антагонисты vri ванилоидного рецептора на основе ионона

Формула изобретения

1. Соединение формулы (I)



где Y представляет собой группу формулы



в которой

R' выбирают из атомов водорода, (C₁-C₆)алкокси или фенокси, ароматический цикл которого необязательно замещен одним или более атомом галогена;

R' представляет собой атом водорода;

n представляет собой 0;

X представляет собой изохинолинил.

2. Соединение по п.1, где X представляет собой 5-изохинолинил.

3. Соединения по п.1 или 2 для применения в качестве лекарственного средства, обладающего свойствами антагониста ванилоидного рецептора типа 1.

4. Фармацевтическая композиция, обладающая свойствами антагониста ванилоидного рецептора типа 1, включающая соединение по любому из пп.1-4 в сочетании с одним или более носителем и/или эксципиентом.

5. Применение соединений по п.1 или 2 для приготовления анальгезирующих и/или противовоспалительных лекарственных средств.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антагонистам ванилоидного рецептора, именно к антагонистам TRPV1.

Уровень техники

Ванилоидный рецептор типа 1 (TRPV1 Transient Receptor Potential Vanilloid 1) играет основную роль в развитии поствоспалительной гипералгезии; таким образом, лиганды TRPV1 могут быть клинически пригодным в качестве анальгезирующих и противовоспалительных лекарственных средств.

Известно, что соединения, полученные из природных продуктов и называемые капсаициноидами и резинифероноидами, являются лигандами TRPV1. Среди них ретванил, ваниламид ретиноевой кислоты, является потенциальным агонистом [1].

Ber. der Deutschen Chem. Gesellschaft, vol. 70, pp. 1009-1012 раскрывает синтез следующих соединений:

но не упоминает о их биологических свойствах.

WO 03/024920 отмечает использование ретиноидов для лечения артритов и воспалительных дерматологических заболеваний.

Chem. Pharm. Bull. 43(1) 100-107 (1995) раскрывает, в частности, следующие соединения:

где R представляет собой атом водорода и R' представляет собой атом водорода или метил и их ретиноидную активность.

WO 03/049702, JOC vol. 48, no. 1, 2005, pp. 71-90 и Neuropharmacology, vol. 46, no. 1, 2004, pp. 133-149 раскрывает N-ариламиды коричной кислоты, содержащие группу, которая может быть представлена следующим образом:

где А представляет замещенный арил. Эти соединения являются антагонистами ванилоидного рецептора и могут быть использованы для лечения ряда воспалительных состояний.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к ингибиторам TRPV1 формулы (I)

где:

Y представляет собой группу формулы:

в которой:

R' выбирают из атомов водорода, галогена, гидрокси, (С₁-С ₆)алкила, (С₂-С₆)алкенила, (С ₃-С₆)алкинила, (С₁-С₆)алкокси, (С₁-С₆)алкиламино, фенила, нафтила, фенокси, нафтокси или фениламино, ароматические циклы которых необязательно замещены одним или более атомом галогена, гидрокси, (С₁ -С₄)алкильной, (С₁-С₄)алкокси и трифторметильной группами;

R представляет собой метил или атом водорода;

n представляет собой 0 или 1;

X выбирают из фенила, пиридинила, нафтила, хинолинила и изохинолинила, необязательно замещенных одним или более группами, выбранными из атома галогена, гидрокси, (С ₁-С₄)алкила, (С₁-С₄)алкокси и трифторметила;

за исключением следующих соединений:

Согласно первому предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к соединениям формулы (I), где n представляет собой 0 и X представляет собой 5-изохинолинил. Среди них особенно предпочтительными являются соединения, где R представляет собой атом водорода и Y представляет собой группу формулы:

где R' имеет вышеуказанные значения, более предпочтительно означает атом водорода, метокси или фенокси, необязательно замещенный, как указано выше.

Примеры соединений формулы (I) представляют собой следующие:

(2Е)-N-(4-хлорфенил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(4-хлорбензил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(4-хлорфенил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-2-енил)акриламид;

(2Е)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(нафталин-1-ил)акриламид;

(2Е)-N-(4-хлорфенил)-3-(2,6,6-триметил-3-феноксициклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(3-метоксифенил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(5-хлорпиридин-2-ил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(4-хлорфенил)-3-(2,6,6-триметилциклогекса-1,3-диенил)акриламид;

(2Е)-N-(4-(трифторметил)фенил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(хинолин-3-ил)акриламид;

(2Е)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(хинолин-5-ил)акриламид;

(2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(3-метокси-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(2,6,6-триметил-3-феноксициклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(3-(3-метоксифенил)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид;

(2Е)-3-(3-(4-хлорфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид;

(2Е)-3-(3-(4-фторфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид;

(2Е)-3-(3-(3-фторфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид;

(2Е)-3-(3-(3,4-дифторфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид.

