липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза

Классы МПК:A61K9/127 липосомы
A61K38/02 пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные
A61K38/17 из животных; из человека
C07K14/47 из млекопитающих
A61P37/00 Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации (RU),
Открытое акционерное общество "Фармсинтез" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-11-30
публикация патента:

Группа изобретений относится к области медицины и касается липосом, содержащих олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтической композиции и способа лечения рассеянного склероза. Сущность изобретений включает моноламеллярные липосомы размером 100-200 нм, состоящие из смеси, содержащей 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, и содержащие три олигопептида, последовательность которых соответствует последовательностям фрагментов: 46-62, 124-139 и 147-170 основного белка миелина. В качестве средства для лечения рассеянного склероза предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента моноламмелярные липосомы, а также способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту указанной фармацевтической композиции. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 табл.

Формула изобретения

1. Моноламеллярные липосомы размером от 100 нм до 200 нм, содержащие смесь олигопептидов, аминокислотная последовательность которых соответствует аминокислотным последовательностям фрагментов 46-62, 124-139, 147-170 основного белка миелина:

GGDRGAPKRGSGKDSHH;

GFGYGGRASDYKSAHK;

QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR,

молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь 1 мас.ч. тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас.ч. 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.

2. Фармацевтическая композиция для лечения рассеянного склероза, включающая моноламеллярные липосомы по п.1 в эффективном количестве и подходящие носители и/или растворители.

3. Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.2.

4. Способ лечения по п.3, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят подкожно в дозе от 100 до 200 мг с частотой от одного раза в две недели до 1 раза в два дня.

5. Способ лечения по п.3 или 4, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят длительными курсами, продолжительностью от 12 недель до 6 месяцев.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к применению иммунокорригирующих средств для лечения рассеянного склероза (PC), а именно липосом, содержащих интегрированные (нековалентно конъюгированные) олигопептиды, и их использования в качестве активного компонента в фармацевтических композициях, а также к способу использования этих фармацевтических композиций для лечения рассеянного склероза.

Известны лекарственные средства на основе олигопептидов и смесей олигопептидов. Эти олигопептиды представляют собой по химической структуре (аминокислотной последовательности) фрагменты основного белка миелина человека (ОБМ). Такие олигопептиды обозначаются соответственно порядковому номеру первой и последней аминокислоты, считая от С-конца полной аминокислотной цепочки ОБМ. Например, ОБМ 18-32, то есть ASTMDHARHGFLPR, или, например ОБМ 75-98, то есть AGAPVVHPPLAIVTPAT.

Известно, что часть пролиферирующих Т-клеток у больных рассеянным склерозом направлена против ОБМ [Allegretta et al., Science, 1990, v.247, pp.718-721]. Эти Т-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле ОБМ [Richer I, et al., J. Neuroimmun, 1989, v.23, pp.55-66]. ОБМ, по-видимому, также способен к активации некоторых Т-клеток без вовлечения антиген-презентирующих клеток [Eur. J. Immunol., 1987, v.17, pp.1635-1640].

Возможно, что небольшие олигопептиды-фрагменты ОБМ могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессинга просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности антиген-презентирующих клеток.

Известны и хорошо изучены эпитопы (участки) ОБМ, ответственные за «узнавание» теми или иными специфическими Т-клетками, выделенными из крови больных PC и обеспечивающими иммунологическую «атаку» на ОБМ, а также В-клетками, которые вырабатывают аутоантитела, направленные против ОБМ.

В связи с обнаружением таких эпитопов предпринимались и предпринимаются попытки с помощью коротких синтетических пептидов (олигопептидов), имеющих последовательность, гомологичную такому эпитопу ОБМ, вызвать состояние иммунологической толерантности или заблокировать (связать) аутоантитела против ОМБ.

