Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах

Классы МПК:C12P33/02 дегидрогенизация; дегидроксилирование
C07J1/00 Нормальные стероиды, содержащие атомы углерода, водорода, галогена или кислорода, не замещенные в положении 17 бета атомом углерода, например эстран, андростан
C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
Автор(ы):, , , , , , ,
Патентообладатель(и):Донова Марина Викторовна (RU),
Суходольская Галина Викторовна (RU),
Савинова Татьяна Степановна (RU),
Лукашёв Николай Вадимович (RU),
Суровцев Виктор Васильевич (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2010-09-09
публикация патента:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана. Проводят реакцию 1,2-дегидрирования с помощью клеток микроорганизма, обладающего высокой 3-кетостероид-1-дегидрогеназной активностью, в среде, содержащей от 8 до 40 об.% смешивающегося с водой апротонного растворителя. Изобретение позволяет осуществлять трансформацию микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов при нагрузках субстратов до 100 г/л и обеспечивает 85-98%-ную селективность образования 1,2-дегидрированных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов при высоких скоростях процесса. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно касается получения 1,2-дегидрированных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана микробиологической трансформацией микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов с участием клеток микроорганизмов, обладающих 3-кетостероид-1-дегидрогеназной активностью (3-КСД, ЕС 1.3.99.4), и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической отраслях промышленности.

1,2-Дегидрированные микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероиды ряда андростана не только являются интермедиатами в синтезе физиологически активных соединений стероидной структуры, но и, обладая биологической активностью, применяются в качестве лекарственных препаратов. Так, андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД), будучи прогормоном, способен в результате метаболизма превращаться в организме в высокоактивный анаболик болденон [Milewich L., Bradfield D.J., Сое L.D., Masters B.S., MacDonald P.C. J. Steroid. Biochem., 1981, 14(11), 1115-1125]. В то же время АДД является исходным субстратом в синтезе практически всей группы эстрогеновых и гестагеновых препаратов 19-нор-ряда [Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М.: Наука, 1970]. 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Гидроксиандроста-1,4-диен-3-он и 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-17-метиландроста-1,4-диен-3-он - высокоактивные анаболические препараты (МНН болденон и метандиенон соответственно). 6-Метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион (6-метилен-АДД) и 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-6-метиленандроста-1,4-диен-3-он (6-метилен-дегидро-ТС) - современные инактиваторы ароматазы, эффективные средства для лечения нарушений баланса между костной резорбцией и костным образованием у постменопаузальных и оофор-эктомированных женщин [СА 2463142, 2004]. 6-Метилен-АДД (МНН эксеместан) широко применяется в терапии злокачественных новообразований молочной железы [US 4808616, 1989; Giudici D., Ornati G., Briatico G., Buzzetti F., Lombardi P. and di Salle E. J. Steroid Biochem., 1988, 30(1-6), 391-394], а также может быть использован как препарат для посткоитальной контрацепции [WO 2007000056, 2007]. АДД, андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-дион и его производные (6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -фторандроста-1,4,9(11)-триен-3,17-дион, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метиландроста-1,4,9(11)-диен-3,17-дион, 16микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метиландроста-1,4,9(11)-триен-3,17-дион, 11микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандроста-1,4-диен-3,17-дион и другие) могут быть использованы как интермедиаты в синтезе физиологически активных соединений ряда прегнана (преднизолона, дексаметазона, триамцинолона, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилпреднизолона и др.).

Непосредственными предшественниками различных по структуре, физико-химическим и фармакологическим свойствам 1,2-дегидрированных стероидов являются андрост-4-ен-3,17-дион (АД) [RU 2079258, 1997; US 7259005, 2007; Родина Н.В., Молчанова М.А., Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С. Прикл. Биохим. Микробиол., 2008, 44(1), 56-62] и 9микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион (9-ОН-АД) [US 4035236, 1977; RU 2077590, 1997; Родина Н.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Турова Т.П., Баслеров Р.В., Пантелеева А.Н., Войшвилло Н.Е. Прикл. Биохим. Микробиол., 2009, 45(4), 439-445], получаемые из природных стеринов методом микробиологической трансформации.

Введение в стероидное ядро функционально значимых заместителей осуществляют, как правило, методами химического синтеза. Реакцию 1,2-дегидрирования, усиливающую физиологическую активность целевых стероидных соединений, проводят химическим или микробиологическим способом.

Совокупность известных недостатков химического способа получения 1,2-дегидрированных продуктов хорошо известна. Это использование дорогостоящих реагентов, многоэтапность химических реакций при введении двойной связи в кольцо А стероидного ядра и последующего выделения продукта, жесткие условия проведения реакций (высокая температура, использование токсичных соединений, некоторые из которых проявляют выраженные канцерогенные свойства и представляют реальную угрозу здоровью рабочего персонала), необходимость применения колоночной хроматографии для очистки продукта и, как следствие, его низкий выход. Химическое производство требует решения многих экологических проблем.

Микробиологические способы проведения процесса 1,2-дегидрирования стероидов, включая стероиды андростанового ряда, являются альтернативным вариантом. Использование биокатализаторов позволяет в мягких условиях осуществить в одну технологическую стадию сложные полиферментные процессы с высоким выходом продукта. Высокая селективность ферментативных реакций, относительная дешевизна, экологическая чистота характеризуют процессы конверсии стероидных соединений с участием микроорганизмов.

Андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД) тоже может быть получен микробиологической трансформацией стеринов [Ahmad S., Garg S.K., Johri B.N. Biotechnol. Adv., 1992, 10(1), 1-67; RU 2039824, 1997; RU 2297455, 2007; US 6071714, 2000; US 7259005 В2, 2007]. Однако микробиологический способ получения АДД из фитостеринов с исходной нагрузкой выше 1 г/л требует выполнения определенных условий для эффективного превращения субстрата в продукт (высокая скорость реакции, предотвращение деструкции продукта, селективность реакции), например применения циклодекстринов [RU 2039824, 1997], жидких полимеров и масел [Carvalho F., Marques М.Р., de Carvalho C.C., Cabral J.M., Fernandes P. Bioresour. Technol., 2009, 100(17), 4050-4053; Marques M.Р.С., Carvalho F., de Carvalho С.С.С.R., Cabral J.M.S., Fernandes P. Food Bioprod. Process., 2010, 88(1), 12-20; Stefanov S., Yankov D., Beschkov V. Chem. Biochem. Eng. Q., 2006, 20, 421-427] синтетических полимеров класса N-виниламида [RU 2042687, 1995], адсорбционных смол [DD 291341, 1991] и т.п. Альтернативным методом синтеза АДД является 1,2-дегидрирование АД природными, мутантными и рекомбинантными штаммами микроорганизмов, обладающих 3-КСД [Yamane Т., Nakatani H., Sada E., Omata Т., Tanaka A., Fukui S. Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 2133-2145; US 4684610, 1987; GB 2131811 A, 1984; US 4524134, 1985; US 4749649, 1988; RU 2156302, 2000; US 7416866 В2, 2008]. В отличие от АД, 9-ОН-АД не может быть использован в микробиологическом процессе 1,2-дегидрирования непосредственно из-за спонтанной ароматизации кольца А стероидной молекулы и расщепления кольца В с образованием 9,10-секофенольного производного - 3-гидрокси-9,10-секоандроста-1,3,5(10)-триен-3,17-диона и последующей его деградации до CO2 и воды [Dodson R.M., Muir R.D. J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 4627-4631; Sih C.J., Wang K.C., Gibson D.T. J. Am. Chem. Soc., 1967, 87, 1386-1388]. Поэтому проводят предварительно дегидратацию 9микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксильной группы с образованием микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 9(11)-производного АД химическими методами [US 3065146, 1962; US RE33364, 1990].

В качестве биокатализаторов процесса 1,2-дегидрирования используют культуры с 3-кетостероид-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-дегидрогеназой (ЕС 1.3.99.4) родов: Arthrobacter, Alternaria, Alcaligenes, Calonectria, Ophiobolus, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces, Bacterium, Mycobacterium, Fusarium, Cylindrocarpon, Pseudomonas, Protaminobacter, Septomyxa, Didymella, Rhodococcus и др. [Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York. 1967, p.236-261; Kaufmann G., Schumann G., Wollweber L., Huller E., Atrat. P. J. Basic. Microbiol., 1990, 30(6), 415-423; Fujui Ch., Morii S., Kadode M., Sawamoto S., Iwami M., Itagaki E. J. Biochem., 1999, 126, 662-667]. Наиболее часто для проведения процесса 1,2-дегидрирования стероидных соединений ряда прегнана и андростана используются штаммы вида Arthrobacter simplex.

Биоконверсию проводят, используя культуральную жидкость, природные и мутантные нативные клетки (60-85% влажности) [US 4749649, 1988; Falero A., Llanes N., Perez C., Hung B.R., Aguila В., Forseca M., Herve E. Revista CENIC Ciencias Biologicas., 2004, 35(1), 41-43; Choi K.P., Molnar I., Murooka Y. Appl. Microbiol. Biotechnol, 1995, 43, 1044; US7259005, 2007], высушенные клетки, полученные при обработке ацетоном, высушенные в вакууме или на воздухе при нагревании [US 4749649, 1988; US 4704358, 1987], в условиях лиофилизации, а также используют бесклеточные экстракты, полученные при ультразвуковом разрушении или разрушенные при пропускании замороженных клеток через фильеры под давлением [EP 0350488, 1993]. Для того чтобы исключить дополнительные технологические этапы, предпочтительно использование нативных клеток.

Основной проблемой получения модифицированных по структуре 1,2-дегидрированных производных стероидов ряда андростана микробиологическим способом в водной среде является малая эффективность процесса, обусловленная низкой растворимостью субстратов, ограниченной доступностью субстрата ферментным системам микроорганизмов, низкой скоростью реакции, возможным ингибирующим влиянием субстрата или продукта на активность клеток микроорганизмов, деградацией продукта [Klibanov A.M. Nature, 2001, 409(11), 241-246]. При содержании субстрата в среде, превышающем значение растворимости, основная масса субстрата и продукта находятся в твердой фазе. В этом случае скорость процесса 1,2-дегидрирования лимитируется скоростью растворения частиц субстрата. Кроме этого, происходит и сокристаллизация продукта с субстратом. В образующихся кристаллических структурах субстрат становится недоступным для ферментных систем микроорганизма (Kondo F., Masuo M. J. Gen. Appl. Microbiol., 1961, 7, 113-117). В этом случае содержание остаточного субстрата в техническом целевом продукте может достигать 15-20%, что определяет значительные потери продукта в процессе его очистки от остаточного субстрата.

Известно, что для повышения растворимости стероидных субстратов в водной среде используют микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -, микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> - или микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447075/947.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрины, а также производные микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрина (микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД) - метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ЦД и гидроксипропил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД - в концентрации 1-50 г/л [Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. D.Duchene, Published in France by Editions de Sante. 1991, p.1-625; Wang M., Zhang L, Shen Y., Ma Y., Zheng Y., Luo J. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 2009, 59(1-3), 58-63; Zhang L., Wang M., Shen Y., Ma Y., Luo J. Appl. Biochem. Biotechnol., 2009, 159(3), 642-654]. Растворимость стероидов в различных водных циклодекстриновых растворах может быть увеличена в 2-1200 раз по сравнению с водой [Habon I., Stadler-Szoke A., Szejtli J. Acta Biochim. Biophys. Hung., 1984, 19(1/2), 86]. В частности, известен способ получения 1,2-дегидропроизводных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов путем трансформации микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов с помощью микроорганизма Arthrobacter globiformis 193 в присутствии циклодекстрина, отличающийся тем, что в качестве циклодекстрина используют водорастворимые химически модифицированные производные микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрина [RU 2156302, 2000]. Согласно этому способу применение метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД позволяет осуществлять 1,2-дегидрирование субстрата при нагрузке 20 г/л. При весовом соотношении метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД/субстрат 7/1 полное превращение субстрата завершается за 6 часов. Содержание 1,2-дегидрированного продукта в культуральной жидкости составляет 95%. Однако практическая значимость данного способа 1,2-дегидрирования в значительной степени ограничена использованием больших количеств дорогостоящего метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД. Кроме того, известным способом получают АДД из АД (пример 12) и в нем не описано получение 1,2-дегидрированных производных 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона, тестостерона, 6-метилентестостерона, 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона и андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона.

