суспензии органного материала мышей (мозг) вируса Найроби (штамм ММ 156 пассаж на мышах);	6,0 1g MLD 50/мл
9	РНК, выделенная из 10% суспензии органного материала (мозг) вируса Акабане штамм «В 8935»	6,87 1g ТЦД 50/мл	-
10	РНК, выделенная из лиофилизированного материала вируса ЧМЖ (шт. «45g35» 3 пассаж ПС);	5,5 1g ТЦД	-
11	РНК, выделенная из лиофилизированного препарата вируса парагриппа КРС (штамм ПГ/К, 3 пассаж ПС);	7,0 1g ТЦД 50/мл
12	Общий пул РНК, выделенной из пробы 10% суспензии интактной печени КРС	-	-
Примечание: «+» - РНК выявлена,
«-» - РНК не выявлена.

Для проведения рестрикционного анализа продуктов ПЦР различных штаммов вируса ЛДР испытуемые ПЦР-продукты разводят в 5 раз рестрикционным буфером, добавляют по 0,2-0,5 ед./акт каждой из 3-х подобранных рестриктаз и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 2% геле агарозы в течение 30 мин с применением трисацетатного буферного раствора. После расщепления ПЦР-продукта рестриктазами образуется характерный для каждого изолята (штамма) дискретный набор фрагментов, соответствующий по суммарному размеру продукту амплификации 621 п.о. Профили рестрикции выявляют по флуоресценции этидиум бромида, добавленного в каждую испытуемую пробу, при использовании УФ-трансиллюминатора.

Результаты рестрикционного анализа и электрофоретического разделения фрагментов приведены в таблице 3.

Таблица 3
(n=12)
Размер продуктов рестрикции испытуемых штаммов вируса ЛДР
N	Штаммы
п/п	Энтеббе	1974-ВНИИВВиМ	«RVF(s)113»
	Vne I	Pst I	Pae I	Vne I	Pst I	Pae I	Vne I	Pst I	Pae I
1	421 п.о.	408 п.о.	421 п.о.	-	-	-	-	-	432 п.о.
2	200 п.о.	213 п.о.	200 п.о.	-	-	-	-	-	189 п.о.

Как видно из таблицы 3, ПЦР-продукт, полученный на матрице РНК эпизоотического штамма вируса ЛДР имеет два уникальных сайта для рестриктаз Vne I и Pst I. Каждая из рестриктаз расщепляет указанный фрагмент на два, размерами 421, 200 п.н. и 408, 213 п.о. соответственно. Для аттенуированных штаммов 1974-ВНИИВВиМ и RVF (s) 113 вируса ЛДР не обнаруживается наличие описанных сайтов в данных отрезках генома. ПЦР-продукт штамма RVF (s) 113 также имеет уникальный сайт для рестриктазы Рае I. Рестриктаза Рае I расщепляет ПЦР-продукт штамма RVF (s) 113 на два отрезка, размерами 432 и 189 п.о., тогда как ПЦР-продукт штамма «Энтеббе»расщепляется Рае I на фрагменты размером 421 и 200 п.о.

Итак, дифференциация штаммов происходит по определению длин фрагментов после обработки полученного ПЦР - продукта рекстриктазами Vne I, Pst I и Рае I, при этом если фрагментов не образуется, то делается вывод о наличии штамма 1974-ВНИИВВиМ, если рестриктаза Рае I расщепляет на два фрагмента длинной 432 и 189 п.о., то делается вывод о наличии штамма RVF(s) 113, а если на два фрагмента длиной 421 и 200 п.о., то делается вывод о наличие штамма Энтеббе.

Профили рестрикции испытуемых штаммов сравнивают с результатами расщепления ПЦР-продукта с контрольной плазмиды. Филогенетическое родство оценивают по наличию сайтов и сходству профилей рестрикции с контрольным образцом и испытанными ранее штаммами. Присутствие в исследуемых образцах характерных фрагментов и отсутствие/наличие сайтов отобранных рестриктаз указывает на генетическое родство штаммов и наличие определенных генетических признаков.

Таким образом, рестрикционный анализ ампликонов с помощью подобранного и предложенного комплекса эндонуклеаз (рестриктаз) позволяет выявить уникальные маркерные сайты амплификатов разных штаммов вируса ЛДР при их изучении, идентификации и паспортизации.

Предложенный высокочувствительный, специфичный, экономичный и безопасный для работающего персонала способ идентификации и дифференциации штаммов вируса ЛДР на основе использования ПЦР и рестрикционного анализа предназначен для его включения в программу профилактики и эпизоотологического мониторинга болезни и может быть использован в любой диагностической лаборатории, оснащенной амплификатором, что не требует больших затрат на приобретение секвенатора.