Признанной моделью рассеянного склероза человека у животных служит экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), представляющий собой демиелинизирующий процесс, опосредованный Т-клетками. Течение ЭАЭ может быть приостановлено путем введением мышам синтетических пептидов, содержащих участки, гомологичные иммунодоминантным эпитопам ОБМ [Gaur, A. et al., Science, 1992, v.258, pp.1491-1494]. Более того, введение высоких доз ОБМ снижало количество аутореактивных Т-клеток и уменьшало клинические и патологические симптомы ЭАЭ у мышей [Gritchfield, J.M. et al., Science, 1994, v.263, pp.1139-1143]. Даже оральное введение МБР модулировало течение ЭАЭ за счет индукции периферической толерантности [Chen, W. et al., Science, 1994, v.265, pp.1237-1240].

Было высказано предположение, что толерантность может быть индуцирована у больных PC с помощью перорального введения миелиновых антигенов [Weiner, H.L. et al., Science, 1993, v.259, pp.1321-1324,]. Комбинация миелиновых антигенов и синтетических пептидов указанных антигенов, введенная пероральным, и/или внутривенным, и/или внутриоболочечным путем, возможно, необходима для модулирования Т-клеток, В-клеток и макрофагов, участвующих в деструкции миелина у больных PC.

Так, например, известны олигопептиды: ОБМ 75-98 (имеющий формулу AGAPVVHPPLAIVTPAT) [Заявка US 2005209156]; ОБМ 83-98 (имеющий формулу ENPVVHFFKNIVTPRT); ОБМ 146-160 (имеющий формулу AQGTLSKIFKLGGRD). Последние два были выбраны как олигопептиды несущие эпитопы, распознаваемы иммунодоминантными Т-клетками [Патент США № 5858980].

Warren K.G. с соавторами [Warren, K.G. et al., Ann. Neurol, 1994, vol.35, pp.280-289] предложил в качестве средства для лечения PC такие олигопептиды «фрагменты» ОБМ, которые нейтрализуют или снижают продукцию антител против ОБМ у пациентов, страдающих PC.

Олигопептид ОБМ 84-102 был испытан в клиническом исследовании фазы I при лечении вторичного прогрессирующего PC. Дальнейшая разработка препарата была прекращена, поскольку не было выявлено влияния препарата на важнейшие показатели клинического течения PC [Goodkin, D.E. et al., Neurology, 2000, vol.54, pp.1414-1420], а именно изменение неврологического дефицита и скорость появления новых очагов демиелинизации в центральной нервной системе (ЦНС).

Также описан способ направленного подавления определенного клона Т-клеток, отвественного за развитие ЭАЭ у животных и несущего интерферон-индуцибельный маркер CXCR3 с помощью ДНК-плазмиды, помещенной в липосомы. [Chen, W. et al. In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 2007 Feb; 28(1):30-40. Epub 2007 Jan 30]. Также известно, что путь введения играет важную роль в осуществлении биологического (лечебного) эффекта олигопептидов - фрагментов ОБМ. Так, ингаляционное, но не пероральное введение энцефалитогенных пептидов - фрагментов ОБМ, несущих Т-клеточные доминантные эпитопы, приводило к уменьшению симптомов индуцированного ЭАЭ у животных [Metzler, В. and Wraith, D.C., Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by inhalation but not oral administration of the encephalitogenic peptide: influence of MHC binding affinity, Int Immunol., 1993 Sep; 5 (9):1159-65].

Хотя известно, что в случае использования липосомальных вакцин иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированные с липосомами, попадают непосредственно в антигенпредставляющие клетки [Gluck, R. (1995) In Vaccine Design: The Submit and Adjuvant Approch (Powell M.F., Newman M.J., eds)., Plenum Press. P.325-345], в случае олигопептидов - фрагментов ОМБ не является очевидным, что их введение в организм в составе тех или иных частиц приведет к появлению или усилению позитивного клинического эффекта.

Описано, что олигопептиды - фрагменты ОБМ (в частности, ОБМ 68-86 и ОБМ 87-99, но не ОБМ 110-128) оказывают синергидный лечебный эффект на течение ЭАЭ, когда вводятся совместно. При этом также использование интраназального пути введения приводило к большему эффекту, чем подкожное введение смеси этих олигопептидов в полном адъюванте Фрейнда [Liu, J.Q. et al., Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats by nasal administration of encephalitogenic MBP peptides: synergistic effects of MBP 68-86 and 87-99. Int Immunol., 1998 Aug; 10(8):1139-48].