1,2-Дегидрирование 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона клетками Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 с применением модифицированных производных циклодекстринов описано Дружининой и соавт. [Дружинина А.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Прикл. Биохим. Микробиол., 2008, 44(6), 642-646]. В среде, содержащей метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД (pH 7.2) и 7% метанола, в аэрируемых условиях при 28°С полная конверсия субстрата (20 г/л) при весовом соотношении субстрата к метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД, равном 1:5, протекала за 15 часов. При замене метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД на гидроксипропил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД при той же концентрации размороженных клеток Р. simplex (4.0 г/л в расчете на вес сухой биомассы) время полной конверсии сократилось до 4.5 часов. Учитывая ингибирующее влияние как субстрата, так и 1,2-дегидрированного продукта - метандростенолона - на ферментативную активность бактериальных микроорганизмов, применение производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД, способных образовывать комплексы включения со стероидными субстратами и продуктами, позволило авторам эффективно осуществить 1,2-дегидрирование 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона в высокой концентрации. Однако высокая стоимость модифицированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД при отсутствии в России их производства является основным недостатком данного способа, ограничивающим его промышленное применение.

Наряду с применением циклодекстринов для повышения концентрации и доступности для микроорганизмов стероидных субстратов могут быть использованы синтетические полимеры класса N-виниламидов - поливинилпирролидон (ПВП), поливинилкапролактам (ПВК), поливиниловый спирт (ПВС) и различные сополимеры N-винилкапролактама. Так, известен способ получения дегидроаналогов стероидов, включающий микробиологическую трансформацию соответствующих микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов в присутствии полимерного материала с последующим выделением из реакционной среды целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют гомо- или сополимер N-винилкапролактама с м.м. 10 4-106 Да или сополимеры N-винилкапролактама с виниловым спиртом, винилацетатом или винилметилацетамидом с содержанием оных до 46%, 45% и 15% соответственно [RU 2042687, 1995]. Однако известный способ заявлен в общем виде и изобретение не проиллюстрировано примерами.

Дружининой и соавт. [Дружинина А.В., Андрюшина В.А., Аринбасарова А.Ю., Пашкин И.И., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Биотехнология, 2008, 1, 46-50] описаны результаты сравнительного изучения влияния ПВП, ПВК и ПВС на процесс 1,2-дегидрирования 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона клетками Р. simplex ВКПМ Ас-1632, согласно которым селективность образования метандростенолона из 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона при концентрации субстрата 4 г/л в лучшем варианте (солюбилизация ПВП с м.м. 500 кДа или ПВК с м.м. 900-2000 кДа) за 8 часов трансформации составила всего 70%.

Известен также способ получения метандростенолона, включающий микробиологическую трансформацию 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона (МТС) штаммами микроорганизмов, обладающих 3-КСД активностью, в присутствии полимерного материала и последующее выделение из культуральной жидкости целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют поливинилпирролидон. В качестве микроорганизмов, обладающих 3-КСД активностью, используют Arthrobacter globiformis, Pimelobacter simplex, Rhodococcus erythropolis [RU 2236464, 2002]. Применение ПВП с м.м. 500 кДа позволило проводить 1,2-дегидрирование МТС в концентрации 5-6 г/л. Степень превращения МТС в условиях аэрации и при 28°С, по данным ВЭЖХ, составила 95-96% через 48 часов конверсии для культуры Р. simplex ВКПМ Ас-1632, 95% через 50-52 часа инкубации для культуры А. globiformis 193 и 94-95% через 50-54 часа для Rh. erythropolis ВКПМ Ac-1014.

Малая эффективность процесса, обусловленная использованием субстрата в концентрации, не превышающей 6.0 г/л, является основным недостатком рассматриваемого способа получения метандростенолона. Кроме этого, способ ограничивается использованием только одного субстрата и не рассматриваются другие стероидные соединения ряда андростана.

С целью интенсификации процесса 1,2-дегидрирования используют органические растворители и экзогенные акцепторы электронов [Antonini E., Carrea G. and Cremonesi P. Enzyme Microb. Tech., 1981, 3(4), 291-296; US 4749649, 1988]. Известно, что экзогенные акцепторы электронов - феназинметосульфат (ФМС), менадион (2-метил-1,4-нафтохинон), 1,4-нафтохинон, менадион бисульфит - используют не только для стимулирования процесса 1,2-дегидрирования стероидных соединений, но также и для ингибирования деструктивной активности клеток микроорганизмов и побочных реакций восстановительного характера, протекающих в присутствии восстановленных кофакторов. Образование побочных продуктов, деструкция целевого продукта снижают выход основного продукта.

При использовании несмешивающихся с водой растворителей [Straathof A.J. J. Biotechnol. Prog., 2003, 19, 755-762] трансформацию проводят в двухфазной среде. Микроорганизмы или ферменты обычно локализованы в водной фазе, а органическая фаза концентрирует гидрофобный субстрат и продукт. Таким образом, достигается растворение субстрата, устраняется ингибирование субстратом или продуктом, предотвращается деструкция продукта, а также достигается прямая экстракция продукта из водной фазы [Wang Z. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 75, 1-10].

