производные камптотецина с противоопухолевой активностью

Классы МПК:C07D491/22 в которых конденсированная система содержит четыре или более гетероциклических кольца
A61K31/4745  конденсированные с циклическими системами, содержащими азот в качестве гетероатома, например фенантролины
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):ИНДЕНА С.П.А. (IT)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-07-12
публикация патента:

Описываются новые производные камптотецина-4,5-дигидротриазол [5,4-с]16а-дезоксокамптотецин и триазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецин, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция, их содержащая, и применение их в качестве противоопухолевых лекарственных средств. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Настоящее изобретение относится к новым производным камптотецина, обладающим противоопухолевой активностью, способам их получения, применению их в качестве противоопухолевых лекарственных средств и содержащим их фармацевтическим композициям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Камптотецин является алкалоидом, выделенным из Camptotheca acuminate (Камптотека остроконечная) (Nyssaceae), впервые описанным Wall и Wani в 1966 году (J. Am. Chem. Soc. 1966, 3888-3890). Хотя камптотецин обладает широким спектром противоопухолевой активности, особенно в отношении рака толстой кишки и других солидных опухолей и лейкозов, он не используется в терапии из-за своей высокой токсичности, которая, в частности, проявляется в форме геморрагического цистита, гастроинтестинальной токсичности и миелосупрессии.

Для того чтобы получить соединения с низкой токсичностью и высокой растворимостью, были синтезированы несколько аналогов камптотецина. В настоящее время в клинической практике используются два лекарственных средства, а именно CPT-11 и топотекан. Другие производные, такие как белотекан, рубитекан, экзатекан, гиматекан, пегамотекан, луртотекан, каренитецин, афелетекан, гомокамптотецин, дифломотекан и многие другие, проходят клинические испытания. Соединение CPT-11 является высокорастворимым пролекарством для 10-гидрокси-7-этилкамптотецина (более известного как SN-38), одобренного для лечения многих солидных и асцитных опухолей (опухолей толстой и прямой кишки, кожи, желудка, легких, шейки матки, яичников и неходжкинской лимфомы).

Топотекан является соединением, растворимым в физиологическом растворе, активным в отношении опухолей легкого, желудка, печени, яичников, молочной железы, простаты, пищевода, прямой кишки, сарком мягких тканей, головы и шеи, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов. Однако топотекан обладает значительными побочными эффектами, такими как нейтропения и тромбоцитопения.

Луртотекан является более растворимым соединением, обладающим активностью в отношении опухолей шеи, яичников, груди, толстой и прямой кишки и легочной микроцитомы. Однако луртотекан также обладает гемической токсичностью.

Рубитекан является пролекарством, предназначенным для перорального применения, эффективным в отношении опухолей поджелудочной железы, яичников и молочной железы.

Камптотецин и его аналоги так же, как и все ингибиторы топоизомеразы I, эффективны в отношении опухолей, резистентных к обычным лекарственным средствам, включая ингибиторы топоизомеразы II; поддерживают высокий уровень топоизомеразы в течение всего клеточного цикла; не провоцируют множественную лекарственную устойчивость (определяемую белками Pgо или MRP) или детоксикационный метаболизм, опосредованный ферментом.

Теперь исследования сосредоточены на новых ингибиторах топоизомеразы I, менее токсичных, чем лекарственные средства, используемые в настоящее время.

Производные камптотецина с открытым ароматическим кольцом демонстрируют высокое связывания с белком (в частности, с альбумином) и низкое распределение в опухолевой ткани. В результате продукт накапливается в организме и оказывает слабое действие на опухолевые клетки.

И наоборот, высокая липофильность лактонной формы усиливает адгезию производных камптотецина к клеточным мембранам, в частности мембранам эритроцитов, изменяя уровень соотношения распределения ткань/плазма. По этой причине исследование фокусируется на двух альтернативных подходах: а) разработка продуктов, обладающих низкой связываемостью с белком, но, тем не менее, высокой растворимостью; b) разработка продуктов с высоким потенциалом действия, обладающих терапевтическим эффектом даже в чрезвычайно низких дозах.

Модификации по положениям 7-, 9-, 10- и 11- обычно оказывались хорошо переносимыми, не влияя на стабильность тройного комплекса ДНК-Топоизомераза I-камптотецин, образование которого отвечает за противоопухолевую активность соединений.