Также предпринимались попытки усилить лечебное действие олигопептида - фрагмента ОБМ (а именно ОБМ 113-122) при ЭАЭ путем предварительной липофилизации олигопептида и внедрения в липосомы перед введением. Однако такая «липосомальная» адъюванитизация не приводила к усилению эффекта при подкожном введении [Avrilionis K and Boggs JM., Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35(1-3):201-10].

Нельзя также не упомянуть глатирамера ацетат (ГА), представляющий собой сложную смесь полипептидов, полученных путем полимеризации четырех аминокислот: глутамата, лизина, аланина и тирозина (CAS No. 147245-92-9), который имеет следующую условную структурную формулу: (Glu, Ala, Lys, Туг), ХСН3СООН).

Способность ГА предотвращать ЭАЭ у животных была обнаружена случайно, и хотя к настоящему моменту препарат проявил свою эффективность у десятков тысяч пациентов PC, окончательной и однозначной теории механизма его действия не предложено. Как считается, иммуноспецифические эффекты ГА включают в себя: вытеснение ОБМ из связи с белками основного комплекса гистосовместимости; ингибирующее влияние на Т-клеточные рецепторы миелин-специфичных лимфоцитов; индукция клона ГА-специфичных Т-лимфоцитов 2 типа, подавляющих иммунный ответ в очагах демиелинизации благодаря выбросу противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 и др.

Таким образом, проблема эффективного лечения (или профилактики обострений) рассеянного склероза путем введения в организм пациента тех или иных коротких пептидов - фрагментов ОБМ и их сочетаний с помощью того или иного носителя и/или того или иного пути введения остается до конца нерешенной в клинической практике.

Наиболее близким к настоящему изобретению является фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза, описанные в патенте RU 2198893, выбранные в качестве прототипа.

Однако в известном способе в качестве фрагмента ОМБ используют один пептид ОБМ 82-98: (Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr, то есть DENPVVHFFKNIVTPRT), что является недостаточным для индукции иммунологических реакций в отношении нескольких клональных пулов Т (или В) - лимфоцитов, обладающих активностью против нескольких эпитопов ОБМ.

При этом именно низкая «a priori» постулируемая антигенность этого короткого пептида указывается в качестве его преимущества. Кроме того, применение этого олигопептида у больных рассеянным склерозом в клинике оказалось неэффективным.

Задачей настоящего изобретения является создание средства (фармацевтической композиции), обладающего иммунокорригирующими свойствами, не вызывающего аллергических реакций обладающего высокой активностью как в отношении экспериментальных моделей рассеянного склероза (в частности ЭАЭ), так и в отношении течения рассеянного склероза у больных этим заболеванием.

Поставленная задача решена путем использования в качестве активного компонента средства для лечения рассеянного склероза смеси (1:1:1 по массе) трех олигопептидов - фрагментов ОБМ следующей структуры:

Олигопептиды - фрагменты ОБМ Формула/структура Соответствие положению последовательности аминокислот в ОБМ человека
липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка   миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного   склероза, патент № 2448685
1GGDRGAPKRGSGKDSHH 46-62
2GFGYGGRASDYKSAHK 124-139
3 QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR 147-170

причем указанная смесь заключена в моноламеллярные липосомы размером от 100 до 200 нм следующего состава: 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерол и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина. Как было выявлено в процессе работы над изобретением (исследовали вариации различных размеров и состава липосом), наибольшую способность снижать степень выраженности ЭАЭ у животных проявляла смесь вышеуказанных олигопептидов, в которой их соотношение в смеси составляло 1:1:1 по молярной массе, а состав липидов моноламеллярных липосом был: 1 часть по массе тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерол и 99 частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.