Так, известен способ получения 1,2-дегидро-3-кетостероида, который заключается в том, что 1,2-насыщенный 3-кетостероид подвергают взаимодействию с A. simplex или Bacterium cyclooxydans в присутствии экзогенного носителя электронов и несмешивающегося с водой растворителя, включая ароматические углеводороды [GB 2131811, 1984]. В качестве субстратов упомянуты андрост-4-ен-3,17-дион (АД), 11микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД, андроста-4,9(11)-диен-3,17-дион и его 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -фтор-, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метил- и 16микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилпроизводные. Однако описан только пример трансформации андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона клетками культуры A. simplex. Согласно этому способу (пример 2) процесс трансформации субстрата с нагрузкой до 8 г/л проводят клетками A. simplex в присутствии менадиона в среде фосфатного буферного раствора (pH 7.5), содержащей до 10% толуола, в течение 4 дней. Продукт андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-дион получают с выходом 100%. Без толуола в тех же условиях выход продукта составил 82,3%.

Также известен аналогичный способ того же автора - способ превращения 1,2-насыщенного стероида в 1,2-дегидростероид, который включает взаимодействие 1,2-насыщенного стероида с A. simplex или В. cyclooxydans в присутствии экзогенного носителя электронов, несмешивающегося с водой ароматического углеводородного растворителя, где концентрация кислорода поддерживается на уровне минимальной концентрации кислорода, необходимой для окисления, или где реакция осуществляется ниже температуры вспышки смеси при условии, что 1,2-насыщенный стероид имеет растворимость в несмешивающемся с водой ароматическом углеводородном растворителе более чем 5 г/л [US 4684610, 1987]. Процесс проводят в двухфазной системе, используя несмешивающиеся с водой органические растворители: бензол, толуол, ксилол в присутствии экзогенных акцепторов электронов, выбранных из группы, содержащей менадион, менадион бисульфит, 1,4-нафтохинон или другие соединения, подобные витамину К. В качестве субстратов упомянуты андрост-4-ен-3,17-дион (АД), андроста-4,9(11)-диен-3,17-дион и его 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -фтор-, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метил- и 16микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилпроизводные. Однако так же, как и в патенте [GB 2131811, 1984], описан только пример трансформации андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона клетками культуры A. simplex (пример 2) в присутствии менадиона. В среде, содержащей от 7,4 до 50 об.% толуола за 4 суток трансформации андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона при весовом соотношении субстрат/клетки, равном 1:1, в фосфатном буферном растворе (pH 7.5) образуется до 100% продукта андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-диона по данным анализа экстрактов.

Основным недостатком известных способов получения 1,2-дегидрированного производного - андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-диона - является низкая концентрация субстрата (до 8 г/л) и отсутствие информации о способе выделения, а также о выходе и качестве выделенного продукта.

Известен способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона, который заключается в контактировании 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона с микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-дегидрирующими энзимами A. simplex в присутствии несмешивающегося с водой органического растворителя и экзогенного акцептора электронов [WO 0104342, 2001]. Согласно этому способу для проведения процесса 1,2-дегидрирования 6-метилен-АД используют целые клетки или бесклеточный экстракт A. simplex ATCC 6946, при этом использование целых клеток предпочтительно. Процесс проводят в двухфазной системе с использованием несмешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы толуол, ксилол, бензол, гептан, метилен хлорид, н-октанол, или смесей этих растворителей, в присутствии химического экзогенного акцептора электронов (4% менадиона по отношению к весу субстрата) и фермента каталазы. Несмотря на то, что авторами заявлено, что субстрат 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион присутствует в среде в концентрации от 10 до 125 г/л (пп.18 и 19 формулы), в примере А, иллюстрирующем способ, концентрация исходного субстрата составляет 55,6 г/л. Так, для проведения процесса 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион (50 г) и менадион (2,0 г) смешивают с толуолом (800 мл). Водную фазу (pH 8.7-8.9), приготовленную как смесь каталазы, дикалийфосфата, клеточного концентрата A. simplex (50 мл) и воды (50 мл), добавляют к интенсивно перемешиваемой смеси в толуоле. Процесс проводят при 30°С, реакционную смесь продувают регулируемой смесью воздуха и азота - воздух (0.1% SCHF) и азот (0.3% SCHF). При необходимости в течение реакции добавляют клетки A. simplex для завершения процесса. Причем количество добавляемого дополнительно клеточного концентрата не указано. После завершения процесса органическую фазу отделяют, водную фазу экстрагируют толуолом. После фильтрации и осветления толуольный раствор концентрируют, к остатку добавляют 2,5-кратное объемное количество октана, кристаллический продукт отфильтровывают. Основным недостатком описанного в WO 0104342 процесса является использование фермента каталазы в количестве 0,03% от веса субстрата, что удорожает технологический процесс и ограничивает его индустриальное применение.

Описан способ 1,2-дегидрирования 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона (10 г/л) клетками А. simplex AS 1.94 в бифазной системе (70% об./об.), состоящей из четыреххлористого углерода, содержащего твин-80 в концентрации 0.5 г/л (30% об./об.), и калий-фосфатного буферного раствора (pH 7.0) [Antonini E., Carrea G., Cremonesi P. Enzyme Microb. Technol., 1981, 3(4), 291-296; Bie S., Du L., Zhang L., Lu F. Proc. Biochem., 2005, 40, 3309-3313; Bie S., Lu F., Du L., Qiu Q., Zhang Y. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 2008, 55, 1-5; US 7259005, 2007]. В качестве акцептора электронов авторы использовали менадион в концентрации 0.2 г/л. В условиях аэрации 95% превращение субстрата в 1,2-дегидрированное производное происходило за 48 часов при 33°С.

