способ получения тагатозы с использованием олигосахарида сои

Формула изобретения

1. Способ получения тагатозы, включающий следующие стадии:

a. выделение олигосахарида сои из побочных продуктов сыворотки соевых бобов;

b. гидролиз олигосахарида сои путем использования не содержащей инвертазы -галактозидазы;

c. изомеризация гидролизованного раствора сахара путем использования изомеразы арабинозы для получения изомеризованного продукта, включающего смешанный сахар, содержащий сахарозу, галактозу и тагатозу в качестве основных компонентов; и

d. разделение изомеризованного раствора хроматографией.

2. Способ получения тагатозы по п.1, где стадия получения раствора сахара, в котором содержание сахара снижено кристаллизацией сахарозы из гидролизованного олигосахарида сои, дополнительно включена после стадии b).

3. Способ получения тагатозы по п.1 или 2, где стадия повторного цикла переработки не вступившей в реакцию галактозы кроме того включена после стадии d).

4. Способ получения тагатозы по п.3, где не вступившую в реакцию галактозу отделяют хроматографией и затем подвергают повторному циклу переработки на стадии b) или стадии с).

5. Способ получения тагатозы по п.1, где побочный продукт сыворотки соевых бобов предварительно обрабатывают ультрафильтрацией или микрофильтрацией.

6. Способ получения тагатозы по п.1, где концентрация олигосахарида сои составляет 10-50%.

7. Способ получения тагатозы по п.1, где гидролиз выполняют при 40°C.

8. Способ получения тагатозы по п.1, где -галактозидаза получена из Mortierella vinaceae (варианта, утилизирующего раффинозу, АТСС 20034) или Absidia griseola (АТСС 20431).

9. Способ получения тагатозы по п.1, где -галактозидаза способна селективно расщеплять альфа 1,4-связь между сахарозой и галактозой.

10. Способ получения тагатозы по п.1, где сахарозу и галактозу получают гидролизом на стадии b).

11. Способ получения тагатозы по п.1, где изомераза арабинозы получена из термофильной Thermotoga neapolitana DSM5068.

12. Способ получения тагатозы по п.1, где сахароза, галактоза и тагалоза вместе составляют по меньшей мере 90% изомеризованного раствора.

13. Способ получения тагатозы по п.1, где хроматография стадии d) представляет собой однократную хроматографию.

14. Способ получения тагатозы по п.13, где при хроматографии стадии d) используют смолу, содержащую остаток Ca.

15. Способ получения тагатозы по п.1, где реакции стадии b) и c) выполняют в одном и том же реакторе одновременно.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения тагатозы с использованием олигосахарида сои или раствора растворимого сахара, содержащего его, точнее к способу получения тагатозы с использованием галактозы, которая извлекается селективным гидролизом из растворимого олигосахарида в сое.

Предшествующий уровень техники

Тагатоза имеет естественную сладость, которую трудно отличить от сладости сахарозы. Физические свойства тагатозы также очень похожи на свойства сахарозы. Однако принятая внутрь тагатоза трудно абсорбируется в тонком кишечнике, свидетельствуя о том, что она не воздействует на уровень сахара в крови. Тагатоза также является низкокалорийным подсластителем, калорийность которого составляет лишь примерно 30% от калорийности сахарозы. Тагатоза оказывает пребиотический эффект, ускоряющий пролиферацию благоприятных молочных бактерий посредством брожения микроорганизмов рубца.

Однако эта благоприятная тагатоза представляет собой редкий сахар, который не распространен в природе, но включен в молочные продукты или некоторые растения в очень низкой концентрации. Для применения тагатозы в качестве низкокалорийного функционального подсластителя требуется новая методика для массового производства тагатозы из недорогого сырьевого материала.

В патентах США № № 5002612 и 5078796 описан способ получения D-тагатозы, при котором лактоза или содержащий лактозу материал гидролизуется в смесь галактозы и глюкозы путем использования лактозы, а затем глюкоза бессистемно удаляется с последующей химической изомеризацией галактозы в тагатозу.

В патенте США № 6057135 описан способ получения тагатозы, включающий следующие стадии: получение галактозы и глюкозы гидролизом сырной сыворотки или молока, изомеризации полученной галактозы изомеразой L-арабинозы и повторного цикла переработки не превращенных соединений после разделения продуктов и не превращенных соединений хроматографией.

Основные сырьевые материалы, которые до настоящего времени использовались для получения тагатозы, представляют собой побочные продукты переработки молока, такие как лактоза, или материалы, содержащие лактозу. В способе биотрансформации, в котором используется лактоза или материалы, содержащие лактозу, в качестве исходного материала, получение тагатозы следует в основном выполнять двухэтапной реакцией (лактоза галактоза тагатоза).

Описание

Техническая задача

На основании изложенных выше фактов авторы изобретения изучили и провели поиск сырьевых материалов, за исключением лактозы, которые среди побочных продуктов переработки древесины и других материалов содержат в большом количестве галактозу и которые с низкими затратами могут быть получены в природе. Затем авторы изобретения подтвердили, что побочные продукты изолированного белка сои, по сравнению с другими материалами, содержали высокую концентрацию галактозы и выбрали из них те, которые подходят для хроматографии. В результате авторы создали настоящее изобретение, подтвердив, что олигосахарид сои, полученный из изолированной сыворотки белка сои, представляет собой сырьевой материал, который действительно можно использовать для производства в промышленном масштабе.