Таким образом, согласно изобретению предложены моноламелллярные липосомы размером от 100 до 200 нм, содержащие смесь олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола - 1 часть и 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина - 99 частей по массе.

Далее согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, включающая активный компонент и подходящие носители и/или растворители, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного компонента моноламеллярные липосомы в эффективном количестве размером от 100 до 200 нм, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь, содержащую 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.

Далее согласно изобретению предложен способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного компонента моноламеллярные липосомы размером от 100 до 200 нм, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.

Не желая связывать изобретение с какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что причина высокой эффективности заявляемых липосом согласно настоящему изобретению заключается в том, что презентация нескольких специфических антигенов - олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR - фрагментов ОБМ в определенной форме (липосомы определенного подобранного состава) иммуноцитам (Т- и В-лимфоцитам, ответственным за аутоиммунное поражение тканей центральной нервной системы), приводит к значительному усилению эффективности лечения рассеянного склероза. Данные олигопептиды, введенные в липосомы определенного состава, попадают в эффекторные клетки иммунной системы непосредственно (преимущественно минуя контакт с антигенпрезентирующими клетками). Это приводит как к возникновению состояния более длительной и полной толерантности (в отношении аутоиммунных Т-клеток), так и к связыванию аутоантител с олигопептидами, внедренными в липидный бислой липосом. Такая конструкция (лиспосомы выбранного состава с включенными в нее вышеуказанными олигопептидами) имитирует мембрану живой клетки, и введение такой конструкции приводит в более полному и длительному связыванию аутоантител против ОБМ с тем или иным аналогом эпитопа ОБМ, находящемся в составе олигопептида. В процессе работы над изобретением были приготовлены и испытаны другие варианты липосом, в частности липосомы, постоенные из смеси яичного лецитина и дипальмитоилфосфатидилхолина; также испытывались и липосомы, содержащие некоторые другие маннозилированные липиды и некоторые другие олигопептиды - фрагменты ОБМ (в частности, DENPWHFFKNIVTPRT). Однако на основании данных об эффективности тех или иных вариантов липосом как активного компонента фармацевтической композиции при лечении ЭАЭ у животных были выбраны заявляемые липосомы, как обеспечивающие наибольшую лечебную эффективность заявляемой фармацевтической композиции.

При клиническом применении наиболее эффективным (как в плане снижения количества активированных в отношении ОБМ Т-лимфоцитов, так и в плане снижения количества аутоантител против ОБМ), неожиданно оказалось введение фармацевтической композиции, содержащей заявленные липосомы от одного до двух раз в день в разовых дозах от 50 до 200 мг.

Лабораторные испытания и клинические примеры подтверждают возможность широкого применения заявляемого изобретения.

Синтез олигопептидов осуществляли на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием стандартной FMOC-стратегии. Строение олигопептидов было подтверждено с помощью MALDI-масс-спектрометрии. Фосфолипиды были закуплены в компании Sigma - Aldrich.

Размеры и ламеллярность липосом определяли с помощью динамического лазерного светорассеяния и электронной микроскопии.

Для выявления Т-лимфоцитов, опосредующих аутоиммунное повреждение ОБМ, мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли центрифугированием на градиенте плотности раствора Фиколл-Пак ("Sigma", США). С помощью камеры Горяева определяли количество МНПК в 1 мл питательной среды RPMI 1640 ("Биолот", г.Санкт-Петербург). Затем в стерильных условиях ламинарного бокса ("Labconco", США) МНПК вносили в лунки 24-луночных плоскодонных планшетов в конечной концентрации 1×106/мл и культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением L-глутамина ("Биолот", г.Санкт-Петербург), эмбриональной телячьей сыворотки ("Биолот", г.Санкт-Петербург) и коктейля антибиотиков ("Sigma", США) в присутствии ОБМ ("Cusabio Biotech", США) или без него. Культивирование клеток проводили при 37°С в CO 2-инкубаторе ("Joan", США). Между 5 и 14 днем суспензию культивируемых клеток переносили в 96-луночные планшеты с 3H-тимидином (0,5 микроКюри). После 18-часовой инкубации клеточную суспензию отмывали, центрифугировали и определяли на жидкостном сцинциляторе (LKB) радиоактивность образцов. Вычисляли индекс стимуляции (ИС), то есть количественную характеристику активности Т-лимфоцитов, опосредующих аутоиммунное повреждение ОБМ, по формуле:

ИС = радиоактивность с ОБМ / радиоактивность без ОБМ.