Общими недостатками способов 1,2-дегидрирования в двухфазной среде с применением несмешивающихся с водой органических растворителей являются:

- использование больших объемов легковоспламеняющихся органических растворителей на этапе трансформации, что требует специального ферментационного оборудования и соблюдения особых правил противопожарной безопасности; требование применения специального технологического оборудования фактически исключает практическую реализацию этих способов в условиях промышленного производства;

- сложность проведения технологического процесса в условиях необходимого регулирования состава газовой смеси, подаваемой в реакционную среду: необходимость создания и строгого поддержания минимально допустимой концентрации растворенного кислорода в среде, чтобы избежать вспышки паров газовоздушной смеси и в то же время обеспечить оптимальные условия для процесса окисления субстрата;

- использование токсичных органических соединений создает угрозу здоровью специалистов, занятых в производстве. Применяемые ароматические углеводороды (бензол, толуол, ксилол) являются сильнодействующими ядами, влияющими на функцию кроветворения организма. Так, например, толуол вызывает цианоз, гипоксию, поражение центральной нервной системы, а также толуольную токсикоманию, которая имеет и канцерогенное действие. Четыреххлористый углерод (CCL4), несмотря на то что он не горюч и пожаровзрывобезопасен, является ядовитым и относится к потенциально канцерогенным для человека веществам. При вдыхании паров, попадании внутрь через желудочно-кишечный тракт или всасывании через кожные покровы и слизистые оболочки он вызывает повреждения печени и почек и нарушения в работе центральной нервной системы. ПДК его паров в воздухе рабочей зоны составляет 20 мг/м3 ,

- необходимость решения экологических проблем: CCL4, как и ряд других хладонов, разрушает озоновый слой и в 1991 г. был включен в список запрещенных продуктов в соответствии с дополнениями к Монреальскому протоколу (1987 г.), который установил жесткие экономические ограничения на его производство и применение.

В процессах микробиологической трансформации стероидных соединений наряду с использованием органических растворителей, не смешивающихся с водой, используют смешивающиеся с водой органические растворители, такие как диметилсульфоксид, диметилформамид, метанол, этанол, ацетон и т.п. Однако их использовали исключительно в качестве вспомогательного средства, обеспечивающего внесение исходного субстрата и/или акцептора электронов в растворенном виде в среду для трансформации, и концентрация такого растворителя ограничивалась 5 об.% от конечного объема реакционной среды.

Так, известен способ превращения 1,2-насыщенных 3-кетостероидов в 1,2-дегидро-3-кетостероиды, который заключается в том, что 1,2-насыщенные 3-кетостероиды подвергают взаимодействию со средством, имеющим стероид-1,2-дегидрогеназную активность A. simplex или В. cyclooxydans, в присутствии экзогенного носителя электронов и одного или более дополнительного поглотителя токсичного кислорода, выбранного из группы, содержащей каталазу, супероксиддисмутазу или платину [US 4749649, 1988]. При этом 1,2-насыщенный 3-кетостероид является 1,2-насыщенным 3-кетоандростаном, выбранным из группы, включающей АД, андроста-4,9(11)-диен-3,17-дион и его 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -фтор-, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метил- и 16микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилпроизводные; 11микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион и его 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -фтор-, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метил-, 16микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метил-производные, a также 11микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион и андрост-4-ен-3,11,17-трион. Согласно этому способу стероидный субстрат может быть внесен в виде порошка, водной пасты или в виде раствора (или суспензии) в смешивающемся с водой органическом растворителе, таком как ДМФ, ДМСО, этанол, метанол, ацетон, в количестве не более чем 5% от конечного объема среды. Способ проиллюстрирован примером 1, в описании которого, однако, не уточняется, какой из указанных выше видов внесения субстрата использован (нагрузка субстрата андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона 10 г/л). Рассматриваемый способ [US 4749649, 1988] предлагает также использование экзогенного фермента - каталазы. Добавление каталазы в количестве 10 мг/л способствует активному превращению субстрата и позволяет увеличить его нагрузку до 10 г/л (пример 1). За 22 часа в присутствии менадиона (5·10-4 М) и каталазы (10 мг/л) степень превращения субстрата составляет 83%, за 46 часов - 95%. Кроме этого, в присутствии каталазы и менадиона происходит полное подавление деструктивной активности.

В аналогичных условиях осуществляют конверсию андрост-4-ен-3,17-диона (пример 4) с нагрузкой 10 г/л и со степенью превращения субстрата 93% за 24 ч. Способ внесения субстрата также не указан.

Однако удорожание технологии, обусловленное необходимостью добавления в среду поглотителя (фермента каталазы, или супероксиддисмутазы, или платины), устраняющего ингибирующее влияние синглетного кислорода на активность дегидрогеназы, определяет основной недостаток данного способа, который вследствие этого не может быть рекомендован для промышленного использования. Кроме того, известным способом не описано получение 1,2-дегидропроизводных тестостерона, 6-метилентестостерона, 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона и 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона.

Наиболее близкими по сущности к предложенному способу являются методы, описанные в патентах [US 3091575, 1963] и [US 4524134, 1985].

В патенте [US 3091575, 1963] описан метод усовершенствования процесса ферментации, содержащего 1,2-дегидрирующую микробную систему для получения 1,2-дегидростероидов, в котором деструкция микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1,4-3-кетостероидов ингибирована, включающий добавление в качестве ингибитора вещества, выбранного из группы, содержащей хром, молибден и вольфрам, а также соединения, содержащего орто- и пара-хиноидную структуру в окисленной или восстановленной форме, причем такое соединение может быть окисленной или восстановленной формой хинона, феназина, тиазина, оксазина и т.п. Согласно указанному способу трансформацию проводят в среде, содержащей метанол, в присутствии соединения хиноидной структуры, которым является феназина метасульфат, а микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1,4-3-кетостероидом - микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-андростендион (18 п. формулы). Однако пример трансформации АД в АДД растущими клетками N. corallina приведен в среде, содержащей 10-3 М дихромата калия (пример 8). При этом концентрация метанола составляет 2% от объема, и хотя через 24 ч трансформации степень превращения составила 98%, нагрузка субстрата была всего 0,02 г/л. Кроме того, в патенте не рассматриваются такие субстраты, как тестостерон, 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерон, 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион, 6-метилентестостерон и андроста-4,9(11)-диен-3,17-дион.