Соединения формулы (I) могут быть получены стандартными методами, такими как взаимодействие соединения формулы (II)

где Y и R соответствуют вышеуказанному определению, и карбоксильная группа активирована подходящим способом для реакции амидирования

с коммерчески доступным соединением формулы (III)

X(CH₂) _nNH₂ (III)

где X соответствует вышеуказанному определению.

Изобретение далее иллюстрируется посредством следующих примеров и схем.

ПРИМЕРЫ

Все коммерчески доступные соединения были куплены в Aldrich и использовались без дополнительной очистки. За ходом реакций следили методом тонкослойной хроматографии на силикагеле (покрытые пластины F₂₅₄ Merck), пятна рассматривали под УФ-излучением и проявляли водным раствором KMnO₄ . Флэш-хроматографию проводили с использованием силикагеля Merck (230-240 меш). Спектры ¹H-ЯМР регистрировали на спектрометре Varian 400 МГц, используя ТМС в качестве внутреннего стандарта. Масс-спектры были получены на спектрометре Waters-Micromass ZMD. Температуры плавления определяли в аппарате Buchi-Tottoli и не исправляли.

Пример 1 - (2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид Ia (схема 1)

Кислота 1 была получена из коммерчески доступного -ионона галоформной реакцией, как описано в литературе [2]. 1,0 ммоль (194 мг) кислоты 1 растворили в 8 мл безводного ДМФА. EDCI (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) (1,2 экв., 1,2 ммоль, 230 мг), HOBt (N-гидроксибензотриазол) (1,2 экв., 1,2 ммоль, 162 мг) и 5-аминоизохинолин (1,2 экв., 1,2 ммоль, 173 мг) последовательно добавили при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Растворитель упарили при пониженном давлении и остаток растворили в 50 мл этилацетата. Органическую фазу промыли водой (2 х 20 мл), насыщенным раствором хлорида натрия (1 х 10 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали методом колоночной хроматографии (силикагель, 3/7 этилацетат/гексан, за которым следовал этилацетат) и в заключении перекристаллизовали из диэтилового эфира с образование 150 мг бежевого твердого вещества. Выход = 47%. Тпл: (диэтиловый эфир) 131-133°С. ¹ H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,10 (6H, с), 1,49 (2H, м), 1,62 (2H, м), 1,81 (3H, с), 2,05 (2H, м), 6,18 (1H, д), 7,62 (2H, м), 7,70 (2H, м), 7,81 (1H, д), 8,38 (1H, уш. с), 8,53 (1H, д, J=5,6 Гц), 9,25 (1H, с); [М⁺¹] 321,7 (C₂₁H₂₄N ₂O вычислено 320,43).

Пример 2 - (2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(3-метокси-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акриламид Ib (схема 2)

Синтез 1

Синтез (2Е)-метил 3-(3-метокси-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)акрилат 3 [3]

Суспензию сложного эфира 2 (8 ммоль, 1,66 г) и N-бромсукцинимида (NBS) (1,1 экв., 8,8 ммоль, 1,56 г) в CCl₄ (30 мл) кипятили в течение 1 ч. После фильтрования через слой целлита растворитель упарили. Остаток растворили в MeOH (20 мл) и реакцию кипятили всю ночь. Растворитель упарили и неочищенный остаток растворили в диэтиловом эфире (30 мл) и промыли водой (1 х 20 мл). Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и сконцентрировали в вакууме. Очистку неочищенного остатка проводили методом колоночной хроматографии с использованием в качестве элюента смеси 1/9 этилацетат/петролейный эфир и получили 715 мг бесцветного масла. Выход = 37,5% (две стадии). ¹ Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,02 (3H, с), 1,04 (3H, с), 1,38 (2H, м), 1,62 (2H, м), 1,79 (3H, с), 3,37 (3H, с), 3,51 (1H, м), 3,75 (3H, с), 5,84 (1H, д, J=16 Гц), 7,33 (1H, д, J=16 Гц); [М⁺¹] 239,1 (С₁₄Н₂₂O₃ вычислено 238,32).