Поэтому целью настоящего изобретения является разработка способа получения галактозы селективным гидролизом олигосахарида сои или раствора растворимого сахара, содержащего его.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения тагатозы, включающего следующие стадии: получение изомеризованного продукта изомеризацией галактозы в гидролизованном растворе сахара посредством ферментной изомеризации; и получение тагатозы хроматографией.

Техническое решение

Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение относится к способу получения галактозы селективным гидролизом олигосахарида сои или раствора растворимого сахара, содержащего его, в качестве основного компонента, путем использования альфа-галактазидазы.

Настоящее изобретение также относится к способу получения тагатозы, включающему следующие стадии:

1) гидролиз олигосахарида сои или раствора растворимого сахара, содержащего ее, в качестве основного компонента, селективно путем использования альфа-галактозидазы;

2) изомеризация галактозы в гидролизованном растворе сахара путем использования изомеразы арабинозы; и

3) получение тагатозы серийным разделением изомеризованного продукта путем использования хроматографии и повторного цикла переработки галактозы.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения тагатозы, в котором указанная стадия 1) и стадия 3) выполняются одновременно в одном и том же реакторе.

Преимущественный эффект

Авторы изобретения разработали эффективный способ получения тагатозы с учетом баланса материалов на каждой стадии и инвестиций в оборудование. В частности, для облегчения разделения хроматографией был разработан новый экономически рентабельный способ, использующий селективный гидролиз. Поэтому настоящее изобретение может использоваться для эффективного получения тагатозы в соответствии со следующими стадиями: получение галактозы не из обычной лактозы, а из олигосахарида сои и раствора растворимого сахара, содержащего его, в качестве основного компонента селективным гидролизом; и получение тагатозы однократной хроматографией раствора сахара, содержащего по меньшей мере 3 различных сахара (сахарозу, галактозу и тагатозу), получен изомеризацией указанной выше галактозы.

Краткое описание чертежей

Указанные выше и ниже цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего описания предпочтительных вариантов осуществления, представленных в сочетании с сопровождающими чертежами, на которых:

Фиг.1 и 2 представляют схематические диаграммы, иллюстрирующие способ разделения чистой хроматографией смешанного раствора сахаров.

Фиг.3 представляет график, показывающий профиль ВЭЖХ, который анализирует содержание сахара в олигосахариде сои.

Фиг.4 представляет график, показывающий результат компонентного анализа олигосахарида сои и результат его гидролиза.

Фиг.5 и 6 иллюстрируют результаты анализа содержания сахара в олигосахариде сои, обработанном лишенной инвертазы -глюкозидазой.

Фиг.7 и 8 иллюстрируют анализ типа разделения хроматографией ранее гидролизованного смешанного моносахарида.

Фиг.9 и 10 иллюстрируют сравнение формы и размера полученного кристалла тагатозы и выпускаемой промышленностью сахарозы под микроскопом (a: сахароза, b: тагатоза).

Фиг.11 иллюстрирует способ получения тагатозы с использованием побочного продукта соевой сыворотки или олигосахарида сои в качестве сырьевого материала.

Фиг.12 иллюстрирует кривую элюирования, полученную в результате теста 1 прохождения.

Фиг.13 иллюстрирует детальный чертеж случая 9 (разделение 3 фаз) имитации.

Фиг.14-16 иллюстрируют содержание сахара в изомеризованном продукте в смешанном растворе моносахарида, анализированного ВЭЖХ.

Фиг.17 представляет простую диаграмму, иллюстрирующую способ получения тагатозы с использованием одной хроматографии.

Фиг.18 представляет простую диаграмму, иллюстрирующую способ получения тагатозы с использованием одной хроматографии, включающий стадию кристаллизации сахарозы в качестве стадии предварительной обработки.

Лучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения тагатозы, включающему следующие стадии:

1) гидролиз олигосахарида сои или раствора растворимого сахара, содержащего ее, в качестве основного компонента, селективно путем использования альфа-галактозидазы;

2) изомеризация галактозы в гидролизованном растворе сахара путем использования изомеразы арабинозы; и

3) получение тагатозы серийным разделением изомеризованного продукта путем использования хроматографии и повторного цикла переработки галактозы.

Исходный материал по настоящему изобретению может представлять собой сыворотку соевых бобов, побочный продукт изолированного соевого белка, происходящий из него олигосахарид сои или раствор растворимого сахара, содержащий его в качестве основного компонента, и более предпочтительным является олигосахарид сои.

Сахар, содержащийся в сыворотке соевых бобов, представляет собой главным образом сахарозу, раффинозу и стахиозу, раффиноза и стахиоза составлены из полимера, в котором сахароза и галактоза объединены посредством альфа-1,4 связи. Углеводные компоненты указанных сахаров показаны в таблице 1. Каждый единичный компонент сыворотки соевых бобов или олигосахарида сои представляет собой сахарозу и галактозу или конкретнее подразумевается как смешанный моносахарид, включающий глюкозу, фруктозу и галактозу.

Таблица 1
Название углевода	Гликоген №	Содержание галактозы	Молярное отношение содержания сахара
Раффиноза	3	33,3	Сахароза:D-Галактоза=1:1
Стахиоза	4	50	Сахароза:D-Галактоза=1:2
Сахароза	2	0	-

В большинстве растительных материалов, обнаруживаемых в природе, включая сыворотку соевых бобов по настоящему изобретению, большая часть галактозы существует в форме олигосахарида или углевода с глюкозой или фруктозой. Так, раствор сахара, полученный из них гидролизом, также включает смешанный моносахарид, в который включены по меньшей мере три различных сахара.