В патенте [US 4524134, 1985] описан способ получения 1,2-дегидро-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероида, который заключается в том, что соответствующий 1,2-насыщенный микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероид подвергают взаимодействию с высушенными на воздухе или в тепле клетками A. simplex, содержащими от 1 до 10% влаги, где клетки высушены в отсутствие органического растворителя. Согласно способу (пример 2b) суспензию микронизированного андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона в ДМФ вносят в фосфатный буферный раствор (pH 7.5), содержащий суспензию высушенных клеток A simplex ATCC 6946 (10 г/л) и менадион (86 мг/л). При этом концентрация ДМФ в среде составляет 2 об.%, а нагрузка субстрата - от 2.5 г/л (пример 2b) до 10 г/л (пример 4). Трансформацию проводят в течение 24 ч при температуре 31°С. В качестве субстратов для 1,2-дегидрирования в условиях примера 2b упомянуты АД и 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -фтор-, 6микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метил- и 16микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилпроизводные андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона. Однако описания примеров использования этих субстратов в патенте [US 4524134, 1985] отсутствуют. Кроме того, в указанном патенте не рассматриваются такие субстраты, как тестостерон, 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерон, 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион, 6-метилентестостерон.

Относительно низкая концентрация субстрата, не превышающая 10 г/л в случае андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона (пример 2b) и его производных, характеризует данный способ получения 1,2-дегидропроизводных как малоэффективный.

Таким образом, применение смешивающихся с водой органических растворителей в низкой концентрации - 2 об.% - не позволяет значительно увеличить растворимость субстрата в водной среде и его доступность к клеткам микроорганизма и не позволяет повысить эффективность процесса. Интенсификации процесса с применением смешивающихся с водой органических растворителей в концентрации более 5 об.% можно достичь, применив дополнительно модифицированные полисахариды. О возможности применения метанола в концентрации до 7 об.% упоминалось ранее в процессе 1,2-дегидрирования 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона с нагрузкой до 20 г/л в среде, содержащей метил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД или гидроксипропил-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД в концентрации до 100 г/л [Дружинина А.В., Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Прикл. Биохим. Микробиол., 2008, 44(6), 642-646].

Технической задачей заявляемого изобретения является повышение эффективности, технологичности и безопасности проведения 1,2-дегидрирования и создание эффективного микробиологического способа получения 1,2-дегидрированных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана, лишенного указанных недостатков.

Техническая задача решается способом получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана общей формулы (I)

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="43" WI="67">

где R1=R2=Н или вместе СН2-группа; R3=R4=Н или вместе двойная связь; R5=ОН и R6=Н или СН 3-группа; R5 и R6 вместе кетогруппа,

микробиологической трансформацией микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов общей формулы (II)

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154-2.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="43" WI="70">

где R1=R2=Н или вместе СН2-группа; R3=R4=Н или вместе двойная связь; R5=ОН и R6=Н или СН 3-группа; R5 и R6 вместе кетогруппа,

в водной среде, содержащей экзогенный акцептор электронов, с применением клеток микроорганизма, обладающего 3-кетостероид-1-дегидрогеназной активностью, с использованием концентраций исходного субстрата от 5 до 100 г/л и выделением целевого продукта из культуральной жидкости, отличающимся тем, что в качестве компонента среды используют смешивающийся с водой апротонный органический растворитель в концентрации более 5 об.%, конкретно от 8 до 40 об.%. Применение больших концентраций смешивающегося с водой органического растворителя в среде для проведения процесса 1,2-дегидрирования стероидного субстрата не является очевидным и ранее большие концентрации смешивающегося с водой органического растворителя в подобных процессах не использовались.

Таким образом, сущность заявленного изобретения заключается в том, что введение 1,2-двойной связи в кольцо А стероидного ядра микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана осуществляют микробиологической реакцией 1,2-дегидрирования в водной среде, содержащей от 8 до 40 об.% апротонного растворителя, смешивающегося с водой, и экзогенный акцептор электронов, с участием клеток микроорганизмов, обладающих 3-кетостероид-1 -дегидрогеназной активностью.

Кроме того, проведение 1,2-дегидрирования с целью получения 1,2-дегидропроизводных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана осуществляют с использованием клеток бактерий Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д.

Кроме того, в качестве апротонного органического растворителя при проведении 1,2-дегидрирования используют диметилформамид или диметилсульфоксид, предпочтительно диметилсульфоксид. При этом концентрация ДМФ в водной среде составляет не менее 8% об., а концентрация ДМСО в водной среде может достигать 40%.

Кроме того, концентрация исходного субстрата при проведении 1,2-дегидрирования составляет от 5 до 100 г/л.

Технический результат заявляемого способа микробиологического 1,2-дегидрирования микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана состоит в следующем:

- процесс проводится при высокой нагрузке субстрата (до 100 г/л) в мягких условиях;

- в процессе не используются легко воспламеняющиеся и токсичные органические растворители;

- способ экологически безопасен, так как в качестве предпочтительного смешивающегося с водой растворителя предлагается ДМСО - высококипящая жидкость с низким уровнем токсичности и температурой вспышки 89°С (в закрытом сосуде), применяемая в медицине в виде водных растворов с концентрацией от 10 до 90% в качестве лекарственного препарата противовоспалительного и обезболивающего действия (торговое название «Димексид») для наружного применения;

- способ исключает применение любых циклических олигомеров глюкозы, например микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрина и его модифицированных производных, а также каких-либо синтетических полимерных материалов, включая полимеры класса N-виниламида;

- способ исключает применение фермента каталазы и каких-либо других поглотителей синглетного кислорода;

- способ может быть реализован на стандартном технологическом оборудовании;

- селективность образования 1,2-дегидрированных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов на стадии микробиологического 1,2-дегидрирования составляет 85-98%.

Ниже приводится в качестве примера подробное описание сущности изобретения.

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-Кетостероид ряда андростана общей формулы (II)

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154-2.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="43" WI="70">

где R1=R2=Н или вместе СН2-группа; R3=R4=Н или вместе двойная связь; R5=ОН и R6=Н или СН 3-группа; R5 и R6 вместе кетогруппа,

превращают в микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1,4-3-кетостероид ряда андростана общей формулы (I)

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="43" WI="67">

где R1=R2=Н или вместе СН2-группа; R3=R4=Н или вместе двойная связь; R5=ОН и R6=Н или СН 3-группа; R5 и R6 вместе кетогруппа,

введением 1,2-двойной связи методом микробиологического дегидрирования с участием клеток микроорганизмов, обладающих 3-кетостероид-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-дегидрогеназной активностью (предпочтительно клеток бактерий N. simplex ВКМ Ас-2033Д), при этом нагрузка исходного субстрата составляет от 5 до 100 г/л, а продолжительность ферментации - от 24 до 52 часов и процесс проводят в водной среде, содержащей экзогенный акцептор электронов и смешивающийся с водой апротонный растворитель - ДМФ или ДМСО (предпочтительно ДМСО).