Продукты конфигурации 20R оказались неактивными или менее активными, чем продукты конфигурации 20S, которая соответствует природной конфигурации.

Как правило, модификации в пятом положении считаются неблагоприятными для образования тройного комплекса, тогда как было показано, что модификации пиридоновых колец D и E негативно влияют на активность продукта.

РАСКРЫТИЕ ФОРМУЛЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к производным камптотецина общей формулы I:

производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009

где

R представляет алкил, аминоалкил, гидроксиалкил, нитрил, алкоксимино, арилоксимино, силилалкил;

R1 представляет водород, гидрокси, алкокси, аминоалкил;

R2 представляет водород, гидрокси, алкокси, аминоалкил, необязательно защищенную гидроксигруппу;

где алкил, алкокси, аминоалкил или алкоксиминогруппы могут содержать от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, в прямой или разветвленной цепи, тогда как арилоксиминогруппа может содержать от 5 до 10 атомов углерода;

их фармацевтически приемлемые соли, изомеры, энантиомеры, диастереомеры и соответствующие смеси.

Соединения изобретения демонстрируют низкую связываемость с белком и имеют хорошую растворимость и высокую эффективность даже в очень низких дозах.

Предпочтительный путь синтеза для получения соединений изобретения показан на следующей схеме и включает следующие основные стадии:

а) защита предшествующих гидроксигрупп;

b) модификация по 5-му положению N,N-дизащищенным гидразином;

c) необязательное преобразование пиридонового кольца в тиопиридоновое кольцо;

d) удаление защитных групп с сопутствующей циклизацией;

e) необязательная ароматизация пиразолового кольца.

производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009

В схеме R, R1 и R2 имеют значения, указанные выше, а PG является защитной группой для гидроксигруппы.

Гидроксигруппы обычно защищают с помощью легко удаляемых ацильных групп, предпочтительно трихлорацетатом и Troc (C(O)CH 2CCl3), или силиловыми группами, предпочтительно триэтилсилилом (TES).

Модификация по 5-му положению защищенным гидразином может быть получена при обработке предшественника сильным органическим основанием, таким как LiHMDS (гексаметилдисилазид лития), и взаимодействием полученного карбаниона с азадикарбоксилатом, таким как ди-трет-бутоксиазадикарбоксилат или дибензилоксиазадикарбоксилат. Преобразование пиридонового кольца в тиопиридоновое кольцо может быть получено с помощью реакции с 2,4-бис(4-метоксифенил)-1,2,3,4-дитиафосфэтан-2,4-дисульфид (более известным как реагент Лоуссона) (Cava P.M. et al., Tetrahedron 1985, 41, 5061; Cherkasov R.A. et al., Tetrahedron 1985, 41, 2567; Ghattas A.A.G. et al., Sulfur Lett. 1982, 1,69; Yde B. et al., Tetrahedron 1984, 40. 2047) или эквивалентным реагентом. Реагент Лоуссона предпочтителен.

Целью необязательного преобразования в тиопиридон является обеспечение замыкания кольца после снятия защиты с гидразина. Однако было обнаружено, что указанная реакция замыкания кольца проходит спонтанно и немедленно даже без активации пиридинового карбонила, например тиокарбонила.

Когда защитными группами для гидроксигрупп являются силильные группы, а для азота - карбаматы, их обычно удаляют трихлоруксусной кислотой. В альтернативном методе стадии b) и c) можно поменять местами.

Соединения данного изобретения тестировали на цитотоксичность на широком спектре опухолевых клеток. В качестве примера приведены данные по цитотоксичности на клеточную линию NCI-H460 (клетки крупноклеточного рака легких) для двух соединений формулы (I) с использованием камптотецина и лекарственных средств Топотекан и SN-38 в качестве контролей:

НазваниеФормула NCI-H460

IC 50(мкг/мл)

Количество клеток
Камптотецинпроизводные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 0,115±0,0174
Топотекан производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 0,63±0,044
SN-38 производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 0,0865±0,0049
IDN 6132 производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 17±4,25
IDN 6137 производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 3,8±1,08

Для наиболее активных соединений проводили тест на расщепление ДНК, измеряя активную концентрацию и устойчивость к повреждениям (см. раздел «Примеры»). Неожиданно производные формулы (I) показали более высокую устойчивость при блокировании репликации ДНК, чем контрольные стандарты (в частности, топотекан и камптотецин), при этом сохраняя высокую цитотоксическую активность.

