индуктор секреторных антител iga и igg

Формула изобретения

1. Индуктор для индукции секреторных антител IgA и IgG, содержащий инактивированный антиген хантавируса; и

поли (I:С) или кристаллизованный порошок из раковин спизулы в качестве адъюванта.

2. Индуктор для индукции секреторных антител IgA и IgG по п.1 для введения на слизистую дыхательных путей.

3. Способ индукции вирус-специфичных антител IgA и IgG, включающий введение инактивированного антигена хантавируса вместе с поли (I:С) или кристаллизованным порошком из раковин спизулы в качестве адъюванта.

4. Способ индукции вирус-специфичных IgA и IgG антител по п.3, где введение включает нанесение на слизистую дыхательных путей.

5. Адъювант для инактивированного антигена хантавируса, содержащий поли (I:С) или кристаллизованный порошок из раковин спизулы.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу индукции продукции флавивирусспецифичных секреторных IgA и IgG антител при помощи назального введения инактивированной флавивирусной вакцины и адъюванта. Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения защиты от инфекции флавивирусами при помощи назального введения индуктора антител, который индуцирует продукцию секреторных IgA и IgG антител, а также индуктора антител для индукции секреторных IgA и IgG антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последние годы инфекционные заболевания, вызываемые флавивирусами, стали серьезной проблемой. Среди различных членов семейства Flaviviridae находятся вирусы, такие как вирус лихорадки Западного Нила, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус клещевого энцефалита и вирус гепатита С, вызывающие инфекционные заболевания, которые являются мировой проблемой.

Кроме того, инфекционные заболевания, вызванные хантавирусом, флавивирусом, также требуют серьезного внимания. В Японии на хантавирусную инфекцию впервые было обращено внимание общественности в середине 1970-х, когда сообщили, что некоторые разводчики крыс, работающие в частных лабораторных вивариях, больны лихорадкой неизвестного происхождения. Неизвестная на тот момент болезнь продолжала возникать до 1984 года: всего было сообщено о 127 случаях с одним смертельным случаем.

Вспышка заболевания случилась перед Второй Мировой Войной в бассейне реки Амур, которая образует границу Китая и бывшего Советского Союза. К тому же неизвестная лихорадка встречалась в ныне несуществующей японской армии во время их оккупации северно-восточного Китая (Манчжурии), и сообщалось о таком заболевании, как эпидемический геморрагический нефрозонефрит. Впоследствии стало известно и привлекло существенное внимание до 3200 случаев неизвестной лихорадки среди солдат ООН во время Корейской войны. Вирус, вызывающий заболевание, был впервые выделен доктором Ли (Lee) и коллегами из Корейского университета, Корея, из мышей Apodemus, пойманных в районе эпидемии. Вирус был назван в честь реки Хантаан, протекающей через район, где были пойманы мыши.

Как оказалось, все эти случаи эпидемии были вызваны одним и тем же агентом: вирусом Хантаана, относящимся к роду флавивирусов. В 1982 году в Японии, на конференции, посвященной этому заболеванию, Всемирная Организация Здоровья (ВОЗ) обобщенно назвала вновь выделенную группу сходных вирусов вирусами Хантаана, или родом хантавирусов, новым пятым родом семейств Bunyaviridae. В ВОЗ также было решено назвать заболевание геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (HFRS).

Инфекция хантавирусом является зоонозной инфекцией, вызываемой хантавирусом, который использует в качестве хозяина грызунов. Так вирус экскретируется с фекалиями и мочой грызунов. Большинство случаев инфицирования вызваны вдыханием вируса со свежими или высохшими фекалиями и мочой. Однако сообщалось о некоторых случаях среди людей, которые были укушены грызунами. Также считается, что заболевание передается посредством назального, глазного или орального контакта с инфекционными веществами, которые контактировали с грызунами.

Хантавирус, возбудитель HFRS, обнаружен по всему континенту Евразия и включает в качестве основного вида вирус Хантаана, первичными хозяевами которого являются Apodemus agrarius, грызуны, встречающиеся на Корейском полуострове, в Северном и Центральном Китае и на Дальнем Востоке России. Каждый год сообщается о десятках тысяч пациентов в Китае, нескольких тысячах в России и нескольких сотнях в Корее. Rattus norvegicus, общеизвестные как амбарные крысы, обнаружены по всему миру и являются носителями Сеульского вируса. Хотя не сообщалось о случаях инфицирования в Японии после вспышки 1984 года, которая произошла в виварии медицинской лаборатории, обиталища крыс по всей стране до сих пор остаются потенциальными носителями вируса. Таким образом, появление пациентов должно тщательно отслеживаться.