Синтез (2Е)-3-(3-метокси-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил) акриловой кислоты 4

LiOH (5 экв., 630 мг) добавили при 0°С к раствору сложного эфира 3 (3 ммоль, 715 мг) в смеси 3:1:1 ТГФ/МеОН/вода (15 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Растворители удалили при пониженном давлении и остаток разбавили водой (20 мл). Кислоту высадили добавлением 10% HCl и затем экстрагировали AcOEt (3 × 15 мл). Объединенные органические слои сушили над Na₂SO₄ и упарили в вакууме и получили 600 мг маслообразного продукта. Выход = 89%. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,03 (3H, с), 1,05 (3H, с), 1,39 (2H, м), 1,62 (2H, м), 1,80 (3H, с), 3,38 (3H, с), 3,52 (1H, м), 5,86 (1H, д, J=16 Гц), 7,45 (1H, д, J=16 Гц); [М⁺¹] 225,5 (С₁₃ Н₂₀O₃ вычислено 224,3).

Синтез 2

1,0 ммоль (224 мг) кислоты 4 растворили в 10 мл безводного ДМФА. EDCI (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) (1,2 экв., 1,2 ммоль, 230 мг), HOBt (N-гидроксибензотриазол) (1,2 экв., 1,2 ммоль, 162 мг) и 5-аминоизохинолин (1,2 экв., 1,2 ммоль, 173 мг) были добавлены последовательно при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Растворитель упарили при пониженном давлении и остаток растворили в 50 мл этилацетата. Органическую фазу промыли водой (3 × 20 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (1 × 10 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали методом колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат) и в заключение перекристаллизовали из диэтилового эфира с образование 160 мг желтого аморфного твердого вещества. Выход = 45%. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,07 (6H, с), 1,42 (2H, м), 1,66 (2H, м), 1,86 (3H, c), 3,40 (3H, c), 3,48 (1H, м), 6,18 (1Н, д), 7,51 (1Н, м), 7,65 (3H, м), 7,84 (1H, д), 8,38 (1H, уш.с), 8,55 (1H, д, J=6 Гц), 9,26 (1H, с); [М⁺¹] 351,2 (С₂₂Н₂₆ N₂O₂ вычислено 350,45).

Пример 3 - (2Е)-N-(изохинолин-5-ил)-3-(2,6,6-триметил-3-феноксициклогекс-1-енил)акриламид Iс (схема 3)

Синтез 1

Синтез (2Е)-метил 3-(2,6,6-триметил-3-феноксициклогекс-1-енил)акрилата 5с [4]

Суспензию сложного эфира 2 (3,12 ммоль, 650 мг) и N-бромсукцинимида (NBS) (1,1 экв., 3,43 ммоль, 611 мг) в CCl₄ (15 мл) кипятили в течение 1 ч. После фильтрования через слой целлита растворитель упарили. Остаток растворили в MeOH (5 мл) и по каплям добавили к раствору феноксида натрия (6,24 ммоль) в метаноле (10 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Реакцию вылили в холодный 5% водный раствор гидроксида натрия (15 мл) и продукт экстрагировали эфиром (2 × 20 мл). Органический слой промыли водой (1 × 10 мл), насыщенным раствором хлорида натрия (1 × 5 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и сконцентрировали в вакууме. Очистку неочищенного продукта проводили методом колоночной хроматографии с использованием в качестве элюента смеси 1/9 этилацетат/петролейный эфир и получили 350 мг бесцветного масла. Выход = 37,5% (две стадии). ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,07 (3H, с), 1,12 (3H, с), 1,42 (2H, м), 1,78 (2H, м), 1,86 (3H, с), 3,78 (3H, с), 4,57 (1H, м), 5,92 (1H, д, J=16,4 Гц), 6,95 (3H, м), 7,29 (2H, м), 7,44 (1H, д, J=16,4 Гц); [М ⁺¹] 301,2 (С₁₉Н₂₄O₃ вычислено 300,39).