Далее, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы (I) вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Фармацевтические формы, удобные для перорального или парентерального приема соединений (I), могут быть твердыми, предпочтительно капсулы, таблетки или гранулы, или жидкими, предпочтительно растворы для инъекций или инфузий.

Соединения изобретения в удобной для приема форме могут быть использованы для лечения солидных опухолей и лейкозов, в частности опухолей легких, яичников, молочной железы, желудка, печени, простаты, саркомы мягких тканей, головы и шеи, пищевода, поджелудочной железы, толстой кишки, прямой кишки, глиобластомы, хронических и острых миелоидных лейкозов.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР I. 20-OTES-камптотецин

Камптотецин (0,100 г, 0,287 ммоль) суспендируют в сухом диметилформамиде (3 мл), в инертной атмосфере, к получившейся суспензии добавляют имидазол (0,980 г, 1,44 ммоль). Смесь перемешивают 10 минут, затем к ней по каплям добавляют триэтилсилилхлорид (TES-Cl) (0,193 мл, 1,15 ммоль), с последующим добавлением 4-диметиламинопиридин (DMAP) (0,040 г, 0,287 ммоль). Через 46 часов реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении (контроль полного исчезновения исходного вещества на тонкослойной хроматографии, элюент хлористый метилен:метанол = 30:1). Затем твердое вещество снова растворяют в хлористом метилене и отмывают водой и насыщенным хлоридом аммония. Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (2×10 мл). Органические слои смешивают и высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении с получением целевого продукта (0,133 г, 0,287 ммоль) в виде светло-желтого твердого вещества.

1H ЯМР(CDCl 3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 8,37 (с, 1Н, Ar, H-7), 8,25 (д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,92 (д, 1Н, J=8,0 Гц, Ar), 7,82 (т, 1Н, J=8,0 Гц, Ar ), 7,65 (т, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,57 (с, 1Н, Н-14), 5,67 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 5,29 (c, 2H, H-5), 5,25 (д, 1Н, J=16,4 Гц, Н-17), 2,00-1,84 (м, 2Н, Н-19), 1,03-0,93 (м, 12Н), 0,80-0,71 (м, 6Н). 13 С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 171,7, 157,6, 152,5, 151,5, 149,0, 145,9, 130,9, 130,4, 130,0, 128,4, 128,1, 128,0, 127,9, 118,9, 94,4, 75,3, 66,0, 50,0, 33,2, 7,9, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР II. Получение 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина

Камптотецин 20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждают до -78°С и по каплям добавляют к смеси 1,0 М раствор LiHMDS в тетрагидрофуране (0,281 мл, 0,281 ммоль). Через 20 минут добавляют раствор ди-трет-бутилазодикарбоксилата (DTBAC) (0,075 г, 0,324 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (2 мл). После 4 часов при -78°С исчезновение реагента проверяют тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:1). Наблюдают образование двух диастереомеров. Реакцию прерывают добавлением насыщенного хлорида аммония. Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×15 мл), органические слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 3:1), таким образом получая смесь двух изомеров (0,145 г, 0,210 ммоль, выход 97%). Два изомера разделяют с помощью дальнейшей хроматографии. В порядке элюции:

1й диастереомер: 1H ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,80 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,23 (д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 8,01 (ушир.д, 1Н, Ar), 7,90-7,71 (м, 2Н, Ar), 7,70-7,45 (м, 2Н, Ar+, H-14), 6,52 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,61 (д, 1Н, J=16,8 Гц, H-17), 5,23 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,03-1,81 (м, 2Н, Н-19), 1,79-1,08 (ушир.с, 18Н), 1,06-0,92 (м, 12Н), 0,80-0,70 (м, 6Н). 13 С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 171,7, 157,8, 155,5, 155,5, 152,0, 152,0, 151,2, 149,4, 145,0, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,7, 81,5, 79,7, 75,2, 65,7, 33,2, 28,3, 27,6, 7,7, 7,2, 6,4.