В 1993 году сообщалось о нескольких смертях, вызванных синдромом острой дыхательной недостаточности, сопровождавшейся отеком легких, среди индейцев навахо на юго-западе Соединенных Штатов. В отличие от HFRS заболевание не было связано с почечными симптомами, но зато вызывало острые дыхательные симптомы, приводящие к смертельному исходу в около 50% случаев. Тем не менее, вирус-возбудитель заболевания был определен как хантавирус. О заболевании, названном хантавирусный пульмональный синдром (HPS), сообщалось не только в Северной Америке, но также и в Южной Америке в 1995 году.

Считается, что хантавирусные инфекции, такие как HFRS и HPS, о которых сообщалось в Северной и Южной Америке, не передаются от человека к человеку. Однако в сентябре 1996 сообщалось о 18 случаях HPS в Южной Америке среди местных жителей и приезжих наряду с двумя другими случаями, когда люди контактировали с пациентами, но никогда не посещали этот район. Смертность достигла 50%. Тот факт, что никто из пациентов не имел возможности контактировать с грызунами, предполагал передачу заболевания от человека к человеку, что подтверждали и вирусологические свидетельства. Случай вызвал большое беспокойство, но вскоре эпидемия остановилась и с тех пор не появлялась.

Тем не менее, угроза хантавирусных инфекций, передающихся воздушно-капельным путем, таких как HFRS и HPS, которые передаются посредством крысиных фекалий, все еще существует: новая вспышка может случиться в любой момент, так как амбарные крысы и другие грызуны царят в среде обитания по всему миру. Фактически, как упоминалось ранее, каждый год сообщается о новых случаях в Китае, на Дальнем Востоке России и в Корее. Таким образом, существует большая необходимость в создании вакцин против хантавирусной инфекции.

Получение таких вакцин против инфекционного заболевания является крайне важной задачей в Китае, на Дальнем Востоке России и в Корее, где сообщается о ряде случаев каждый год.

Известно, что специфические антитела IgA, секретируемые слизистой, являются высоко эффективными для защиты от гриппа и других воздушно-капельных респираторных заболеваний. Антитела IgA, секретируемые слизистой, в первую очередь отвечают за перекрестный иммунитет против различных типов вируса гриппа. Считается, что антитела IgA, индуцируемые у человека, который был инфицирован вирусом гриппа и выздоровел, обеспечивают защиту от инфекции различными вирусами того же подтипа.

Одним из путей обеспечения неинфицированного человека защитой от инфицирования вирусами и другими патогенами является прививка вакциной, активированным антигеном вирусов или другими патогенами, для сознательной индукции антитела. Примерами таких вакцин являются противогриппозная вакцина, противохолерная вакцина, противотифозная вакцина, противооспенная вакцина и вакцина БЦЖ.

В частности, респираторные заболевания, такие как грипп и атипичная пневмония (SARS), вызываются инфекцией дыхательных путей и считается, что индукция иммунных ответов слизистой дыхательных путей путем введения вакцин является эффективным методом профилактики. Так как вакцины, введенные подкожной инъекцией, не вызывают индукции иммунных ответов слизистой, необходимо создать новые более эффективные вакцины, которые могут обеспечить перекрестный иммунитет. Одним из подходов к индукции секреторных IgA антител в слизистой дыхательных путей является назальное введение (прививка) антигенов. Однако введение только антигена не может вызвать достаточный иммунный ответ: для увеличения иммунного ответа совместно должен быть введен адъювант.

С учетом изложенного выше, как и грипп, флавивирусные инфекции, включая хантавирусные инфекции, такие как HFRS и HPS, могут по существу считаться респираторными инфекциями.

Таким образом, успешная индукция секреторных IgA антител в слизистой дыхательных путей и ассоциированных ответов антител IgG сыворотки должна обеспечить эффективную меру профилактики хантавирусных инфекций и других флавивирусных инфекций.

Хотя секреторные антитела IgA могут быть индуцированы в слизистой дыхательных путей путем введения инактивированных вирусных антигенов в слизистую, в частности на слизистую носа, инактивированные вирусные антигены требуют совместного введения адъюванта для усиления их активности в качестве вакцин.