Синтез (2Е)-3-(2,6,6-триметил-3-феноксициклогекс-1-енил) акриловой кислоты 6с

LiOH (5 экв., 243 мг) добавили при 0°С к раствору сложного эфира 5 (1,16 ммоль, 350 мг) в смеси 3:1:1 ТГФ/МеОН/вода (12,5 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре всю ночь. Растворители удалили при пониженном давлении и остаток разбавили водой (20 мл). Кислоту высадили добавлением 10% HCl и затем экстрагировали AcOEt (3 × 15 мл). Объединенные органические слои сушили над Na₂ SO₄ и упарили в вакууме с получением 300 мг белого твердого вещества. Выход = 90%. ¹H ЯМР (CDCl₃ , 400 МГц) 1,08 (3H, с), 1,13 (3H, с), 1,44 (2H, м), 1,78 (2H, м), 1,87 (3H, с), 4,58 (1H, м), 5,94 (1H, д, J=16,4 Гц), 6,96 (3H, м), 7,29 (2H, м), 7,52 (1H, д, J=16,4 Гц); [М⁺¹] 287,5 (С₁₈Н₂₂O₃ вычислено 286,37).

Синтез 2

0,5 ммоль (143 мг) кислоты 6с растворили в 5 мл безводного ДМФА. EDCI (1,2 экв., 0,6 ммоль, 115,2 мг), HOBt (1,2 экв., 0,6 ммоль, 81 мг) и 5-аминоизохинолин (1,2 экв., 0,6 ммоль, 86,51 мг) добавили последовательно при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Растворитель упарили при пониженном давлении и остаток растворили в 30 мл этилацетата. Органическую фазу промыли водой (2 х 10 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (1 × 10 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенный твердый продукт очищали методом колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/петролейный эфир 8:2) и в заключении перекристаллизовали из диэтилового эфира с образование 100 мг белого твердого вещества. Выход = 48,5%. Тпл.: (диэтиловый эфир) 141-143°С. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,14 (3H, с), 1,17 (3H, с), 1,47 (2H, м), 1,78 (2H, м), 1,95 (3H, с), 4,60 (1H, м), 6,41 (1H, д), 6,97 (2H, д, J=7,2 Гц), 7,26 (4H, м), 7,59 (1H, д, J=16 Гц), 7,80 (1H, т, J=8 Гц), 7,92 (1H, д, J=8 Гц), 8,17 (1H, м), 8,37 (1H, м), 8,52 (1H, уш.с), 9,26 (1H, с); [М⁺¹] 413,6 (С₂₇Н₂₈ N₂O₂ вычислено 412,52).

Пример 4 - (2Е)-3-(3-(4-хлорфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид Id (схема 3)

Согласно синтезу 2, исходя из 0,5 ммоль кислоты 6d, получили 150 мг соединения Id в виде белого твердого вещества. Выход = 67%. Тпл.: (диэтиловый эфир) 168°С. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,11 (3H, с), 1,14 (3H, с), 1,45 (2H, м), 1,66 (2H, м), 1,86 (3H, с), 4,76 (1H, м), 6,61 (1H, д), 7,06 (2H, д, J=8,8 Гц), 7,31 (2H, м), 7,34 (2H, д, J=8,8 Гц), 7,69 (1H, т, J=8 Гц), 7,95 (1H, д, J=8 Гц), 8,04 (1H, м), 8,27 (1H, уш.с), 8,58 (1H, д, J=6 Гц), 9,33 (1H, с); [М⁺¹] 448,4 (С₂₇ Н₂₇СlN₂O₂ вычислено 446,97).

Пример 5 - (2Е)-3-(3-(4-фторфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид Iе (схема 3)

Согласно синтезу 2, исходя из 0,5 ммоль кислоты 6е, получили 100 мг соединения Iе в виде белого твердого вещества. Выход = 46%. Тпл.: (диэтиловый эфир) 135-137°С. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) 1,11 (3H, с), 1,15 (3H, с), 1,44 (2H, м), 1,71 (2H, м), 1,92 (3H, с), 4,50 (1H, м), 6,21 (1H, д), 6,91 (2H, м), 6,98 (2H, м), 7,54 (1H, д, J=15,6 Гц), 7,72 (3H, м), 7,87 (1H, д), 8,41 (1H, уш.с), 8,55 (1H, д, J=6,4 Гц), 9,28 (1H, с); [М ⁺¹] 431,6 (С₂₇Н₂₇FN₂O ₂ вычислено 430,51).