2й диастереомер: 1H ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,79 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,23 (д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 8,01 (ушир.д, 1Н, Ar), 7,85-7,76 (м, 2Н, Ar), 7,65 (ушир.т, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,52 (с, 1Н, H-14), 6,54 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,61 (д, 1Н, J=16,8 Гц, H-17), 5,22 (д, 1Н, J=16,8 Гц, H-17), 2,03-1,82 (м, 2Н, Н-19), 1,76-1,08 (ушир.с, 18 Н), 1,04-0,92 (м, 12Н), 0,80-0,70 (м, 6Н). 13С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 171,5, 157,9, 155,5, 155,5, 152,3, 152,0, 151,2, 149,4, 145,1, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,9, 81,5, 79,6, 75,2, 65,8, 33,3, 28,3, 27,4, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР III. Получение 1го диастереомера 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Первый диастереомер 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,050 г, 0,072 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (4 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, по каплям добавляя в смесь Et3Nпроизводные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 3HF (0,088 мл, 0,542 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 35 часов при комнатной температуре, проверяя исчезновение реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:2). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 3:2), таким образом получая целевой продукт (0,041 г, 0,071 ммоль, выход 98%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

1 H ЯМР (CDCl3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , м.д.: 8,77 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,16 (ушир.д, 1Н, J=8,0 Гц, Ar), 7,97 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,86-7,50 (м, 4 Н, Ar), 6,51 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,66 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 5,24 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 3,86 (ушир.с, 1Н, OH), 2,00-1,80 (м, 2Н, Н-19), 1,79-1,13 (ушир.с, 18 Н), 1,03 (т, 3Н, J=7,6 Гц, Ме). 13 С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 173,7, 157,9, 155,5, 155,5, 152,1, 151,3, 150,7, 149,6, 145,7, 132,3, 130,7, 129,9, 128,7, 127,9, 127,6, 120,0, 97,9, 82,8, 81,6, 79,7, 72,7, 66,1, 31,8, 28,3, 27,7, 7,7.

ПРИМЕР IV. Получение 2го диастереомера 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Второй диастереомер 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,050 г, 0,072 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (4,5 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляя в смесь Et3Nпроизводные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 3HF (0,088 мл, 0,542 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 35 часов при комнатной температуре, проверяя исчезновение реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:2). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 3:2), таким образом получая целевой продукт (0,040 г, 0,069 ммоль, выход 96%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

1 H ЯМР (CDCl3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,79 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,22 (ушир.д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,99 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,88-7,50 (м, 4 Н, Ar), 6,53 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,65 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 5,26 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 3,80 (ушир.с, 1Н, OH), 2,00-1,80 (м, 2Н, Н-19), 1,79-1,13 (ушир.с, 18 Н), 1,03 (т, 3Н, J=7,2 Гц, Ме). 13С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 173,6, 157,9, 155,4, 155,4, 152,1, 151,3, 150,8, 149,5, 145,6, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7, 127,9, 127,8, 119,8, 98,0, 83,0, 81,5, 79,7, 72,7, 66,3, 31,8, 28,3, 27,7, 7,8.

ПРИМЕР V. Получение 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина

Камптотецин-20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждают до температуры -78°С и по каплям добавляют 1,0 М раствор LiHMDS в тетрагидрофуране (0,281 мл, 0,281 ммоль). Через 20 минут добавляют раствор дибензилазодикарбоксилата (0,097 г, 0,324 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (2 мл). После 3 часов при -78°С температуру смеси оставляют подниматься до 25°С, после чего отсутствие реагента проверяют тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:1). Наблюдают образование двух диастереомеров. После 90 минут при комнатной температуре реакцию прерывают добавлением насыщенного хлорида аммония. Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×15 мл), органические слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 4:1, затем 7:2), таким образом получая светло-желтое твердое вещество (0,161 г, 0,212 ммоль, выход 98%). В дальнейшем два изомера разделяют с помощью хроматографии. В порядке элюции:

1й диастереомер: 1H ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,70 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,39 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,22 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,95 (ушир.д, 1Н, J=7,6 Гц, Ar), 7,83 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,65 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,64-7,00 (м, 11Н, Ar+Н-14), 6,49 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,57 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,47-4,44 (м, 5Н), 1,98-1,82 (м, 2H, H-19), 1,02-0,89 (м, 12H), 0,80-0,70 (м, 6H). 13С ЯМР (CDCl3 , 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 171,6, 158,0, 156,3, 156,3, 153,0, 152,2, 151,0, 149,6, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 130,0, 128,6-127,8 (11 С), 119,9, 98,4, 79,5, 75,2, 68,4, 67,9, 65,6, 33,0, 7,9, 7,2, 6,4.