Уровень МВР-специфических IgG аутоантител в сыворотке пациентов с рассеянным склерозом определяли иммуноферментным методом [A.J.Chamczuk et al., A rapid ELISA-based serum assay for myelin basic protein in multiple sclerosis, Journal of Immunological Methods, Volume 262, Issues 1-2, 1 April 2002, Pages 21-27].

Пример 1. Приготовление липосом, содержащих олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.

45 г смеси фософолипидов, содержащей 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, растворяют в 450 мл хлороформа и помещают в колбу ваккумного испарителя емкостью 1 л. Хлороформ выпаривают под вакуумом для образования липидной пленки на стенках колбы. После окончания выпаривания колба заполняется азотом и в нее медленно добавляется 800 мл воды для инъекций. Затем колбу помещают в ультразвуковую баню на 30 минут для дезинтегрирования липидов в водной среде для получения эмульсии дезинтегрированных липосом.

0,75 г смеси пептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (в молярном соотношении 1:1:1) растворяют в 40 мл воды для инъекций. К этому раствору олигопептидов добавляют эмульсию дезинтегрированных липосом и содержимое колбы перемешивают в течение 30 минут. Получившуюся эмульсию моноламеллярных липосом, размером 100-200 нм, содержащих олигопетиды, разливают по флаконам для лиофилизации и лиофилизируют.

Пример 2. Приготовление липосом, содержащих олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.

45 г смеси фософолипидов, содержащей 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, растворяют в 450 мл хлороформа и помещают в колбу ваккумного испарителя емкостью 1 л. Хлороформ выпаривают под вакуумом для образования липидной пленки на стенках колбы. После окончания выпаривания колбу заполняют азотом и в медленно добавляют в нее 800 мл воды для инъекций. Затем полученную смесь и (эмульсию) переносят в проточный дезинтегратор. Устанавливают давление ударного объема дезинтегратора 150 МПа. За одну загрузку в в проточный дезинтегратор загружают 100 мл смеси, эмульсию получившихся липосом собирают в приемнике дезинтегратора.

0,75 г смеси пептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (в молярном соотношении 1:1:1) растворяют в 40 мл воды для инъекций. К этому раствору олигопептидов добавляют эмульсию дезинтегрированных липосом и содержимое колбы перемешивают в течение 30 минут. Получившуюся эмульсию моноламеллярных липосом, размером 100-200 нм, содержащих олигопетиды, разливают по флаконам для лиофилизации и лиофилизируют.

Пример 3. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента липосомы, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.

К 1000 мг лиофилизированных липосом, приготовленных, как это описано в Примере 1, в стерильных условиях добавляют 100 мл ФБР с последующим легким встряхиванием и в качестве антиокислителя бета-каротин до концентрации 0,01%. Получились моноламеллярные липосомы, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR. Размер липосом составил 100-200 нм. Эмульсия липосом в стерильных условиях в атомосфере азота разливается по 10 мл по флаконам из стекла гидролитического класса I и флаконы укупориваются резиновыми пробками и обжимаются алюминиевыми колпачками.

Пример 4. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента липосомы, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (вариант).

К 1000 мг порошка лиофилизированных липосом, приготовленных, как это описано в Примере 1, в стерильных условиях добавляют в качестве антиокиcлителя 2 мг альфа-токоферола. В стерильных условиях в атомосфере азота смесь в сухом виде рассыпают по 100 мг по флаконам из стекла гидролитического класса I и флаконы укупоривают резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками. Перед применением к содержимому флакона добавляют 1-2 мл воды для инъекций и встряхивают 1-2 мин до образования однородной эмульсии липосом (100-200 нм).