Обычный побочный продукт, полученный из молока, главным образом состоит из одной лактозы. Поэтому, когда этот продукт гидролизуется, исходно может быть легко получен смешанный моносахарид, включающий глюкозу и галактозу, которые могут быть экономически рентабельно разделены совершенной хроматографией.

Однако раствор сахара, содержащий по меньшей мере три различных сахара, подобный сахару по настоящему изобретению, нелегко разделить хроматографией, если не выполняются селективные условия. То есть трудно получить галактозу или тагатозу экономически рентабельным способом из других сырьевых материалов, кроме лактозы.

В целом разделение сахара хроматографии выполняется путем использования преимущества разности слабой силы связывания между ионами металла, присоединенными к сахару и ионной смоле. В частности, остатками применимых для хроматографии ионов металлов в пищевых продуктах являются K, Na, Ca и Mg.

Глюкоза и галактоза очень похожи по их физическим структурам, составленным из альдозной формы. Фруктоза представляет собой сахар, состоящий из кетозной формы. В целом разделение смешанного сахара, состоящего из альдозной формы и кетозной формы, экономически рентабельно выполняется хроматографией с использованием смолы, имеющей катионные остатки, которая действительно широко используется в способе получения крахмального сахара. Однако для разделения глюкозы и галактозы, которые имеют одинаковую альдозную форму и одинаковую физическую структуру, необходима определенная смола, содержащая K и Na. То есть только галактоза чисто отделяется серийным использованием двух различных хроматографических оборудований. Этот способ показан на фиг.1. При разделении смешанного сахара хроматографией используется большое количество воды, свидетельствуя об увеличении затрат на концентрацию и потребности дорогостоящего оборудования.

Фермент, используемый для гидролиза по настоящему изобретению, представляет собой -галактозидазу, а предпочтительнее, не содержащую инвертазу -галактозидазу.

Указанная -галактозидаза представляет собой один из естественных гликолитических ферментов, которые могут селективно переваривать альфа-1,4 связь между сахарозой и галактозой, составляющими раффинозу и стахиозу. Поэтому ее можно использовать для получения раствора сахара, состоящего из сахарозы и галактозы в качестве основных компонентов из сыворотки соевых бобов или олигосахариды сои.

Однако для получения фермента, который промышленно применим, обычно получают супернатант культивированием микроорганизма, продуцирующего фермент, или его мицелии, который затем далее используется в качестве сырьевого материала для получения фермента. В большинстве случаев, материал включает наиболее репрезентативный гликолитический фермент, инвертазу. В настоящем изобретении селективный гидролиз для сахарозы и галактозы необходим для удобства хроматографии. Поэтому лишенная инвертазы -галактозидаза облегчает хроматографию.

Указанная -галактозидаза получена из штамма, который не имеет внутри ген инвертазы. Предпочтительнее -галактозидаза может быть получена из Mortierella vinaceae (ATCC 20034), вариант, утилизирующий раффинозу, или Absidia griseola (ATCC 20431).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения олигосахарид сои был гидролизован -галактозидазой для получения раствора сахара, содержащего сахарозу и галактозу. Предварительную обработку в виде селективной кристаллизации сахарозы выполняли для получения раствора сахара, имеющего сниженное содержание сахарозы. Олигосахарид сои содержал избыточное количество сахарозы, так что имелись недостатки для хроматографии, вызванные увеличенным объемом раствора сахара, увеличенного масштаба оборудования и увеличенного количества очищенной воды. Таким образом, указанный способ предварительной обработки в виде кристаллизации сахарозы мог снизить возможность использования способа.

В соответствии с настоящим изобретением была предложена новая методика экономически рентабельного получения галактозы или тагатозы путем использования раствора сахара, селективно гидролизованного -галактозидазой. Для превращения полученной в настоящем изобретении галактозы в тагатозу может использоваться изомераза арабинозы.

Предпочтительно может использоваться термофильная изомераза арабинозы, полученная из видов Sulfurobus, Thermotoga или Geobacillus. Предпочтительнее может использоваться термофильная изомераза арабинозы, полученная из Thermotoga neapolitana DSM5068.

В данном изобретении раствор сахара, состоящий из смешанного сахара, включающего сахарозу, галактозу и тагатозу, полученный гидролизом и изомеризацией, отделяется хроматографией. Предпочтительнее используется трехфазное разделение хроматографией.

В целом фазовое равновесие теоретически представлено в обратимой реакции, такой как изомеризация, в условиях способа, и теоретически невозможно превратить каждый субстрат в продукт. Поэтому в способе, подобном способу с переработкой сахара, необходимы эффективное разделение и повторный цикл переработки не вступивших во взаимодействие материалов с использованием хроматографии. Другой ключевой момент этой методики получения состоит в экономически рентабельном исполнении хроматографии.

При разделении хроматографией в качестве смолы для разделения раствора сахара может использоваться смола, содержащая остаток Ca.

При разделении хроматографией специалисты в данной области могут случайным методом выбрать способ повторного цикла переработки не вступивших во взаимодействие материалов с учетом вида раствора сахара.

Раствор сахара, содержащий тагатозу в качестве основного компонента (по меньшей мере 90%) может при необходимости подвергаться кристаллизации после концентрации тагатозы.

Раствор сахара, содержащий галактозу в качестве основного компонента, может селективно подвергаться повторному циклу переработки перед кристаллизацией или изомеризацией с учетом соотношения компонентов композиции раствора сахара.