Пример 6 (2Е)-3-(3-(3-фторфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид If (схема 3)

Согласно синтезу 2, исходя из 0,5 ммоль кислоты 6f, получили 90 мг соединения If в виде белого твердого вещества. Выход = 42%. Тпл.: (диэтиловый эфир) 147°С. ¹H ЯМР (CDCl₃, 200 МГц) 1,11 (3H, с), 1,14 (3H, с), 1,57 (2H, м), 1,71 (2H, м), 1,88 (3H, с), 4,56 (1H, м), 6,20 (1H, д), 6,70 (4H, м), 7,58 (1H, д, J=15,6 Гц), 7,65 (3H, м), 7,85 (1H, д), 8,38 (1H, уш.с), 8,59 (1H, д, J=5,8 Гц), 9,29 (1H, с); [М⁺¹] 431,5 (С₂₇Н₂₇FN₂O₂ вычислено 430,51).

(2Е)-3-(3-(3,4-дифторфенокси)-2,6,6-триметилциклогекс-1-енил)-N-(изохинолин-5-ил)акриламид Ig (схема 3)

Согласно синтезу 2, исходя из 0,5 ммоль кислоты 6g, получили 90 мг соединения Ig в виде белого твердого вещества. Выход = 40%. Тпл.: (диэтиловый эфир) 155°С. ¹H ЯМР (CDCl₃, 200 МГц) 1,11 (3H, с), 1,14 (3H, с), 1,53 (2H, м), 1,75 (2H, м), 1,89 (3H, с), 4,55 (1H, м), 6,20 (1H, д), 6,68 (3H, м), 7,50 (1H, д, J=15,6 Гц), 7,65 (3H, м), 7,85 (1H, д), 8,40 (1H, уш.с), 8,60 (1H, д, J=5,8 Гц), 9,29 (1H, с); [М⁺¹] 449,7 (С₂₇Н₂₆F₂N₂O ₂ вычислено 448,51).

Схема 1

Реагенты: i) EDCI, HOBt, 5-аминоизохинолин, ДМФА, Т_комн.

Схема 2

Реагенты: i) NBS/CCl₄; ii) MeOH, кипячение; iii) LiOH, ТГФ/MeOH/вода, Т_комн.; iv) EDCI, HOBt, 5-аминоизохинолин, ДМФА, Т_комн.

Схема 3

Реагенты: i) NBS/CCl₄; ii) R PhONa, EtOH, Т_комн.; iii) LiOH, ТГФ/MeOH/вода, Т_комн.; iv) EDCI, HOBt, 5-аминоизохинолин, ДМФА, Т _комн.

Количественное определение биологической активности

Использовались новорожденные и зрелые крысы линии Sprague-Dawley (~250 г) (Harlam, Италия). Все эксперименты соответствовали национальным протоколам и были одобрены региональным комитетом по этическим нормам.

Анализ радиолигандного связывания

Для испытаний использовались самцы крыс линии Sprague-Dawley с массой тела между 250 и 350 г к моменту исследования. Для анализа связывания крыс декапитировали под анестезией, извлекали спинной мозг и разрушали с использованием тканевого гомогенизатора Polytron в ледяном буфере, содержащем 5 мМ KCl, 5,8 мМ NaCl, 0,75 мМ CaCl₂, 2мМ MgCl ₂, 320 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), pH 8,6 [5]. Гомогенизированную ткань центрифугировали при 1000 × g в течение 10 мин при 4°С и супернатант снова центрифугировали в течение 30 мин при 35000 × g при 4°С (Beckman Avanti J25). Осадок ресуспендировали в том же буфере, описанном выше, и использовали в экспериментах по связыванию. В экспериментах по насыщению 150 мкг белок/образец из суспензий мембран инкубировали с [³Н]-резинифератоксином ([³H]RTX) (0,003-3 нМ) в исследуемом буфере, содержащем 0,25 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) без жирных кислот, при 37°С в течение 60 мин. В экспериментах по конкурирующему связыванию мембраны инкубировали при 37°С в течение 60 мин с [³H]RTX (0,4 нМ) и повышая концентрации изучаемых соединений в интервале от 0,1 нМ до 3 мкМ. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мкМ RTX. После инкубации реакционную смесь охладили до 0°С и в течение 15 мин инкубировали с бычьим 1-кислым гликопротеином (200 мкг на пробирку) для уменьшения неспецифического связывания RTX. Мембраносвязанный RTX отделили от свободного RTX центрифугированием образцов при 18500 × g в течение 15 мин. Конец микроцентрифужной пробирки, содержащий осадок, отрезали и радиоактивность измеряли сцинтилляционным методом (Packard 2500 TR). Концентрацию белка определяли согласно методу Bio-Rad c бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта (Bradford, 1976). Результаты исследования по насыщению и конкурентному связыванию анализировали программой Ligand [6].