Пример 5. Ингибирующая активность липосом, содержащих олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR в отношении развития и течения экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс линии DA.

Для индукции ЭАЭ крысам линии DA, массой 220-250 г, (возраст 12-14 месяцев) подкожно в переднюю лапку вводили 10 мкг энцефалогенного фрагмента основного белка миелина (ARTTHYGSLPQKSQRSQ), («Anaspec», США), эмульсифицированного в полном адъюванте Фрейнда («Difco», США) (1:10, вес/объем). Крысы взвешивались каждый день и оценивались на наличие неврологических симптомов ЭАЭ. Оценка производилась в соответствии со следующей шкалой: (0) - отсутствие симптомов ЭАЭ; (1) - снижение тонуса хвоста; (2) - снижение рефлекса выпрямления; (3) - парезы; (4) - полный паралич; (5) - агония или смерть. Промежуточные по тяжести симтомы ЭАЭ оценивались, соответственно, путем уменьшения или увеличения балла оценки на 0,5. На 6 день после индукции ЭАЭ животные случайным образом распределялись в различные группы (по 12 животных в группе). Животным соответствующей группы с 6 по 11 дни включительно (после индукции) вводили подкожно: либо заявляемые липосомы, приготовленные, как это описано в Примере 2, разведенные (эмульгированные в фосфатном солевом растворе, рН 7.4) (ФБР), либо препарат позитивного контроля - глатирамера ацетат (ГА) (Копаксон, Teva Pharmaceutical Industries Ltd, Израиль), либо прототип (олигопептид DENPVVHFFKNIVTPRT), либо плацебо (растворитель - забуференный фосфатный солевой раствор (ФБР) (рН 7.4)). Все растворы олигопептидов, глатирамера ацетата и эмульсию заявляемых липосом готовили ех tempore с использованием в качестве растворителя забуференный фосфатный солевой раствор (ФБР) (рН 7.4). Исследуемые растворы или эмульсия заявленных липосом вводились в объеме 0,1 мл/животное ежедневно один раз в день. Разовая доза олигопептида DENPVVHFFKNIVTPRT (прототип), заявленных липосом и глатирамера ацетата составляли 160 мкг на животное.

Результаты эксперимента представлены в Таблице 1:

Таблица 1
Влияние прототипа, заявляемых липосом, плацебо и глатирамерацетата на течение ЭАЭ у крыс линии DA
липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка   миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного   склероза, патент № 2448685 Выраженность неврологических симптомов ЭАЭ в баллах (среднее)
День после индукции ЭАЭЗаявляемые липосомыПрототип Плацебо ГА
-1 0,00 0,000,00 0,00
0 0,00 0,000,00 0,00
1 0,00 0,000,00 0,00
2 0,00 0,000,00 0,00
3 0,00 0,000,00 0,00
4 0,00 0,000,00 0,00
5 0,00 0,000,00 0,00
6 0,00 0,000,00 0,00
7 0,00 0,000,00 0,00
8 0,75 0,580,50 0,50
9 1,25 1,331,50 1,67
10 1,92 2,422,33 2,17
11 1,58 2,332,42 2,25
12 1,50 2,502,34 2,25
13 1,17 2,171,92 2,83
14 1,08 2,002,17 2,75
15 0,50 1,831,92 2,33
16 0,08 1,671,58 2,08
17 0,17 1,331,93 2,17
18 0,08 1,421,83 2,17
19 0,08 1,081,75 1,75
20 0,00 0,831,67 1,67

Как следует из таблицы 1, заявленные липосомы обладают гораздо большей способностью уменьшать выраженность и скорость развития симптомов ЭАЭ у животных, чем прототип и глатирамера ацетат.