Раствор сахара, содержащий сахарозу в качестве основного компонента, может подвергаться переработке посредством концентрации или кристаллизации, а затем далее использоваться в качестве раствора сахара или в качестве сырьевого материала для других способов получения.

Практичные и предпочтительные в настоящее время варианты осуществления настоящего изобретения иллюстрируются в следующих примерах. Однако следует понимать, что специалисты в данной области после рассмотрения настоящего описания могут внести модификации и усовершенствования в пределах сущности и объема настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для получения возможных сырьевых материалов для экономически рентабельного получения галактозы или тагатозы с использованием хроматографии анализировали и оценивали сахарные компоненты промышленных побочных продуктов. Затем выполняли селективный гидролиз выбранной сывороткой соевых бобов или олигосахарида сои использованием -галактозидазы для получения гидролизата. И, наконец, заявители разработали новую методику экономически рентабельного получения галактозы или тагатозы из гидролизата. В частности, заявители внедрили непрерывные повторные циклы переработки в описанную выше процедуру получения, дающие усовершенствованную методику экономически рентабельного получения с высоким выходом продукта.

В настоящем изобретении материал, который состоял в основном из углевода и мог быть легко получен из побочных продуктов переработки материала, выбирали в качестве первого сырьевого материала для экономически рентабельного получения тагатозы. И затем проводили тщательный анализ углеводных компонентов, в частности компонентов растворимого сахара (включая моносахарид, дисахарид и олигосахарид), и ингредиентов, содержащихся в материале. На основании этого анализа авторы изобретения подтвердили возможность их использования в качестве композиции, подходящей для хроматографии, после селективного гидролиза с использованием фермента.

На основании результатов указанного выше анализа было подтверждено, что сыворотка соевых бобов, побочный продукт изолированного соевого белка и раствор растворимого сахара или олигосахарид сои, полученный из него, имели превосходную композицию, целесообразную для чистого и экономически рентабельного отделения галактозы или тагатозы. Поэтому, заявители создали настоящее изобретение, разработав способы получения тагатозы с использованием указанного сырьевого материала.

Примеры

Пример 1

Анализ состава сахаров побочного продукта производства

Выпускаемый промышленностью олигосахарид сои приобретали в Китае и использовали в качестве образца. ВЭЖХ выполняли для анализа композиции и содержания углеводов, включенных в полученный олигосахарид сои. Использовали разделительную колонку для сахаров Supelco-PB (SUPELCO) и в качестве подвижной вазы использовали очищенную воду (0,5 мл/мин). Реагент сорта ВЭЖХ (Sigma) использовали в качестве стандартного раствора. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Сахар	Время удерживания (мин)	Состав (высушенная твердая основа, % мас.)
Стахиоза	12,549	51,7
Раффиноза	13,441	21,8
Сахароза	14,384	11,9
Глюкоза	16,919	3,7
Галактоза	19,783	6,3
Фруктоза	23,206	4,6

В углеводном составе олигосахаридов сои доля содержания раффинозы и стахиозы составила 73,5% всех углеводородов, а доля сахарозы и фруктозы составила 26,5%. Фиг.2 иллюстрирует хроматограмму ВЭЖХ данного эксперимента.

Пример 2

Анализ содержания сахара в олигосахариде сои и ферментный гидролиз

Олигосахарид сои примера 1 обрабатывали -галактозидазой для использования в качестве источника галактозы. Фермент, использованный на этот раз, представлял собой валидазу (Validase AGS; Valley Research, US), и концентрация фермента составляла 0,15% (мас./мас.) общего объема субстрата, олигосахарида сои. Гидролиз выполняли при 50°С при перемешивании со скоростью 150 об/мин. Зависимая от времени продукция галактозы гидролизом -галактозидазой и изменения сахарного состава иллюстрируются на фиг.3.

Валидаза расщепляла олигосахарид сои, стахиозу, на раффинозу и галактозу. Полученная раффиноза снова расщеплялась на сахарозу и галактозу. Основным компонентом валидазы была -галактозидаза. Она добавляется в корма, потому что при ее добавлении расщепляется олигосахарид сои, так что она уменьшает диарею, боль в брюшной полости и другие побочные эффекты, вызванные употреблением олигосахарида сои.

Как показано на фиг.3, -галактозидаза в продукте функционировала для селективного гидролиза связи галактозы/галактозы в олигосахариде сои. Однако была также подтверждена активность инвертазы, функционирующей для расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу.

Вся сахароза расщеплялась через 23 часа, но глюкоза и фруктоза постоянно генерировались. Это, вероятно, было связано с тем, что сахароза, продуцируемая расщеплением стахиозы и раффинозы, постоянно расщеплялась инвертазой в валидазе с продукцией глюкозы и фруктозы. После 50-часового гидролиза галактоза, фруктоза и глюкоза больше не генерировались, и состав сахара в это время показан в таблице 3.

Таблица 3 Состав олигосахарида сои, обработанного валидазой
Сахар	Состав (сушеная твердая основа, % мас.)
Стахиоза	0
Раффиноза	3,8
Сахароза	0
Глюкоза	28,4
Галактоза	45
Фруктоза	22,8

Пример 3

Не содержащая инвертазу -галактозидаза

Как описано выше, селективный гидролиз раффинозы или стахиозы на сахарозу и галактозу с использованием фермента, существенен не только для удобства хроматографии, но также и для экономически рентабельного получения тагатозы. Поэтому необходима методика, которая содействует селективному расщеплению -галактозидазой связи альфа-1,4 между сахарозой и галактозой, которые составляют раффинозу или стахиозу.