2й диастереомер: 1H ЯМР (CDCl3 , 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,85 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,58 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,20 (шир. c, 1H, Ar), 7,93 (ушир. c, Ar), 7,81 (ушир.т, 1Н, J=7,6 Гц, Ar), 7,63 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,56-6,90 (м, 11Н, Ar+Н-14), 6,52 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,55 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,44-4,71 (м, 5Н), 1,98-1,80 (м, 2H, H-19), 1,05-0,90 (м, 12H), 0,81-0,70 (м, 6H). 13С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 171,5, 157,9, 156,4, 156,4, 152,9, 152,4, 150,9, 149,4, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 129,9, 128,6-127,8 (11 С), 119,9, 98,5, 79,3, 75,2, 68,4, 67,8, 65,6, 32,9, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР VI. Получение 1го диастереомера 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Первый диастереомер 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,140 г, 0,184 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляя в смесь Et3Nпроизводные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 3HF (0,225 мл, 1,380 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 52 часов при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 1:3). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 1:1, затем 3:2), таким образом получая целевой продукт (0,113 г, 0,175 ммоль, выход 95%) в виде светло-желтого твердого вещества. Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

1H ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,67 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,39 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,12 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,95 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,74 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,65-6,66 (м, 12H, Ar+Н-14), 6,48 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,55 (д, 1H, J=16,0 Гц, H-17), 5,42-4,44(м, 5 Н), 3,86 (ушир.с, 1H, OH), 1,92-1,72 (м, 2H, H-19), 0,95 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). 13С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 173,5, 158,0, 156,2, 156,0, 153,0, 150,9, 150,9, 149,5, 145,3, 135,4, 132,2, 130,7, 129,8, 128,7-127,8 (11 С), 119,9, 98,2, 79,6, 72,7, 68,5, 68,0, 65,9, 31,6, 7,8.

ПРИМЕР VII. Получение 2го диастереомера 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Второй диастереомер 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,140 г, 0,184 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляя в смесь Et3Nпроизводные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 3HF (0,150 мл, 0,921 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 55 часов при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:2). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 1:1), таким образом получая целевой продукт (0,113 г, 0,175 ммоль, выход 95%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

1 H ЯМР (CDCl3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,71 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,34 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,18 (ушир.с, 1H, Ar), 7,94 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,79 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,70-6,70 (м, 12H, Ar+Н-14), 6,52 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,53 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,44-4,48 (м, 5Н), 3,87 (ушир.с, 1H, OH), 1,90-1,70 (м, 2H, H-19), 0,99 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). 13 С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 173,4, 158,0, 156,3, 156,1, 153,0, 151,0, 150,9, 149,6, 145,3, 135,5, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7-127,8 (11 С), 119,8, 98,4, 79,5, 72,7, 68,5, 68,0, 67,8, 66,0, 31,6, 7,7.

ПРИМЕР VIII. Получение соли 4,5-дигидротриазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецина трифторуксусной кислоты

5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камтотецин (0,225 мг, 0,324 ммоль, диастереомерная смесь 1:1) растворяют в сухом 1,2-дихлорэтане (ДХЭ) (8 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем добавляя по каплям трифторуксусную кислоту (ТФУ) (0,895 мл, 11,67 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 20 часов при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 1:3), затем кипятят 4 часа с обратным холодильником. Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлением, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, хлористый метилен:метанол = 30:1), таким образом, получая целевой продукт (0,084 г, 0,178 ммоль, выход 55%) в виде соли трифторуксусной кислоты. Далее эквимолярную смесь двух диастереомеров очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, толуол: этилацетат = 1:1).