Пример 6. Больная СДА, 30 лет. Диагноз: рассеянный склероз, церебро-спинальная форма, с прогрессирующим течением. Терапия кортикостероидными препаратами, интерфероном бета и глатирамера ацетатом не привела к успеху. Неврологический дефицит и когнитивные расстройства нарастали. Уровень антител к ОБМ составил 107 Ед/мл. ИС Т-лимфоцитов составил 6,5. Пациенту с его согласия начали введение заявляемой фармацевтической композиции, приготовленной, как это описано в Примере 3, в дозе 200 мг через день подкожно. Длительность введения составила 6 месяцев. За время лечения наблюдалась частичная регрессия неврологического дефицита. Оценка неврологического дефицита в баллах по шкале EDSS уменьшилась на 1,5 балла. Уровень аутоантител Ig G к ОБМ уменьшился до неопределяемых величин. ИС Т-лимфоцитов составил 2. Таким образом, заявляемая фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза обладают значимой клинической эффективностью при лечении рассеянного склероза.

Пример 7. Больной МКЕ, 36 лет, с диагнозом рассеянный склероз, церебро-спинальная форма, ремитирующее течение, стадия обострения процесса. Длительность заболевания 3 года. Неоднократно лечился кортикостероидными препаратами. Неврологическом статус: горизонтальный нистагм при взгляде вправо, сухожильные рефлексы живые, на ногах S<D. Брюшные рефлексы верхние низкие, средние и нижние отсутствуют. Симптом Бабинского с двух сторон. Клонусы стоп, грубее справа. Парезов конечностей нет, мышечный тонус не изменен. Походка атактическая. В позе Ромберга неустойчив. Атаксия при выполнении пяточно-коленной пробы. Задержка мочеиспускания. Балл по шкале EDSS составлял 6.

Осмотр окулиста: побледнение височных половин дисков зрительных нервов.

При исследовании МНПК пациента у него были выявлена активность Т-лимфоцитов в отношении ОБМ с индексом стимуляции (ИС) 7,45. Уровень аутоантител IgG составил 75 Ед/мл.

С согласия пациента ему были проведены внутривенные инъекции прототипа 1 раз в 2 недели по 500 мг. (Всего 6 инъекций в течение 12 недель.) Через каждые 7 дней после каждой инъекции у пациента отбирались пробы периферической (венозной) крови на предмет изменений активности Т-лимфоцитов в отношении ОБМ и уровня аутоантител. На протяжении 7 недель клиническая картина умеренно ухудшалась. Уровень IgG составил к 4 неделе 112 Ед/мл, а ИС Т-лимфоцитов увеличился вдвое.

После этого в связи с неэффективностью предыдущей терапии пациенту с его согласия назначен заявляемый препарат в дозе 100 мг 1 раз в две недели. (Всего 6 инъекций в течение 12 недель.)

На 3-й неделе после начала терапии с помощью заявляемой фармацевтической композицией наступили признаки ремиссии. Уровень IgG составил к 8 неделе 25 Ед/мл, а ИС Т-лимфоцитов уменьшился втрое по отношению к ИС, измеренному перед началом лечения заявленной фармацевтической композицией. Нормализовалась мочеиспускание и походка. В позе Ромберга устойчив. Пяточно-коленную пробу выполняет четко. Оценка по шкале EDSS 5 баллов.

Таким образом, заявляемая фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза обладают значимой клинической эффективностью.

Класс A61K9/127 липосомы

стабилизатор липосомальных суспензий и способ его получения -  патент 2529179 (27.09.2014)
носитель лекарственного средства, обеспечивающий контрастное усиление при мрт -  патент 2528104 (10.09.2014)
липосомы иринотекана или его солей, способ их получения -  патент 2526114 (20.08.2014)
композиция, содержащая везикулы, и способ ее получения -  патент 2517710 (27.05.2014)
липосомальная композиция и способ ее получения -  патент 2516893 (20.05.2014)
фармацевтическая композиция, содержащая фермент дезоксирибонуклеазу и/или рибонуклеазу и липосомы, для местного применения -  патент 2504361 (20.01.2014)
способ получения магниточувствительного липидного композита -  патент 2502505 (27.12.2013)
способ получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата -  патент 2500813 (10.12.2013)
новые термочувствительные липосомы, содержащие терапевтические агенты -  патент 2497499 (10.11.2013)
липосомальный фармацевтический препарат и способ его изготовления -  патент 2494729 (10.10.2013)