Однако для получения фермента, который является промышленно применимым, обычно получают супернатант культивированием микроорганизма, продуцирующего фермент, или его мицелии, который затем далее используется в качестве сырьевого материала для получения фермента. Имеющаяся в продаже выпускаемая промышленностью -галактозидаза также получается использованием культурального супернатанта мицелия Aspergillus niger в качестве сырьевого материала, и, таким образом, большая часть получаемого фермента включает инвертазу в их ферментном растворе.

Инвертаза, наиболее репрезентативный гликолитический фермент, который имеет большинство живых существ в естественной системе, способен легко расщепить сахарозу. Таким образом, инвертаза, включенная в ферментный раствор, может быстро гидролизовать сахарозу, содержащуюся в растворе сахара, в глюкозу и фруктозу, что становится основным препятствием эффективному получению тагатозы.

Поэтому заявители исследовали, могут или нет те клетки, которые продуцируют -галактозидазу у многих микроорганизмов или мицелий, обнаруживаемых в природе, также продуцировать инвертазу, и результат показан в таблице 4.

В настоящем изобретении, культивированные мицелии утилизирующего раффинозу варианта Mortierella vinaceae или Absidia griseola, которая не продуцирует инвертазу, но одну -галактозидазу, использовали в качестве гидролазы.

Не содержащая инвертазу -галактозидаза, используемая в настоящем изобретении, происходила из гриба, распределяемого из ATCC (Американской коллекции типовых культур), утилизирующего раффинозу варианта Mortierella vinaceae (ATCC20034) или Absidia griseola (ATCC20431).

Культуральная среда для выбранного штамма состояла из 0,1М фосфатного буфера (pH 6,0), 10 г/л лактозы, 3 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л хлорида калия, 0,5 г/л сульфата магния и небольшого количества сульфата двухвалентного железа. Клетки культивировали при 30°С в течение 3 дней с последующим сбором клеток с использованием системы фильтрации (флаконные и верхние флаконные фильтры CORNING). Собранные клетки помещали в лед с последующим лизисом с использованием гомогенизатора в течение 10 минут. Центрифугирование выполняли при 10000 об/мин в течение 10 минут для получения супернатанта, конечного раствора фермента.

Олигосахарид сои гидролизовали путем использования полученного выше раствора фермента. Реакцию вызывали при 40°С. ВЭЖХ (SUPELCO, колонка ВЭЖХ SUPELCOGEL Pb) выполняли для анализа содержания сахара. В результате было подтверждено, что олигосахарид сои был селективно гидролизован в сахарозу и галактозу не содержащей инвертазу -галактозидазой, что показано на фиг.5 и 6.

Пример 4

Изомеризация галактозы в тагатозу с использованием изомеразы L-арабинозы

Изомеризацию галактозы в тагатозу в настоящем изобретении выполняли с использованием термофильной изомеразы арабинозы, происходящей из гипотермофильной Thermotoga neapolitana DSM 5068, достигнутой экспрессированием изомеразы арабинозы, полученной из гипотермофила Corynebacterium-хозяина.

Ген, кодирующий изомеразу арабинозы, был вставлен в векторы-челноки pCJ-1 и pCJ-7 E. coli-Corynebacterium (патент Кореи № 10-2006-0068505), и, наконец, был получен хозяин Corynebacterium glutamicum KCTC 13032. Штамм, в котором был экспрессирован термоустойчивый фермент, смешивали с 2,0% раствором альгината натрия в концентрации 20% (мас./об) с последующим перемешиванием для получения суспензии. Суспензию по каплям добавляли в 0,1M раствор CaCl₂ путем свободного падения для того, чтобы вызвать реакцию отверждения. Полученный захваченный клеткой отверждающийся шарик альгината использовали для иммобилизации. В раствор сахара, полученный в результате реакции, добавляли 20 мМ буфера Трис-HCl (рН 7,5) для регулирования его рН; этот раствор использовали в качестве раствора субстрата.

Полученную изомеразу арабинозы использовали для изомеризации с целью получения изомеризованного продукта.

Пример 5

Анализ типа хроматографического разделения гидролизованного смешанного моносахарида

Для разработки способа хроматографического разделения галактозы с использованием изомеризованного продукта (смешанного моносахарида), полученного в приведенном выше примере, выполняли анализ типа хроматографического разделения.

Для хроматографического разделения смешанного моносахарида эксперимент выполняли со следующими материалами и оборудованием. Смола для отделения сахара представляла собой FINEX MFG220 Ca⁺⁺ (FINEX). Подвижная фаза представляла собой сверх чистую воду (11 мл/мин при 60°С). Две колонки XK50/100 (Ammersham Bioscience, США) соединяли в ряд. Смолу каждой колонки заполняли 1900 мл. Смешанный сахар, использованный для разделения, получали в виде раствора сахара в концентрации 50 Вх, который каждый раз использовали по 160 мл. Композиция первично смешанного моносахарида представляла собой сахарозу:галактозу (80:20), а композиция вторично смешанного моносахарида представляла собой галактозу:тагатозу (50:50) с последующим анализом типов разделения. В результате было подтверждено, что сахароза, галактоза и тагатоза легко разделялись через одинаковые интервалы, что показано на фиг.7 и 8.

Пример 6

Кристаллизация тагатозы

Кристаллизацию тагатозы выполняли путем использования раствора, извлеченного в результате хроматографического разделения в примере 5. Извлекали фракцию, включающую 90% конечного содержания тагатозы. Эту фракцию концентрировали в кристаллизаторе в условиях вакуума и нагревания для доведения содержания сахара 70 Вх. Затем температуру медленно снижали до 50°С на 2 градуса в час. Затравку тагатозы добавляли при температуре 40°С для выращивания кристаллов.

