способ стимуляции миелопоэза

Формула изобретения

Способ стимуляции миелопоэза, заключающийся во введении препарата пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней, отличающийся тем, что дополнительно однократно внутривенно вводят препарат, содержащий D-глюкуроновую кислоту, в дозе 2 мг/кг.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых способов стимуляции гемопоэза.

Известно большое количество способов стимуляции гемопоэза.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата иммобилизированной гиалуронидазы [3].

Недостатком данного способа является его недостаточная эффективность.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, заключающемся в одновременном введении перорально пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и однократно внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.

Новым в предлагаемом изобретении является дополнительное однократное введение внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.

На сегодняшний день показана возможность стимуляции эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения с помощью пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) [3]. При этом механизмом действия препарата является стимуляция процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток под влиянием образующихся под действием фермента низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты (ГК) межклеточного матрикса гемопоэтической ткани [4].

Известны гемостимулирующие эффекты D-глюкуроновой кислоты, но лишь при ее курсовом введении в высоких дозах (50 мг/кг) [5]. При этом широкое клиническое использование данного препарата в качестве гемостимулятора в указанных дозах, учитывая его кислотность, частоту и тяжесть возникновения местнораздражающих реакций, представляется маловероятным.

Вместе с тем, известно, что введение препаратов гиалуронидазы способно сопровождаться разобщением процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников [4, 6], и как следствие - ограничением выраженности гемостимулирующих эффектов, потенциал которых может быть значительно выше. Кроме того, показано снижение способности прогениторных элементов, подвергшихся воздействию гиалуронидазы, к энграфтингу при их трансплантации [7], а также возможность предупреждения формирования данного феномена путем инкубации трансплантата в растворе, содержащем D-глюкуроновую кислоту, представляющую собой структурную единицу мономера ГК [8].

Тем не менее, возможность усиления гемостимулирующего эффекта пэгГД с помощью дополнительного введения D-глюкуроновой кислоты, причем в дозах, значительно ниже терапевтически эффективных доз, остается не известна.

Факт совместного применения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты с достижением нового технического результата: создание эффективного способа стимуляции миелопоэза за счет потенцирования специфических гематотропных эффектов каждого из используемых веществ, для специалиста является не очевидным. Эксперимент показал непредсказуемый результат.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному (мыши) одновременно вводят перорально препарат пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2-х дней, и однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг.

Заявляемая доза и режим введения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 244 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Эффективность стимуляции миелопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [9] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов на 3, 5 и 8-е сутки после введения цитостатика [10].

Пример 1.

Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили перорально препарат пэгГД (ООО «Саентифик фьючер менеждмент», г.Новосибирск) 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 50 ЕД/кг (способ-прототип) и препарат пэгГД в аналогичном режиме совместно с однократным внутривенным введением D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг («Sigma», США).

Контролями служили группы животных, которым вводили либо однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг, либо 1 раз в сутки в течение 2-х дней физиологический раствор.

Введение препарата пэгГД на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения. Отмечалось увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2), а также количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).

В отличие от этого введение D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг не оказывало статистически значимого влияния на показатели системы крови (табл.1-3).

В то же время применение D-глюкуроновой кислоты на фоне введения пэгГД сопровождалось значительной стимуляцией процессов кроветворения. Причем темп и выраженность регенерации кроветворной ткани в данном случае существенно превосходили таковые при использовании только пэгГД. Так, количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге на 5-е сутки было в 2,3 и 1,8 раз соответственно выше аналогичных параметров у животных, получавших терапию по способу-прототипу.

Указанные изменения состояния пула родоначальных элементов сопровождались закономерно более ранним восстановлением морфологически распознаваемых показателей костного мозга (в первую очередь, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, эритроидных клеток) (табл.2) и периферической крови (ретикулоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов и тромбоцитов) (табл.3).

Таким образом, дополнительное введение низких доз D-глюкуроновой кислоты на фоне проведения терапии с помощью пегилированной гиалуронидазы приводило к значительному ускорению регенеративных процессов гемопоэтической ткани. При этом механизмом потенцирования гемостимулирующих эффектов пэгГД, по-видимому, являлось регуляторное влияние D-глюкуроновой кислоты на метаболизм гиалуроновой кислоты гликокаликса кроветворных прекурсоров.

Литература

1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - № 11. - P.1593-1603.

2. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - № 4. - С.80-84.

3. Дыгай A.M., Артамонов А.В., Бекарев А.А. и др. Гемостимулирующие эффекты иммобилизированной гиалуронидазы и механизмы их развития при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - № 5. - С.528-531.

4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - № 11. - С.7-10.

5. Гурьянцева Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В. и др. Механизмы регуляции системы крови под влиянием гемостимуляторов на фоне цитостатической миелосупрессии // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 3. - С.39-43.

6. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - № 12. - С.690-695.

7. Hui Zhu, Noboru Mitsuhashi, Andrew Klein e.a. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. 2006 - Vol.24. - N.4. - P.928-935.

8. Патент (RU) на изобретение № 2392947 «Способ получения клеточного материала для трансплантации при миелосупрессии», 2010. Авторы: Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др.

9. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - № 1(9). - С.29-32.

10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.

Таблица 1
Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBACaLac (на 105 неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированиой гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m)
Сроки исследования, сутки	КОЕ-Э	КОЕ-ГМ
Фон	6,75±0,73	4,50±0,38
3-е	1	8,40±0,30*	8,35±0,44*
2	8,58±0,23*	8,70±0,96*
3	14,1±1,7*#	12,38±0,82*#
4	18,3±0,23*#$	17,00±0,53*#$
5-е	1	7,56±0,48	6,63±0,78*
2	7,59±0,51	7,75±0,76*
3	10.73±0,65*#	15,89±0,45*#
4	24,8±1,3*#$	28,5±0,5*#$
10-е	1	5,8±0,8	4,25±0,53
2	5,75±0,7	4,4±0,29
3	7,7±0,3#	6,1±0,80*
4	8,10±0,42*#	8,2±0,7*#
* - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05;
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05;
$ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.

Таблица 2
Динамика показателей костномозгового кроветворения у мышей линии CBACaLac (×106 бедро) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m)
Сроки исследования, сутки	Незрелые нейтрофильные гранулоциты	Зрелые нейтрофильные гранулоциты	Эозинофильные гранулоциты	Моноциты	Эритроидные клетки
фон	1,0±0,05	3,22±0,19	0,57±0,05	0,34±0,08	1,85±0,32
3-е	1	0,03±0,01*	0,10±0,04*	0	0,25±0,05	0,17±0,04*
2	0,03±0,02*	0,15±0,02*	0	0,20±0,14	0,14±0,05*
3	0,14±0,02*#	0,14±0,04*	0	0,42±0,07	0,36±0,03*#
4	0,15±0,02*#	0,17±0,03*	0	0,51±0,03*	0,44±0,02*#$
5-е	1	1,5±0,21*	2,8±0,24*	0,20±0,08	0,96±0,1*	1,22±0,1
2	1,6±0,06*	2,6±0,29*	0,09±0,05*	0,98±0,08*	1,28±0,26
3	2,31±0,02*#	3,4±0,10*#	0,22±0,05	1,34±0,15*	1,99±0,32#
4	3,49±0,05*#$	5,7±0,37#$	0,2±0,20	2,55±0,25*#$	2,78±0,2*#$
10-е	1	1,6±0,08*	4,5±0,3*	0,56±0,25	0,40±0,09	1,4±0,04
2	0,80±0,41	4,7±0,5*	0,58±0,10	0,61±0,17	1,39±0,03
3	3,6±0,08*#	6,41±0,4*#	0,53±0,7	0,99±0,31	2,36±0,1*#
4	4,3±0,03*#$	7,32±0,08*#$	0,57±0,14	1,07±0,06*#	3,4±0,07*#$
* - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05;
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05;
$ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.

Таблица 3
Показатели периферической крови у мышей линии CBACaLac после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m)
Сроки исследования, сутки	Ретикулоциты, в промиллях	Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л	Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л	Тромбоциты, Т/л
Фон	9,3±0,2	0,30±0,02	2,34±0,07	654,7±23,4
3-е	1	10,4±0,14*	0,01±0,01*	0,11±0,02*	544,60±31,1*
2	10,89±0,33*	0,01±0,01*	0,14±0,01*	584,6±36,7
3	14,7±0,5*#	0,01±0,01*	0,19±0,02*	507,9±14,7*
4	16,8±0,59*#$	0,01±0,01*	0,16±0,02*	577,1±23,0
3-е	1	23,7±1,1*	0,06±0,04*	1,5±0,43*	477,8±6,4*
2	22,6±1,3*	0,08±0,03*	1,62±0,29*	493,0±37,9*
3	35,7±0,9*#	0,33±0,04#	2,8±0,26#	487,3±17,8*
4	42,4±2,08*#$	0,94±0,21*#$	3,71±0,11*#$	794,5±21,8*#$
10-е	1	16,2±1,0*	1,5±0,2*	4,23±0,53*	708,4±17,1
2	15,7±0,7*	1,72±0,1*	4,37±0,7*	869,6±94,3*
3	17,4±0,7*	1,6±0,3*	6,3±0,12*#	1084,7±42,8*#
4	20,1±0,9*#$	1,97±0,1*	7,43±0,45*#$	1256,7±21,8*#$
* - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05;
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05;
$ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.