На сегодняшний день было предложено большое число адъювантов для таких вакцин. Одним из примеров недавно опубликованных адъювантов является поли(I:C), полинуклеотидный олигомер инозиновой кислоты и цитидиловой кислоты (непатентный документ 1).

Сообщалось, что кристаллизованные порошки из раковин спизулы также служат природным адъювантом (патентный документ 1).

Патентный документ 1: Японская патентная заявка № 2004-1333268

Непатентный документ 1: J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002).

Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что инактивированные антигены флавивирусов, включая хантавирусы, введенные назально с вышеупомянутыми специфическими адъювантами, эффективно индуцируют секрецию антител IgA в слизистой и ответы антител IgG сыворотки, обеспечивая, таким образом, защиту от инфекции фатальными дозами флавивирусов, включая хантавирусы. Это исследование, в конечном счете, привело к настоящему изобретению.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблемы, которые решает настоящее изобретение

Таким образом, объектом изобретения является назальная вакцина, которая использует поли(I:C) и кристаллизованный порошок из раковин спизулы в качестве адъюванта и индуцирует продукцию секреторных IgA и IgG антител, специфичных для флавовирусов, включая хантавирусы. Другим объектом или другим аспектом данного изобретения является обеспечение метода для обеспечения защиты от флавивирусов при помощи индукции секреторных IgA и IgG антител.

Способы решения задачи

Для получения вышеупомянутых объектов настоящее изобретение, с одной стороны, относится к назальной вакцине, которая содержит инактивированный антиген флавивируса и поли(I:C) и кристаллизованный порошок из раковин спизулы в качестве адъюванта и эффективно индуцирует секрецию IgA антител.

Настоящее изобретение, с другой стороны, относится к способу индукции флавивирусспецифичных антител IgA и IgG, включающему введение инактивированного антигена флавивируса только с поли(I:C) или кристаллизованным порошком из раковин спизулы в качестве адъюванта. В частности, способ индукции секреторных антител IgA и IgG включает введение инактивированного антигена флавивируса и поли(I:C) или кристаллизованного порошка из раковин спизулы в слизистую дыхательных путей.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Назальная вакцина по настоящему изобретению, которая содержит инактивированный антиген флавивируса, включая хантавирусы, и поли(I:C) или кристаллизованный порошок из раковин спизулы, индуцирует продукцию как флавивирусспецифичных секреторных антител IgA в слизистой дыхательных путей, так и флавивирусспецифичных антител IgG.

Секреторные антитела IgA и IgG являются главными экзокринными патогенспецифическими иммуноглобулинами, которые играют значительную роль в защите поверхности слизистой от инфекции патогенами. Эти антитела имеются в избыточном количестве в слюне, носовых выделениях, выделений из желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей и в молозиве. Они также присутствуют в сыворотке. Введение вакцины по изобретению эффективно индуцирует продукцию этих антител IgA и IgG, обеспечивая, таким образом, защиту от инфекции флавивирусами.

НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Поли(I:C), используемый в качестве адъюванта в индукторе секреторных антител IgA или IgG, по настоящему изобретению является двухцепочечной РНК, которая служит лигандом для toll-рецепторов (TLR) и стимулирует систему врожденного иммунитета к обеспечению защитного иммунитета против бактерий, вирусов и других патогенных микроорганизмов.

Когда двухцепочечные РНК, которые являются лигандами для TLR, такие как поли(I:C), вводятся с вакциной в качестве адъюванта, они усиливают защиту от инфицирования патогенами не при помощи усиления эффектов вакцины, а скорее при помощи усиления защитного иммунитета против бактерий, вирусов и других патогенов, в частности при помощи индукции антител IgA и антител IgG, специфичных для вирусов и бактерий.

В то время как поли(I:C), двухцепочечная РНК по настоящему изобретению могут отличаться по размеру молекулы, как измерено, по количеству пар оснований (п.о.), было показано, что поли(I:C) должен иметь размер молекулы в 300 п.о. или более, чтобы эффективно стимулировать иммунные ответы. Поли(I:C), который составляет от 100 до 1000 п.о., поставляются от Toray Industries Inc.

Кристаллизованный порошок из раковин спизулы, один из адъювантов вакцин, используемый в индукторе секреторных антител IgA и IgG по настоящему изобретению, является пористым мелким порошком, полученным при помощи прокаливания раковин спизулы. Известно, что растворы этого вещества обладают обеззараживающей или антибактериальной активностью, а также способностью удалять токсические вещества, присутствующие в следовых количествах, такие как остаточные пестициды. Такие кристаллизованные порошки из раковин спизулы доступны в качестве коммерческих изделий.