По мере прогрессирования кристаллизации тагатозы концентрация сахара в супернатанте была сравнительно разбавленной. Для поддержания концентрации разбавленного супернатанта во время кристаллизации постоянно выполняли вакуумную концентрацию. То есть во время кристаллизации и выращивания кристаллов концентрацию реакционного супернатанта поддерживали на уровне, по меньшей мере, 65 Вх.

Кристаллизацию останавливали через 20 часов. Центрифугирование выполняли для разделения супернатанта и кристаллов. Частота извлечения из раствора первичной кристаллизации составила 71%. Полученная тагатоза имела чистоту, по меньшей мере, 90-98%. Тагатозу, отделенную центрифугированием, сушили в вакуумной сушилке при 50°С в течение 1 часа. Генерированный кристалл тагатозы наблюдали под микроскопом, как показано на фиг.9 и 10. Форму и размер генерированного кристалла тагатозы сравнивали с таковыми выпускаемой промышленностью сахарозы.

Пример 7

Разработка способа непрерывной повторной циклической переработки при получении тагатозы из гидролизата сыворотки соевых бобов путем использования методики хроматографического разделения

Был разработан следующий способ получения тагатозы с использованием сыворотки соевых бобов или олигосахарида сои в качестве сырьевого материала, который показан на фиг.11. Стадии, необходимые для улучшения качества конечного продукта, такие как обесцвечивание и обессоливание, отдельно не включены, потому что эти стадии могут быть включены или исключены во время процесса получения с учетом изменений качества продукта.

1) отделение олигосахарида из побочных продуктов сыворотки соевых бобов после предварительной обработки ультрафильтрацией или микрофильтрацией;

2) гидролиз раствора олигосахарида сои (концентрация: 10-50%) при высокой и низкой температуре (когда использовался фермент, происходящий из термофильных бактерий или грибов);

3) разделение гидролизованной сахарозы и галактозы хроматографией.

Стадия концентрации может быть включена или исключена в соответствии с содержанием сахара во время осуществления способа.

4) получение тагатозы пропусканием раствора хроматографического разделения, содержащего галактозу в качестве основного компонента (по меньшей мере 50%), через реактор изомеразы L-арабинозы (или изомеразы L-галактозы);

5) разделение хроматографией изомеризованного продукта, содержащего галактозу, тагатозу и небольшое количество смешанного сахара.

Стадия концентрации может быть включена или исключена в соответствии с содержанием сахара во время осуществления способа.

6) концентрация и кристаллизация (при необходимости) раствора хроматографического разделения, содержащего тагатозу в качестве основного компонента (по меньшей мере 70%);

7) повторный цикл переработки остающегося раствора хроматографического разделения, содержащего галактозу в качестве основного компонента, в изомеризационном реакторе; и

8) повторный цикл переработки некристаллизованного раствора, полученного на стадии кристаллизации тагатозы, с возвратом на стадию перед кристаллизацией или стадию перед изомеризацией с учетом композиции раствора сахара.

Пример 8

Трехфазное разделение смешанного моносахарида

Тест одного прохождения выполняли с сахарами, включенными в весь процесс в виде упаковки. Результат использовали для создания имитации способа получения с непрерывными повторными циклами переработки с использованием методики хроматографического разделения.

Тест одного прохождения выполняли со смешанным сахаром, и основные параметры рассчитывали по результату. Использовали новое имитированное устройство подвижного слоя (Органо, Япония), и тест имитации с профилем концентрации каждого компонента выполняли с использованием компьютера. Затем рассчитывали чистоту каждого компонента и частоту извлечения каждой фракции. Вытекающую жидкость отделяли от каждой фракции. Каждую фракцию анализировали ВЭЖХ. По результату строили кривую элюирования каждого компонента. Исследовали каждый тип элюирования и рассчитывали основные параметры каждого компонента. Условия теста одного прохождения показаны в таблице 5. Способ анализа каждой фракции иллюстрируется в таблице 6. Условия ВЭЖХ показаны в таблице 7.

Таблица 5 Условия теста одного прохождения
Образец	Смешанный образец моносахарида Сахароза: 73,93%, другие - 2: 0,51% Галактоза: 12,62%, другие - 3: 0,39% Тагатоза: 12,56%
Концентрация подаваемого сиропа	Вх. 60%
Абсорбент	Амберлит (амберлит CR-1310; Ca-тип, новая смола)
Размер колонки	20 мм × 1000 мм (314 мл)
Десорбент	H2 O
Наносимый объем	15 мл
Скорость потока	26 мл/мин (низкая скорость 5 м/ч)
Температура	60°С

Таблица 6 Способ анализа
Brix: концентрация (г/100 г)	Рефрактометр: RA-50 (Kyoto Electronics)
Композиция моносахарида	ВЭЖХ: серия VP (Shimadzu Corp.)

Таблица 7 Условия ВЭЖХ
Колонка	TSK-GEL SCX-Ca (колонка 6,0×L150×5)
Десорбент	H2O
Скорость потока	0,8 мл/мин
Наносимый объем	10 мл
Температура	70°С
Устройство измерения концентрации	Другой измеритель индекса преломления

Кривая элюирования, полученная в результате теста одного прохождения, показана на фиг.12.