Измерение Са²⁺ методом флуоресцентного анализа в культивированных ганглиях тройничного нерва крысы

Двухдневных и новорожденных крыс необратимо анестезировали и декапитировали. Ганглии тройничного нерва были выделены и быстро помещены в холодный раствор фосфатного буфера (PBS) перед перенесением в раствор коллагеназы/диспазы (1 мг/мл растворенный в свободном от Ca ²⁺ и Mg²⁺ PBS) на 35 мин при 37°С [7]. После ферментативной обработки ганглии промыли три раза свободным от Ca²⁺ и Mg²⁺ PBS и затем поместили в 2 мл холодной среды DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (FBS, инактивированная нагреванием), 2 мМ L-глутамина, 100 /мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Ганглии диссоциировали на одиночные клетки несколькими пропусканиями через группу инъекционных игл (23G вплоть до 25G). В заключение среду и клетки ганглиев фильтровали через 40 мкм фильтр для удаления дебриса и добавили 8 мл среды DMEM и центрифугировали (200 × g 5 мин). Целевой осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM [с добавлением 100 нг/мл фактора роста нервов мыши (мыши NGF-7S) и свободного основания цитозин- -D-арабинофуранозида (ARA-C) 2,5 мкМ]. Клетки высеивали на покрытые поли-L-лизином (8,3 мкМ) и ламинином (5 мкМ) 25 мм покровные стекла и выдерживали в течение от 5 до 8 дней при 37°С во влажной камере, заполненной 5% СО₂ и воздухом. К высеянным нейронам добавили эфир Fura-2-АМ (3 мкМ) в растворе Са²⁺ буфера со следующим составом (мМ): CaCl₂ 1,4, KCl 5,4, MgSO₄ 0,4, NaCl 135, D-глюкоза 5, НЕРЕS (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) 10 с BSA (бычий сывороточный альбумин) (0,1%), при pH 7,4 на 40 мин при 37°С. Высеянные нейроны затем дважды промыли раствором Са²⁺ буфера и перенесли в ячейку на предметном столике микроскопа Nikon eclipse TE300. Эфир Fura-2-АМ возбуждали при 340 нм и 380 нм, чтобы измерить относительные изменения концентрации [Са²⁺]_i с помощью отношения F₃₄₀ /F₃₈₀, которое фиксировалось системой анализа динамического изображения (Laboratory Automation 2.0, RCS, Флоренция, Италия). После перенесения высеянных нейронов в ячейку их оставили (по крайней мере, на 10 мин) для достижения стабильной флуоресценции перед началом эксперимента. Калибровочная кривая была получена с использованием буфера, содержащего эфир Fura-2-АМ и заданную концентрацию свободного Са²⁺. Затем эту кривую использовали для преобразования данных, полученных из отношения F₃₄₀ /F₃₈₀ в [Ca²⁺]_i (нМ) [8]. Было изучено влияние премедикации капсазепином (CPZ), SB366791 и соединениями формулы (I) на повышение [Ca²⁺]_i, обусловленное 0,1 мкМ капсаицина.

Вызванная капсаицином вторичная аллодиния у крыс

Капсаицин (20 нмоль/50 мкл/лапа) был введен в лишенный волос участок кожи подошвенной поверхности правой лапы крысы, под анестезией диэтиловым эфиром (Chaplan et al., 1994). Соединение Id было введено перорально (10 мг/кг) за 2 часа до инъекции капсаицина. Тактильная аллодиния была оценена через 90 мин после введения капсаицина.