Использование ДМФ или ДМСО в процессе 1,2-дегидрирования обеспечивает перевод стероидного субстрата либо большей его части в растворимую форму, доступную для ферментных систем клеток микроорганизмов, и проведение процесса при высоких (до 100 г/л) нагрузках субстрата в значительной степени снижает эффект сокристаллизации субстрата и продукта и образования смешанных кристаллов. В литературных источниках отсутствует информация об использовании высоких концентраций (более 5 об.%, конкретно от 8 до 40 об.%) смешивающихся с водой органических растворителей в процессах микробиологического 1,2-дегидрирования стероидных субстратов.

Анализ продуктов микробиологической трансформации проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и ВЭЖХ. Определение содержания продуктов методом ВЭЖХ проводят на хроматографе Agilent 1100/1200 (Agilent, Germany) с предколонкой Symmetry С18, 5 мкм, 3,9×20 мм и колонкой Symmetry С18, 5 мкм, 4,6×250 мм (Waters, Ireland); в системе с подвижной фазой (v/v): 60% ацетонитрил, 10% изопропанол, 0,01% уксусная кислота и вода до 100%, при скорости потока 1 мл/мин, температуре 50°С и детекции по поглощению при 250 нм; типичные времена удержания:

Стероидное соединение Время удержания, мин
6-Метиленандрост-4-ен-3,17-дион(6-метилен-АД) 4.9
6-Метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион(эксеместан, 6-метилен-АДД) 4.3
Андрост-4-ен-3,17-дион(АД) 8.63
Андроста-1,4-диен-3,17-дион(АДД) 6.59
17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандрост-4-ен-3-он(тестостерон) 7.06
17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандроста-1,4-диен-3-он(болденон) 5.54
Андроста-4,9(11)-диен-3,17-дион 8.3
Андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-дион 6.4
6-Метилен-17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандрост-4-ен-3-он(6-метилентестостерон) 4.54
17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Гидрокси-17-метиландрост-4-ен-3-он(17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерон) 4.42
17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Гидрокси-17-метиландроста-1,4-диен-3-он(метандростенолон) 3.81

Выделение 1,2-дегидрированных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов из культуральной жидкости может быть осуществлено экстракцией несмешивающимся с водой растворителем или экстракцией стероида из пасты биомассы любым подходящим растворителем после ее предварительного отделения от водной фазы. Для извлечения стероида может быть также применен, например, сорбционный способ извлечения, а также любой другой эффективный метод.

Заявленная группа изобретений иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими ее.

Микробиологическое 1,2-дегидрирование при осуществлении изобретения - способа получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах - может быть осуществлено покоящимися (отмытыми) клетками бактерий рода Nocardioides, конкретно Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д.

В качестве компонента среды при осуществлении изобретения - способа получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах - могут быть использованы смешивающиеся с водой органические апротонные растворители, например ДМФ или ДМСО, предпочтительно ДМСО.

Стероидные субстраты и акцепторы электронов при осуществлении изобретения - способа получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана - могут быть внесены в виде порошка, водной пасты, или в виде раствора (или суспензии) в смешивающемся с водой органическом растворителе, таком как ДМФ, ДМСО, этанол, метанол, ацетон и др.

Пробу культуральной жидкости при осуществлении изобретения - способа получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана - в процессе и по окончании процесса трансформации экстрагируют этилацетатом.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами. Основные параметры процессов приведены в таблице 1.

Примеры

В работе используют штамм Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д, который поддерживают на агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза-10, соевый пептон-4, дрожжевой экстракт-4, MgSO4-0.5, KН2РO4-2, K2НРO 4-4, агар-20, вода дистиллированная, рН 7.0-7.2. Выращивание проводят в течение 3-4 суток при 30°С.

Выращивание 1-го инокулята

Смыв культуры с поверхности агаризованной среды в 5 мл физиологического раствора вносят в 750 мл колбы Эрленмейера со 100 мл среды (г/л): глюкоза-15, соевый пептон-6, дрожжевой экстракт-6, MgSO4-0.5, KН2РO 4-2, K2НРO4-4, и культивируют при 28-30°С в течение 24-26 часов.

Выращивание трансформирующей культуры

5 мл культуральной жидкости на 24-26 часов роста 1-го инокулята вносят в 100 мл среды того же состава и проводят выращивание в аналогичных условиях в течение 10-12 часов, затем вносят индуктор синтеза стероид-1-дегидрогеназы - ацетат кортизона - в виде этанольного раствора (20 мг в 1 мл этанола). Индукцию синтеза 1,2-дегидрогеназы проводят в течение последующих 20-24 часов. Клетки микроорганизмов осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин и используют для проведения процесса 1,2-дегидрирования или хранят при -18°С в течение месяца до использования.

Пример 1. Получение андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-диона

2.5 г Андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона (в пересчете на 100% содержание основного вещества) трансформируют в колбах объемом 750 мл в среде, содержащей 15 мл 0.02М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 10 мл ДМСО, 0.1 г менадиона и 4.0 г биомассы (вес сухой биомассы). Биоконверсию проводят в аэрируемых условиях при 30°С на роторной качалке при 200 об/мин. Процесс останавливают на 24-30 часов культивирования при достижении содержания андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-диона 94-95%.

Пример 2. Получение андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД)

1.25 г Андрост-4-ен-3,17-диона (АД) трансформируют в колбах объемом 750 мл, содержащих 15 мл 0.02М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 10 мл ДМСО, 0.05 г менадиона и 2.0 г биомассы (вес сухой биомассы). Биоконверсию проводят в аэрируемых условиях при 25°С на роторной качалке при 200 об/мин. Процесс останавливают на 22 часа культивирования при достижении содержания АДД 96%.