При наблюдении при помощи электронной микроскопии оказывается, что кристаллизованный порошок из раковин спизулы, используемый в качестве адъюванта по настоящему изобретению, является пористым мелким порошком, который состоит из 10-100-микрометровых неравномерных структур. Пористое вещество выступает в качестве носителя вакцины, которая стимулирует антигенпрезентирующие клетки.

Вакцина для использования в индукторах секреторных антител IgA и IgG по настоящему изобретению, которая вводится с поли(I:C) или кристаллизованным порошком из раковин спизулы в качестве адъюванта, является антигенной суспензией или раствором, в основном содержащим инфекционный агент или его фрагмент или часть и индуцирующим активный иммунитет при введении в организм. Антигенный фрагмент или часть, который составляет вакцину, может быть микроорганизмом или природным продуктом, очищенным из микроорганизма (такого как вирусы и бактерии), или синтетическим или генетически модифицированным белком, пептидом, полисахаридом или другими продуктами.

Одним из конкретных примеров живой или инактивированной вакцины для применения по настоящему изобретению является вакцина для флавивирусных инфекций.

Использованный в данном случае термин «инактивированный антиген» относится к антигену, который утратил свою способность инфицировать новых хозяев. Термин включает вирионы (цельные вирусные частицы), неполные вирусные частицы, компоненты вириона и продукты их посттранляционной модификации, белки, не входящие в состав вириона, и продукты их посттранляционной модификации, защитные антигены и нейтрализованные эпитопы. Эти антигены могут быть инактивированы физически (например, при помощи рентгеновского облучения, тепла или разрушения ультразвуком) или химически (например, при помощи обработки формалином, ртутью, спиртом или хлором).

Индуктор секреторных антител IgA и IgG по настоящему изобретению предпочтительно наносится на слизистую. Слизистая у позвоночных выстилает полость полых органов, которые контактируют с внешней средой, например органы пищеварения, органы дыхания, органы выделения и органы размножения. Таким образом, нанесение на слизистую, предпочтительный путь введения по настоящему изобретению, включает введение в полость носа, ротовую полость, влагалище, верхние дыхательные пути и легочные альвеолы. Особенно предпочтительным является введение на слизистую носа. Поскольку полость носа служит местом доступа респираторной инфекции флавивирусами, включая хантавирусы, введение индуктора антител по данному изобретению на слизистую обеспечивает эффективную защиту от респираторных инфекций благодаря индукции эпителиальных клеток слизистой к выделению антител IgA и индукции продукции антител IgG сыворотки.

Патогенами, против которых индуцируется продукция секреторных антител IgA и IgG по данному изобретению для обеспечения иммунной защиты, являются микроорганизмы, которые вызывают заболевания или нарушения у хозяев. В частности, этими патогенами являются флавивирусы, включая вирус лихорадки Западного Нила, хантавирус, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус клещевого энцефалита и вирус гепатита С.

В то время как доза индуктора секреторных антител IgA и IgG по настоящему изобретению может изменяться в зависимости от возраста и массы человека и пути введения, суточная доза для взрослого обычно составляет в пределах от около 10 до 500 мг при пероральном введении. Суточная доза для взрослого человека при нанесении на слизистую, в частности при назальном введении, обычно составляет в пределах от около 0,1 до 10 мг и предпочтительно в пределах от около 0,1 до 1 мг.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на конкретные примеры.

Пример 1: Стимуляция продукции IgA и IgG при помощи синтетических двухцепочечных РНК поли(I:C).

Была установлена способность инактивированного антигена (инактивированный вирус или субъединица антигена) индуцировать нейтрализующие антитела и индуцировать, таким образом, защиту от патогенов в присутствии синтетических двухцепочечных РНК поли(I:C) в качестве адъюванта.