Лекарственные вещества и реагенты

Лекарственные вещества и реагенты были получены у указанных компаний: [³Н]-Резинифератоксин (Perkin Elmer, Бостон, MA), SB-366791 (Tocris, Великобритания), капсаицин, капсазепин, иономицин, ламинин, поли-L-лизин, вещество P (Sigma, Италия); мыши NGF-7S и коллагеназа/диспаза (Roche Diagnostics, Италия); модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), сыворотка эмбрионов коров (FBS), инактивированная нагреванием, L-глутамин (200 мМ), пенициллин/стрептомицин (10,000 МЕ/мл ± 10,000 мкг/мл), (Gibco, Италия); эфир Fura-2-AM (Società Italiana Chimici, Италия). Исходные концентрации капсаицина (10 мМ), капсазепина (10 мМ), SB-366791 (1 мМ) и соединений формулы (I) были приготовлены в 50% DMSO и 50% Твина 80 (Tween 80). Эфир Fura-2-AM и иономицин растворяли в 100% DMSO. Все другие лекарственные вещества растворяли в дистиллированной воде. Растворы с подходящими степенями разбавления затем были приготовлены в буферном растворе Кребса.

Результаты

Количественное определение биологической активности

Кривая насыщения [³H]-RTX на рецепторах TRPV1, выделенных из спинного мозга крыс, показывает значение K_D, равное 0,21 (0,16-0,27), и значение B_max, равное 57 (53-62) фмоль/мг белка. График Скэтчарда фактически линейный, и компьютерный анализ данных показывает, что присутствует только один тип сайтов связывания с высокой аффинностью. Эксперименты по конкурентному связыванию [³H]-RTX показали, что соединения Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If, Ig и эталонного соединения (Е)-3-(4-хлорфенил)-N-(3-метоксифенил)-акриламид (SB-366791) обладают значениями K_i, равными 66 (56-78) нМ, 26,2 (21,1-32,6) нМ, 4,93 (3,40-7,16) нМ, 27 (23-32) нМ, 14,8 (10,2-21,5) нМ, 8,14 (6,87-9,65) нМ, 10,3 (7,9-13,4) нМ и 36 (30-43) нМ соответственно.

Ca²⁺ флуоресценция

Капсаицин (0,1 мкМ) вызвал увеличение [Ca²⁺] в подавляющем большинстве (95%) нейронов тройничного нерва, которые по этой причине были определены как TRPV1 экспрессирующие нейроны. Значения IC₅₀ соединений Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If и Ig, ингибирующие вызываемую капсаицином активацию [Ca ²⁺]_i, составили 44 (11-184) нМ, 28,4 (25,2-31,9) нМ, 2,12 (1,44-2,82) нМ, 18,2 (4-98) нМ, 5,25 (4,11-6,70) нМ, 0,38 (0,36-0,40) нМ и 0,65 (0,62-0,68) нМ соответственно. Эталонные антагонисты TRPV1, капсазепин и SB-366791 ингибировали отклик капсаицина со значениями IC₅₀, равными 948 (676-1330) нМ и 8,7 (3,4-17,3) нМ соответственно. Результаты выражали в виде среднего значения и границ 95% доверительного интервала.

Вызванная капсаицином вторичная аллодиния у крыс

Через 90 мин после введения капсаицина соединение Id вызвало превентивный эффект (54%) против проаллодинического эффекта капсаицина.

ССЫЛКИ

1. Appendino, G. and Szallasi A. Progress in Medicinal Chemistry 2006, 44, 145-180.

2. Shimasaki, H.; Kagechika, H.; Fukasawa, H. Kawachi, E.; Shudo, K. Chemical & Pharmaceutical Bulletin 1995, 43, 100-7.

3. a) Baasov, T. and Sheves, M. Angew. Chem. 1984, 23, 803-804. b) Baraldi, P. G.; Pollini, G. P.; Simoni, D.; Zanirato, V.; Barco, A.; Benetti, S. Synthesis 1986, 9, 781-2.

4. Nanasawa, M. and Kamogawa, H. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1982, 55, 3655-3656.

5. a) Szallasi A. and Blunberg P. M. Neurosciences 1992, 8, 368. b) Szallasi A. and Blunberg P.M. Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 1993, 347, 84-91.

6. Munson, P.J.; Rodbard, D. Anal. Biochem. 1980, 107, 220-239.

7. Rigoni, M.; Trevisani, M.; Gazzieri, D.; Nadaletto, R.; Tognetto, M.; Creminon, C; Davis, J.B.; Campi, B.; Amatesi, S.; Geppetti, P.; Harrison, S. Br. J. Pharmacol. 2003, 138, 977-985.

8. Kudo, Y.; Ozaki, K.; Miyakawa, A.; Amano, T.; Ogura, A. Jap. J. Pharmacol. 1986, 41, 345-351.