1 H ЯМР (CDCl3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 10,61 (ушир.с, 0,5H, N5-NH=C16a), 10,39 (ушир.с, 0,5H, N5-NH=C16a), 8,67 (с, 1H, Ar, H-7), 8,22-8,15 (м, 1Н, Ar), 7,96-7,92 (м, 1Н, Ar), 7,88-7,78 (м, 1Н, Ar), 7,69-7,60 (м, 2Н, Ar), 6,38-6,36 (м, 1Н, Ar, H-5), 5,72-5,62 (м, 1Н, Ar, H-17), 5,32-5,20 (м, 2Н, Ar, H-17+N5H), 4,08-3,86 (ушир.с, 1H, OH), 1,96-1,74 (м, 2H, H-19), 1,05-0,98 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). 13С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 173,8 (0,5 C), 173,4 (0,5 C), 159,1, 159,0, 156,7 (кв CF3COOH), 156,5 (кв CF3COOH), 151,5, 151,3, 150,7, 150,5, 150,1, 149,9, 144,8, 144,7, 134,0, 133,8, 131,6, 131,5, 129,9, 129,8, 128,7, 128,7, 128,4, 128,4, 128,2, 128,2, 127,1, 126,9, 120,5, 120,3, 99,1 (2 C), 78,9, 78,6, 72,7, 72,7, 66,0 (2 C), 31,7 (2 C), 7,7, 7,7.

ПРИМЕР IX. Получение триазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецина

Cоль 4,5-дигидротриазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецина трифторуксусной кислоты (0,020 г, 0,042 ммоль) растворяют в сухом хлористом метилене (4 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем добавляя 2,3-дихлоро-5,6-дициано-пара-бензохинон (ДДХ) (0,025 мг, 0,110 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 31 час при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (хлористый метилен:метанол = 30:1). Реакцию прерывают добавлением воды.

Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×15 мл), органические слои смешивают, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, хлористый метилен:метанол = 45:1), таким образом получая светло-желтое твердое вещество (0,014 г, 0,039 ммоль, выход 94%).

1 H ЯМР (CDCl3, 400 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 8,89 (с, 1H, Ar, H-7), 8,20 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 8,00 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,88 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,79 (с, 1Н, Ar, H-14), 7,69 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 5,70 (д, 1H, J=17,2 Гц, H-17), 5,28 (д, 1H, J=17,2 Гц, H-17), 3,83 (ушир.с, 1H, OH), 2,00-1,74 (м, 2H, H-19), 1,08 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). 13 С ЯМР (CDCl3, 100 МГц) производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 , 172,6, 157,4, 152,5, 150,8, 148,9, 143,7, 134,9, 132,5, 132,4, 130,0, 129,5, 128,7, 127,5, 122,6, 121,4, 101,2, 72,4, 66,0, 31,6, 7,7.

ПРИМЕР X. Тест на цитотоксичность

Клетки H460 крупноклеточного рака легких человека культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS (эмбриональной сыворотки телят). Чувствительность клеток оценивали по ингибированию роста культуры после 1 или 72 часов инкубации с лекарственным средством. Клетки в логарифмической фазе роста собирали и в дупликатах высеивали на 6-луночные планшеты. Через 24 часа после пассажа клетки инкубировали с лекарственными средствами и через 72 часа после инкубации с лекарственными средствами на цитометре подсчитывали количество клеток для расчета IC50. IC50 определяется как концентрация вещества, при которой происходит подавление роста 50% клеток по сравнению с негативным контролем.

ПРИМЕР XI. Тест на топоизомераза I-зависимые разрывы ДНК

Разрывы ДНК определяли при помощи 751 bp BamHI-EcoRI ДНК-SV-40 очищенного геля (Beretta GL, Binaschi M, Zagni AND, Capuani L, Capranico G. Связывание топоизомеразы типа IB с сайтом ДНК при слиянии фермента с гетерологичным сайт-селективным ДНК-связывающим доменом белка. Cancer Res 1999; 59:3689-97). Фрагменты ДНК были мечены только по 3' концу. Реакцию разрыва ДНК (20000 копий в минуту/образец) проводили в 20 мл 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ хлорида калия, 5 мМ хлорида магния, 15 мкг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), 0,1 мМ тиотреитола и человеческого рекомбинантного фермента (top1 полной длины) 30 минут при 37°С. Реакции блокировали при инкубации в течение 45 минут при 42°С с 0,5% SDS (додецилсульфат натрия) и 0,3 мг/мл протеиназы К. Устойчивость повреждений ДНК проверяли в разное время, добавляя 0,6 М хлорид натрия после 30 минут инкубации с лекарственным средством. После преципитации ДНК ресуспендировали в денатурирующем буфере (80% формамид, 10 мМ гидроксид натрия, 0,01 М ЭДТА и 1 мг/мл красителя) перед переносом в денатурирующий гель (7% полиакриламид в TBE буфере). Все степени разрыва ДНК детектировали на приборе Phospholmager 425 (Molecular Dynamics) (Dallavalle S., Ferrari A., Biasotti B. et al. Новые производные 7-оксииминометилкамптотецина с потенциальной противоопухолевой активностью in vitro и in vivo. J. Med. Chem. 2001; 44: 3264-74).