Пример 3. Получение 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандроста-1,4-диен-3-она (болденона)

0.5 г Тестостерона трансформируют в колбах объемом 750 мл, содержащих 20 мл 0.02М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 5 мл ДМСО, 0.02 г менадиона и 0.8 г биомассы (вес сухой биомассы). Биоконверсию проводят в аэрируемых условиях при 25°С на роторной качалке при 200 об/мин. Процесс останавливают на 48 часов культивирования при достижении содержания 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксиандроста-1,4-диен-3-она 85-87%.

Пример 4. Получение 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-17-метиландроста-1,4-диен-3-она (метандростенолона)

0.25 г 17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Гидрокси-17-метиландрост-4-ен-3-она(17микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -метилтестостерона) трансформируют в колбах объемом 750 мл, содержащих 22 мл 0.02М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 3 мл ДМСО, 0.02 г феназинметосульфата (ФМС) и 0.4 г биомассы (вес сухой биомассы). Биоконверсию проводят в аэрируемых условиях при 30°С на роторной качалке при 200 об/мин. Процесс останавливают на 42-48 часов культивирования при достижении содержания метандростенолона 92-95%.

Пример 5. Получение 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион (эксеместана, 6-метилен-АДД)

Вариант 1

0.125 г 6-Метиленандрост-4-ен-3,17-диона(6-метилен-АД) трансформируют в колбах объемом 250 мл, содержащих 23 мл 0.02 М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 2 мл ДМСО. 0.005 г менадиона и 0.2 г биомассы (вес сухой биомассы). Биоконверсию проводят в аэрируемых условиях при 30°С на роторной качалке при 200 об/мин. Процесс останавливают на 48 часов культивирования при достижении содержания 6-метилен-АДД 94-96%.

Вариант 2

Способ осуществляют по варианту 1, но реакционная среда представлена 0.02 М Na-фосфатным буферным раствором, pH 8.0 (23 мл) и ДМФ (2 мл).

Вариант 3

Способ осуществляют по варианту 1, но реакционная среда содержит 2,5 г 6-метилен-АД, 15 мл 0.02 М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 10 мл ДМСО, 0.1 г менадиона и 0.5 г биомассы (вес сухой биомассы). Процесс останавливают на 52 часа культивирования при достижении содержания 6-метилен-АДД 95-97%.

Вариант 4

0,2 г 6-Метилентестостерона трансформируют в колбах объемом 750 мл, содержащих 18 мл 0.02 М Na-фосфатного буферного раствора (pH 8,0), 2 мл ДМСО, 0.008 г менадиона и 40 г биомассы (вес сухой биомассы). Биоконверсию проводят в аэрируемых условиях при 30°С на роторной качалке при 200 об/мин. Процесс останавливают на 120 часов культивирования при достижении содержания 6-метилен-АДД 97-98%.

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154-3-s.gif" BORDER="0">

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения 1,2-дегидрированных производных микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов ряда андростана общей формулы (I)

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="43" WI="67">

где R1=R2=H или вместе СН 2-группа; R3=R4=H или вместе двойная связь; R5=OH и R6=H или СН3-группа; R5 и R6 вместе кетогруппа,

микробиологической трансформацией микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов общей формулы (II)

микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447154/2447154-2.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="43" WI="70">

где R1=R2=H или вместе СН 2-группа; R3=R4=H или вместе двойная связь; R5=OH и R6=H или СН3-группа; R5 и R6 вместе кетогруппа, в водной среде, содержащей экзогенный акцептор электронов, с применением клеток микроорганизма, обладающего 3-кетостероид-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-дегидрогеназной активностью, с использованием концентраций исходного субстрата от 5 до 100 г/л и выделением целевого продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве компонента среды используют смешивающийся с водой апротонный органический растворитель в концентрации более 5 об.%, конкретно от 8 до 40 об.%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма с 3-кетостероид-микробиологический способ получения 1,2-дегидрированных производных   <img src= 4-3-кетостероидов ряда андростана в водно-органических средах, патент № 2447154" SRC="/images/patents/11/2447012/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-дегидрогеназной активностью используют Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве экзогенного акцептора электронов используют менадион или ФМС в эффективном количестве.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве апротонного смешивающегося с водой органического растворителя используют диметилформамид или диметилсульфоксид, предпочтительно диметилсульфоксид.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2447154

patent-2447154.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12P33/02 дегидрогенизация; дегидроксилирование

Класс C07J1/00 Нормальные стероиды, содержащие атомы углерода, водорода, галогена или кислорода, не замещенные в положении 17 бета атомом углерода, например эстран, андростан

Патенты РФ в классе C07J1/00:
способ получения андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона из фитостерина -  патент 2512076 (10.04.2014)
стероидные лиганды и их применение для модуляции переключения генов -  патент 2487134 (10.07.2013)
способ получения 17-(3-гидроксипропил)-17-гидроксистероидов -  патент 2466137 (10.11.2012)
новые стероидные соединения, обладающие повышенной растворимостью в воде и устойчивостью к метаболизму, и способы их приготовления -  патент 2458065 (10.08.2012)
диацетат 13-этилгона-1,3,5( 10), 8( 9)-тетраен-3,17бета-диола, обладающий антиимплантационной и антиоксидантной активностью -  патент 2454424 (27.06.2012)
способ получения 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона из андрост-4-ен-3,17-диона, способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона (эксеместана) с использованием полученного 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона -  патент 2425052 (27.07.2011)
3-метокси-2-фтор-18-этил-8 -гона-1,3,5( 10 )-триены, обладающие остеопротекторной и гипохолестеринемической активностью -  патент 2418000 (10.05.2011)
иммуномодуляторные стероиды -  патент 2417792 (10.05.2011)
средство, стимулирующее клеточный иммунитет млекопитающих -  патент 2415863 (10.04.2011)
способ 11 бета-гидроксилирования дельта4-3-кетостероидов -  патент 2399674 (20.09.2010)

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/20:
способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Наверх