производство полипептидов

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к способу получения полипептидов в культуре клеток для крупномасштабного производства и его вариантам. Способ включает обеспечение культуры клеток, содержащей клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий полипептид, экспрессия которого происходит в условиях культуры клеток. Используют среду, содержащую глютамин, и обладающую необходимыми свойствами. Проводят поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени. Осуществляют изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, причем указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из: (i) температуры; (ii) pH; (iii) осмоляльности; (iv) уровня химического активатора и их комбинаций. Проводят поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени, с тем, чтобы в указанной культуре произошло накопление полипептида. Предложенное изобретение позволяет осуществлять крупномасштабное производство полипептидов в культуре клеток. 5 н. и 41 з.п. ф-лы, 76 ил., 27 табл., 17 пр.

Формула изобретения

1. Способ крупномасштабного получения полипептида в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей:

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду, содержащую глютамин, характеризующуюся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше, чем приблизительно 25 мМ, суммарное количество аминокислот на единицу объема больше 70 мМ, и отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству аспарагина составляет от 0 до 2, причем указанное отношение больше 0, и обладающую свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего: (i) отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному общему количеству всех аминокислот составляет от 0 до 0,2, причем указанное отношение больше 0; (ii) отношение суммарного молярного количества неорганических ионов к суммарному количеству всех аминокислот составляет от 0,4 до 1; (iii) совокупное суммарное количество глютамина и аспарагина на единицу объема больше чем 16 мМ; и комбинаций указанных свойств;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20%-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, причем указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из: (i) температуры; (ii) pH; (iii) осмоляльности; (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени, с тем, чтобы в культуре клеток произошло накопление указанного полипептида.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная концентрация глютамина в указанной среде меньше или равна 10 мМ.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная концентрация глютамина в указанной среде меньше или равна 4 мМ.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество глютамина на единицу объема в указанной среде меньше или равно 10 мМ.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество глютамина на единицу объема в указанной среде меньше или равно 4 мМ.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что глютамин обеспечивают только в исходной среде в начале культивирования клеток.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная плотность указанных клеток млекопитающего составляет по меньшей мере 2·10⁵ клеток/мл.

8. Способ, по п.1, отличающийся тем, что исходная плотность указанных клеток млекопитающего составляет по меньшей мере 2·10 ⁶ клеток/мл.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап обеспечения включает обеспечение по меньшей мере 1000 л культуры.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап обеспечения включает обеспечение по меньшей мере 10000 л культуры.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый набор условий включает первый диапазон температур, который составляет приблизительно от 30 до 42°С.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый набор условий включает первую температуру, которая составляет приблизительно 37°С.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный второй набор условий включает второй диапазон температур, который составляет приблизительно от 25 до 41°С.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный второй набор условий включает второй диапазон температур, который составляет приблизительно от 29 до 35°С.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный второй набор условий включает вторую температуру, которая составляет приблизительно 31°С.

16. Способ по п.1, который дополнительно включает следующий за первым указанным этапом изменения по меньшей мере одного из условий культивирования второй этап изменения условий, включающий изменение по меньшей мере одного из условий культивирования, в результате которого получают третий набор условий культивирования, при этом второй этап изменения условий культивирования включает изменение по меньшей мере одного условия культивирования, выбранного из группы, состоящей из (i) температура, (ii) рН, (iii) осмоляльность, (iv) уровень химического активатора и их комбинации.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный третий набор условий включает третий диапазон температур, который составляет приблизительно от 27 до 37°С.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый период времени составляет 1-7 дней.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый период времени составляет примерно 4 дня.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый период времени и указанный второй период времени вместе составляют по меньшей мере 5 дней.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную культуру поддерживают в течение второго периода времени, достаточного для того, чтобы наблюдать снижение уровня лактата после того, как уровень лактата в культуре достиг максимального уровня.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную культуру поддерживают в течение второго периода времени, достаточного для того, чтобы наблюдать снижение уровня аммония после того, как уровень аммония в культуре достиг максимального уровня.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанную культуру клеток добавляют дополнительные компоненты, выбранные из группы, состоящей из: гормонов и/или других факторов роста, некоторых ионов (таких как натрий, хлор, кальций, магний и фосфат-ион), буферных соединений, витаминов, нуклеозидов или нуклеотидов, микроэлементов (неорганических соединений, обычно присутствующих в очень низких конечных концентрациях), аминокислот, липидов, глюкозы или других источников энергии.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанные дополнительные компоненты добавляют в множественные моменты времени.

25. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная среда включает среду, содержащую глютамин, которая обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего:

i) начальная концентрация аминокислот больше чем 70 мМ; ii) начальное отношение молярного количества глютамина к молярному количеству аспарагина меньше чем 2; iii) начальное отношение молярного количества глютамина к количеству всех аминокислот меньше чем 0,2; iv) начальное отношение молярного количества неорганических ионов к количеству всех аминокислот составляет от 0,4 до 1; и v) совокупная концентрация глютамина и аспарагина больше чем 16 мМ; и комбинаций указанных свойств.

26. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанную культуру в ходе получения указанного полипептида не добавляют дополнительных компонентов.

27. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше чем приблизительно 35 мМ.

28. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная среда обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего:

(i) суммарное общее количество гистидина на единицу объема больше чем приблизительно 1,7 мМ;

(ii) суммарное общее количество изолейцина на единицу объема больше чем приблизительно 3,5 мМ;

(iii) суммарное общее количество лейцина на единицу объема больше чем приблизительно 5,5 мМ;

(iv) суммарное общее количество метионина на единицу объема больше чем приблизительно 2,0 мМ;

(v) суммарное общее количество фенилаланина на единицу объема больше чем приблизительно 2,5 мМ;

(vi) суммарное общее количество пролина на единицу объема больше чем приблизительно 2,5 мМ;

(vii) суммарное общее количество триптофана на единицу объема больше чем приблизительно 1,0 мМ;

(viii) суммарное общее количество тирозина на единицу объема больше чем приблизительно 2,0 мМ;

29. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество серина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 10 мМ.

30. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество аспарагина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 8 мМ.

31. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество аспарагина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 12 мМ.

32. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество фосфора на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 5 мМ.

33. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество глютамата на единицу объема в указанной среде меньше чем приблизительно 1 мМ.

34. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество пантотената кальция на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 20 мг/л.

35. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество никотинамида на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 25 мг/л.

36. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество пиридоксина и пиридоксала на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 35 мг/л.

37. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество рибофлавина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 2,0 мг/л.

38. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество тиамина гидрохлорида на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 35 мг/л.

39. Способ крупномасштабного получения полипептида в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей:

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду, содержащую глутамин, характеризующуюся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше чем приблизительно 25 мМ, суммарное количество аминокислот на единицу объема больше 70 мМ и отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству аспарагина составляет от 0 до 2, причем указанное отношение больше 0; и при этом

указанная среда обладает двумя свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего: (i) отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству всех аминокислот составляет от 0 до 0,2, причем указанное отношение больше 0; (ii) отношение суммарного молярного количества неорганических ионов к суммарному количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0,4 до 1; (iii) совокупное суммарное количество глютамина и аспарагина на единицу объема больше чем 16 мМ; и комбинаций указанных свойств;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20%-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, причем указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из: (i) температуры; (ii) pH; (iii) осмоляльности; (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени, с тем, чтобы в культуре произошло накопление указанного полипептида.

40. Способ крупномасштабного получения полипептида в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей:

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду заданного состава, содержащую глютамин, характеризующуюся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше чем приблизительно 25 мМ, начальная концентрация аминокислот больше 70 мМ и отношение молярного количества глютамина к молярному количеству аспарагина составляет от 0 до 2, причем указанное отношение больше 0, и обладающую по меньшей мере двумя свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего: i) отношение молярного количества глютамина к количеству всех аминокислот составляет от 0 до 0,2, причем указанное отношение больше 0; ii) отношение молярного количества неорганических ионов к количеству всех аминокислот составляет от 0,4 до 1; и iii) совокупная концентрация глютамина и аспарагина больше чем 16 мМ;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток в диапазоне приблизительно 20%-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, причем указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из: (i) температуры; (ii) рН; (iii) осмоляльности; (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени, с тем, чтобы в культуре произошло накопление указанного полипептида.

41. Способ крупномасштабного получения полипептида в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей:

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду заданного состава, содержащую глютамин и характеризующуюся тем, что: i) начальная концентрация аминокислот больше чем 70 мМ; ii) отношение молярного количества глютамина к молярному количеству аспарагина составляет от 0 до 2, причем указанное отношение больше 0; iii) отношение молярного количества глютамина к количеству всех аминокислот составляет от 0 до 0,2, причем указанное отношение больше 0,

iv) отношение молярного количества неорганических ионов к количеству всех аминокислот составляет от 0,4 до 1; и v) совокупная концентрация глютамина и аспарагина больше чем 16 мМ;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до достижения плотности жизнеспособных клеток в диапазоне приблизительно 20%-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, причем указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из: (i) температуры; (ii) рН; (iii) осмоляльности; (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени, с тем, чтобы в культуре произошло накопление указанного полипептида.

42. Способ по любому из пп.1-41, отличающийся тем, что полипептид представляет собой антитело против GDF-8.

43. Способ по любому из пп.1-41, отличающийся тем, что полипептид представляет собой антитело против антигена Lewis Y.

44. Способ по пп.1, 39, 40 или 41, отличающийся тем, что полипептид представляет собой антитело против антигена GDF-8.

45. Способ по пп.1, 39, 40 или 41, отличающийся тем, что полипептид представляет собой антитело против антигена Lewis Y.

46. Способ крупномасштабного получения полипептида в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей:

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду, содержащую глицилглютамин, характеризующуюся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше чем приблизительно 25 мМ, суммарное количество аминокислот на единицу объема больше 70 мМ и отношение суммарного молярного количества глицилглютамина к суммарному количеству аспарагина составляет от 0 до 2, причем указанное отношение больше 0, и обладающую свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего: (i) отношение суммарного молярного количества глицилглютамина к суммарному количеству всех аминокислот составляет от 0 до 0,2, причем указанное отношение больше 0; (ii) отношение суммарного молярного количества неорганических ионов к суммарному количеству всех аминокислот составляет от 0,4 до 1; (iii) совокупное суммарное количество глицилглютамина и аспарагина на единицу объема больше чем 16 мМ; и комбинаций указанных свойств;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20%-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, причем указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из: (i) температуры; (ii) рН; (iii) осмоляльности; (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени, с тем, чтобы в культуре произошло накопление указанного полипептида.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.