Устойчивость повреждений ДНК (%)
Соединения Время (мин)
производные камптотецина с противоопухолевой активностью, патент № 2441009 0 15 10
Топотекан 100 6520 10
Камптотецин 100 5823 20
SN-38 100 6033 28
IDN 6132 100 4532 20

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Производное камптотецина, выбранное из группы, включающей:

a) 4,5-дигидротриазол [5,4-с]16а-дезоксокамптотецин,

b) триазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецин.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая соединение по п.1 вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксцепиентами.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, в форме, удобной для перорального или парентерального приема.

4. Применение соединения по п.1 или композиции по пп.2, 3 для получения лекарственного средства для лечения опухолей.

5. Применение по п.4, где указанное лекарственное средство применяют для лечения солидных опухолей и лейкозов, в частности опухолей легкого, яичников, молочной железы, желудка, печени, простаты, сарком мягких тканей, пищевода, поджелудочной железы, головы и шеи, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2441009

patent-2441009.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07D491/22 в которых конденсированная система содержит четыре или более гетероциклических кольца

Патенты РФ в классе C07D491/22:
6'-арил-2'-(2-гидроксифенил)-11',11'-диметил-3',4,4',13'-тетраоксоспиро[2,5-циклогексадиен-1,9'-(7'-окса-2',12'-диазатетрацикло[6.5.1.01,5.08,12]тетрадец-5'-ен)]-14'-карбоксилаты и способ их получения -  патент 2485126 (20.06.2013)
гидратированные кристаллические сложные эфиры камптотецина для лечения рака -  патент 2483071 (27.05.2013)
способ очистки стауроспорина и способ получения n-бензоилстауроспорина -  патент 2467012 (20.11.2012)
конъюгаты цитотоксических средств с пептидами -  патент 2457218 (27.07.2012)
производные камптотецина с противоопухолевой активностью -  патент 2450008 (10.05.2012)
производные камптотецина с противоопухолевой активностью -  патент 2450007 (10.05.2012)
способ получения топотекана -  патент 2447076 (10.04.2012)
лиганды никотиновых ацетилхолиновых рецепторов -  патент 2441007 (27.01.2012)
спирогетероциклические соединения и их применение в качестве терапевтических средств -  патент 2428424 (10.09.2011)
новые растворимые в воде пролекарства -  патент 2413731 (10.03.2011)

Класс A61K31/4745  конденсированные с циклическими системами, содержащими азот в качестве гетероатома, например фенантролины

Патенты РФ в классе A61K31/4745:
гетероциклические соединения и способы применения -  патент 2525116 (10.08.2014)
производное соединение холестанола для комбинированного применения -  патент 2519186 (10.06.2014)
имидазохинолины и производные пиримидина в качестве потенциальных модуляторов vegf-стимулируемых ангиогенных процессов -  патент 2509558 (20.03.2014)
триазоло[1,5-a]хинолины в качестве лигандов рецептора аденозина а3 -  патент 2489432 (10.08.2013)
соединения и композиции, ингибирующие parp, и способы их применения -  патент 2485122 (20.06.2013)
пенный состав модификатора иммунного ответа, способ получения лекарственного средства на его основе (варианты) и лекарственный набор, содержащий указанный состав -  патент 2481108 (10.05.2013)
имидазохинолины в качестве двойных ингибиторов липидкиназы и mtor -  патент 2478387 (10.04.2013)
фармацевтическая композиция (варианты) и способ ее стерилизации -  патент 2474425 (10.02.2013)
противоопухолевые комбинации, содержащие ингибитор vegf и иринотекан -  патент 2471483 (10.01.2013)
способ пролонгированной профилактики холодового бронхоспазма у больных с "микст-патологией" -  патент 2460547 (10.09.2012)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

Патенты РФ в классе A61P35/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)


Наверх