Класс A61K38/02 пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные

клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью -  патент 2524429 (27.07.2014)
способ комплексного воздействия на нервно-рефлекторные механизмы зуда у больных атопическим дерматитом -  патент 2523634 (20.07.2014)
способ эндоскопической биопластики гастродуоденальных язв комплексным биопластическим материалом -  патент 2520599 (27.06.2014)
конъюгаты и малые молекулы, взаимодействующие с рецептором cd16а -  патент 2519546 (10.06.2014)
композиции, включающие антигены neisseria meningitidis из серогрупп в и с, и дополнительный антиген -  патент 2508122 (27.02.2014)
иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты -  патент 2506275 (10.02.2014)
способ получения комплекса биологически активных веществ из печени рыб тресковых пород -  патент 2495672 (20.10.2013)
биологически активный комплекс, обладающий противоаллергическим действием -  патент 2493861 (27.09.2013)
способ получения лекарственного препарата иммуномодулятора для лечения тяжелых форм гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний -  патент 2491944 (10.09.2013)
иммунологические анализы активности ботулинического токсина серотипа а -  патент 2491293 (27.08.2013)

Класс A61K38/17 из животных; из человека

лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
фармацевтическая антиангиогенная композиция для лечения заболеваний глаз -  патент 2526825 (27.08.2014)
питательная композиция для улучшения иммунной системы млекопитающих -  патент 2525429 (10.08.2014)
применение apl пептида для лечения воспалительной болезни кишечника и диабета типа 1 -  патент 2524630 (27.07.2014)
способ лечения монокулярного оптического неврита при рассеянном склерозе -  патент 2523146 (20.07.2014)
вещества и способы лечения рассеянного склероза, опосредованного в клетками -  патент 2522251 (10.07.2014)
применение hsp70 в качестве регулятора ферментативной активности -  патент 2521672 (10.07.2014)
очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран -  патент 2520817 (27.06.2014)
способ (варианты) и средство для модификации пищевого поведения -  патент 2519748 (20.06.2014)
композиции и способы лечения расстройств почки -  патент 2519124 (10.06.2014)

Класс C07K14/47 из млекопитающих

способ получения хлоркальциевого казеина -  патент 2528978 (20.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
антигенные tau-пептиды и их применения -  патент 2518291 (10.06.2014)
применение производных пептида wnt5-a для лечения меланомы и рака желудка -  патент 2517190 (27.05.2014)
мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения -  патент 2515063 (10.05.2014)
композиция для лечения рака предстательной железы (рпж) -  патент 2508125 (27.02.2014)
сшивающие реагенты и их применение -  патент 2503687 (10.01.2014)
плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду escherichia, неактивного предшественника днказы i человека или ее мутеинов, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, предшественник рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина днказы i человека, ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной днказы i человека -  патент 2502803 (27.12.2013)
бис-met-гистоны -  патент 2498997 (20.11.2013)

Класс A61P37/00 Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний

способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
способ лечения больных с онкологическими заболеваниями и/или иммунодепрессиями -  патент 2528877 (20.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
средство для лечения аутоиммунных заболеваний -  патент 2528337 (10.09.2014)
способ получения комплексного иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью -  патент 2527329 (27.08.2014)
2, 5-дизамещенные арилсульфонамидные антагонисты ссr3 -  патент 2527165 (27.08.2014)
фармакодинамические маркеры, индуцированные интерфероном альфа -  патент 2527068 (27.08.2014)
профилактическая вакцина от туберкулеза -  патент 2526910 (27.08.2014)
гипоаллергенная дерматологическая композиция -  патент 2526833 (27.08.2014)
композиция для парентерального введения, способ получения и применение композиции -  патент 2526826 (27.08.2014)
Наверх