Основные параметры рассчитывали по кривой элюирования и компьютерную имитацию выполняли для расчета функции разделения. Условия имитации показаны в таблице 8. Для получения оптимального выполнения разделения заявители анализировали композицию сахара во всем растворе при изменении отношения образца раствора сахара к подвижной фазе, воде (десорбент/наносимый объем). Частоту извлечения каждого сахара и его чистоту измеряли по анализу. Результат имитации суммирован в таблице 9. Как показано в таблице 9, случаи № 6, № 7, № 8 и № 9 представляют собой диаграммы баланса массы, полученные по результату имитации. Тагатоза продемонстрировала частоту, по меньшей мере, 90%, как было желательно при каждой имитации. Детальная диаграмма результата имитации случая № 9 показана на фиг.13.

Таблица 8 Условие имитации
Условие	Трехфазное разделение
Концентрация наносимого сиропа	Вх 60
Целевая чистота	Чистота тагатозы: по меньшей мере 90%
Результат	Случай 6	Случай 7	Случай 8	Случай 9

Таблица 9 Резюме результатов имитации
Условие	Случай 6	Случай 7	Случай 8	Случай 9
Скорость потока (низкая/низкая-скорость/ч)	0,0464	0,0469	0,0469	0,0446
Десорбент/наносимый объем	4,93	4,91	5,31	5,13
Чистота тагатозы (%)	95,2	93,6	96,0	97,2
Частота извлечения тагатозы (%)	87,8	91,1	81,7	93,0
Частота галактозы (%)	74,3	76,3	63,7	77,8
Частота извлечения галактозы (%)	88,5	86,0	98,3	92,7

Исполнение, объясненное в этом примере, рассчитывали имитацией на компьютере Organo.

Пример 9

Реакционная устойчивость изомеразы L-арабинозы в смешанном моносахариде

В экономически рентабельном способе получения тагатозы с использованием трехфазной хроматографии, предложенной в этом способе, раствор субстрата главным образом состоит из сахаров, отличных от галактозы, например глюкозы, фруктозы и сахарозы, в отличие от обычной изомеризации из галактозы в тагатозу. Таким образом, важным условием для внедрения методики по настоящему изобретению является то, могут эти другие сахара ингибировать изомеризацию с использованием ферментов или нет. В этом примере заявители пытались раскрыть субстратную специфичность изомеризации галактозы в смешанном растворе моносахарида при использовании изомеразы, выбранной заявителями.

Каждый раствор субстрата получали добавлением сахарозы, глюкозы и фруктозы к раствору галактозы 100 г/л в определенном соотношении. Соотношение между каждыми из сахаров в композиции было следующим: (а) сахароза:глюкоза:галактоза:фруктоза=0:0:1:0; (b) сахароза:глюкоза:галактоза:фруктоза=3:1:1:1; (с) сахароза:глюкоза:галактоза:фруктоза=0:3:1:2. Соотношение между каждыми из сахаров регулировалось как аналогичное соотношению (а) контрольной группы, содержащей только галактозы, (b) группы, в которой была селективно гидролизована связь 1,4 галактозы в олигосахариде и (с) группы, в которой сахара были полностью гидролизованы в моносахариды.

Для изомеризации галактозы осадок в пробирке после центрифугирования осажденного штамма (CJ-1-TNAI, № доступа KCCM10786P), выращенного в экспрессионной среде, добавляли к раствору субстрата в концентрации 10% (мас./об) с последующей реакцией при 70°С в течение 1 часа. После завершения реакции смешанный раствор охлаждали при 4°С в течение 15 минут с последующим центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут для получения супернатанта. Полученный супернатант разбавляли в 5 раз очищенной водой, которую пропускали через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм (Millipore, США) с последующим анализом ВЭЖХ.

Концентрацию сахара в изомеризованном продукте в растворе смешанного моносахарида анализировали ВЭЖХ. Результаты показаны на фиг.14 и 16. Количественное определение концентрации каждого сахара проводили с каждым стандартным раствором, и результаты показаны в таблице 10.

Таблица 10
	Сахароза (г/л)	Глюкоза (г/л)	Галактоза (г/л)	Фруктоза (г/л)	Тагатоза (г/л)
(а) Контрольная группа	0	0	13,4	0	5,9
(b) Условие 1	54,7	21,3	13,5	0	6,0
(с) Условие 2	0	60,4	13,7	37,2	6,0

В результате было подтверждено, что на изомеризацию галактозы в смешанном растворе сахара, включающем большое количество сахарозы, глюкозы и фруктозы, воздействие не оказывалось, и скорость реакции оставалась одинаковой для обеспечения согласованной частоты превращения (достигшей такой же частоты превращения, 30,8%). Поэтому было подтверждено, что глюкоза, фруктоза и сахароза, полученные гидролизом сырьевого материала, происходящего из олигосахарида сои, не препятствовали изомеризации галактозы.

Пример 10

Разработка способа получения тагатозы с непрерывными повторными циклами переработки из гидролизата сыворотки соевых бобов с использованием методики трехфазного разделения

Способ получения тагатозы, разработанный в примере 6, характеризуется двукратной хроматографией, что требует большого количества очищенной воды и концентрации. В данном изобретении для преодоления указанного неудобства заявители разработали новый способ получения, который требует только однократной хроматографии, которая может осуществляться технологически более совершенной хроматографией. Это было доказано и детально проиллюстрировано в приведенном выше примере.

Технология способа получения тагатозы с использованием однократной хроматографии была следующей, что кратко иллюстрируется на фиг.17. Стадии, необходимые для улучшения качества конечного продукта, такие как обесцвечивание и обессоливание, отдельно не включены, потому что эти стадии могут быть включены или исключены во время осуществления способа получения с учетом изменений качества продукта:

1) выделение олигосахарида сои из побочных продуктов сыворотки соевых бобов после предварительной обработки ультрафильтрацией или микрофильтрацией;

2) гидролиз раствора олигосахарида сои (концентрация: 10-50%) при высокой или низкой температуре (если использовался фермент, происходящий из термофильных бактерий или грибов);

3) изомеризация галактозы в тагатозу пропусканием раствора гидролизованного сахара, содержащего сахарозу и галактозу в качестве основного компонента (по меньшей мере 90%), через реактор изомеразы L-арабинозы (или изомеразы L-галактозы);

4) разделение изомеризованного раствора, состоящего из смешанного сахара, содержащего сахарозу, галактозу и тагатозу в качестве основных компонентов (по меньшей мере 90%), трехфазной хроматографией.

Стадия концентрации может быть включена или исключена в соответствии с содержанием сахара во время осуществления способа. Растворы после разделения сахаров, полученные в результате указанной выше хроматографии, представляли собой следующие три раствора:

А. Раствор для хроматографического разделения, содержащий тагатозу в качестве основного компонента (по меньшей мере 90%), который может отправляться на концентрацию (при необходимости) и кристаллизацию.

В. Остающийся после хроматографии раствор, содержащий галактозу в качестве основного компонента, который может отправляться на повторный цикл переработки на стадии перед изомеризацией или стадии перед кристаллизацией с учетом композиции раствора сахара.

С. Остающийся после хроматографии раствор, содержащий сахарозу в качестве основного компонента, который может отправляться на концентрацию и кристаллизацию для дальнейшей переработки в виде раствора сахарозы, или может использоваться в качестве более совершенного сырьевого материала для получения другого продукта.

5) повторный цикл переработки некристаллизованного раствора, полученного на стадии кристаллизации тагатозы, на стадии перед кристаллизацией или стадии перед изомеризацией с учетом композиции раствора сахара.

Пример 11

Разработка способа получения тагатозы с непрерывными повторными циклами переработки из гидролизата сыворотки соевых бобов с использованием предварительной обработки кристаллизацией сахарозы

Путем взятия еще одной стадии из усовершенствованного способа получения тагатозы с использованием объясненной выше однократной хроматографии, заявители планировали снизить применимость способа путем снижения содержания сахарозы в растворе сахара посредством кристаллизации сахарозы.

Олигосахарид сои содержит избыточное количества сахарозы, которое увеличивает объем раствора сахара для хроматографического разделения, увеличивает масштаб оборудования и увеличивает расход очищенной воды.

Таким образом, заявители следующим образом спланировали способ получения тагатозы с использованием однократной хроматографии, который включал кристаллизацию сахарозы в качестве стадии предварительной обработки. Этот способ кратко иллюстрируется на фиг.18. Стадии, необходимые для улучшения качества конечного продукта, такие как обесцвечивание и обессоливание, отдельно не включены, потому что эти стадии могут быть включены или исключены во время осуществления способа получения с учетом изменений качества продукта:

1) выделение олигосахарида сои из побочных продуктов сыворотки соевых бобов после предварительной обработки ультрафильтрацией или микрофильтрацией;

2) гидролиз раствора олигосахарида сои (концентрация: 10-50%) при высокой и низкой температуре (если использовался фермент, происходящий из термофильных бактерий или грибов);

3) получение раствора сахара, содержащего увеличенное количество галактозы, путем кристаллизации сахарозы в гидролизованном растворе олигосахарида;

4) изомеризация галактозы в тагатозу пропусканием гидролизованного раствора сахара, содержащего сахарозу и галактозу в качестве основных компонентов (по меньшей мере 90%), через реактор изомеразы L-арабинозы (или изомеразы L-галактозы);

5) разделение изомеризованного раствора, состоящего из смешанного сахара, включающего сахарозу, галактозу и тагатозу в качестве основных компонентов (по меньшей мере 90%) трехфазной хроматографией.

Стадия концентрации может быть включена или исключена в соответствии с содержанием сахара во время осуществления способа. Растворы после разделения сахаров, полученные в результате указанной выше хроматографии, представляли собой следующие три раствора:

А. Раствор для хроматографического разделения, содержащий тагатозу в качестве основного компонента (по меньшей мере 90%), который может отправляться на концентрацию (при необходимости) и кристаллизацию.

В. Остающийся после хроматографии раствор, содержащий галактозу в качестве основного компонента, который может отправляться на повторный цикл переработки на стадии перед изомеризацией или стадии перед кристаллизацией с учетом композиции раствора сахара.

С. Остающийся после хроматографии раствор, содержащий сахарозу в качестве основного компонента, который может отправляться на концентрацию и кристаллизацию для дальнейшей переработки в виде раствора сахарозы или может использоваться в качестве более совершенного сырьевого материала для получения другого продукта.

5) повторный цикл переработки некристаллизованного раствора, полученного на стадии кристаллизации тагатозы, на стадии перед кристаллизацией или стадии перед изомеризацией с учетом композиции раствора сахара.

Специалистам в данной области будет понятно, что концепции и определенные варианты осуществления, раскрытые в предшествующем описании, могут легко использоваться в качестве основы для модификации или планирования других вариантов осуществления для достижения таких же целей настоящего изобретения. Специалистам в данной области также будет понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не отходят от сущности и объема изобретения, изложенного в прилагаемой формуле изобретения.