(Материалы)

Мыши: линия BALB/c (6 недель, женская)

Вирус: штамм хантавируса (полученный из Центра наблюдения за инфекционными заболеваниями (Токио))

Вакцина: штамм хантавируса (Центр наблюдения за инфекционными заболеваниями); вакцина, инактивированная эфиром

Адъюванты: СТВ* в качестве положительного контроля (СТВ (токсическая субъединица В холеры), содержащая 0,1% СТ (холерный токсин) и поли(I:C)

(Метод)

Шестинедельные мыши BALB/c (Японская SLC, Токио) были разделены на группы по 5 животных. Каждой группе в полость носа было введено 5 мкл раствора, содержащего 1 мкг хантавирусной вакцины только с 0,1 мкг, 1 мкг, 3 мкг или 10 мкг адъюванта поли(I:C). По прошествии 3 недель каждой группе в полость носа ввели то же количество вакцины с или без адъюванта. По прошествии еще 2 недель животных инфицировали хантавирусом при помощи введения в каждую полость носа 1,2 мкл раствора, содержащего 100 бляшкообразующих единиц хантавируса.

В качестве контрольных служили группы, получающие только 10 мкг или 1 мкг поли(I:C), только вакцину или необрабатываемые группы.

Через 3 дня после инфекцирования были собраны смыв из полости носа и сыворотка. Был проведен количественный анализ IgA смыва из полости носа и IgG сыворотки при помощи ELISA. Титр вируса смыва из полости носа был определен при помощи анализа бляшкообразования с использованием клеток MDCK.

Между тем, мыши были назально иммунизированы таким же образом и привиты 20 мкл раствора, содержащего летальную дозу хантавируса (40LD₅₀, 10^4,7EIO⁵⁰ (Приблизительно в 10000 раз большее количество вируса чем то, которое может инфицировать 50% оплодотворенных куриных яиц)). Был отслежена выживаемость животных.

Чтобы исследовать безопасность поли(I:C) для центральной нервной системы, при помощи двухступенчатой иглы в мозг было введено 0,25 мкг, 2,5 мкг и 25 мкг поли(I:C) в 25 мкл PBS. Были отслежены вес и выживаемость животных после прививки.

Группы, привитые в мозг 2,5 мкг, 10 мкг и 25 мкг СТВ* (СТВ, содержащий 0,1% СТ) в 25 мкл PBS, служили в качестве контрольных.

(Результаты)

(1) Индукция антител и защита от инфекции при помощи введения назальной хантавирусной вакцины с адъюванта поли(I:C)

Была оценена активность поли(I:C) как адъюванта слизистой. За шесть недель до этого было назально введено 1 мкг и 0,1 мкг вакцины на 10 мкл поли(I:C). Та же доза вакцины, с или без адъюванта, была назально введена за 2 недели до этого. Ответы IgA антител в слизистой носа и ответы IgG сыворотки были количественно проанализированы и суммированы в таблице 1.

Таблица 1
Вакцина	Ответ IgA антител (смыв из полости носа) Среднее (нг/мл)	Продукция IgG (сыворотка) Среднее (мкг/мл)
Первичная иммунизация	Вторичная иммунизация
Вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)	Вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)
1	10	1	10	255,6	4,36
1	10	1	-	92,5	2,79
1	3	1	3	62,3	1,58
1	3	1	-	121,8	2,56
1	1	1	1	121,9	1,58
1	1	1	-	0,5	0,41
1	0,1	1	0,1	14,4	1,00
1	0,1	1	-	9,6	0,38
1	-	1	-	0	0,60
1	Денатурировано 1	1	Денатурировано 1	20,4	0,69
-	-	-	-	0	0

Чтобы определить, возрастает ли адъювантная активность поли(I:C) дозозависимо, дозу поли(I:C) ступенчато увеличивали от 0,1 мкг до 10 мкг.

Как можно видеть из результатов в таблице 1, ответы IgA антител были индуцированы в слизистой носа, когда во время исходной иммунизации было введено 0,1 мкг или более поли(I:C).

Результаты показывают, что количество IgA, индуцированного в слизистой носа, зависело от дозы поли(I:C): адъювантная активность возрастала по мере увеличения дозы поли(I:C).

Когда поли(I:C) использовали в каждой из двух иммунизаций, выделялось 100 нг/мл или более IgA в смыве из полости носа с дозой поли(I:C) 1 мкг. Когда поли(I:C) использовали только при первой иммунизации, 100 нг/мл или более специфичных IgA антител были индуцированы дозой поли(I:C) 3 мкг.

Продукция IgG сыворотки также была исследована, и была показана корреляция с выделением IgA: две иммунизации 1 мкг вакцины и поли(I:C), сделанные с 4-недельным интервалом, привели к продукции 1,6 мкг/мл IgG сыворотки.

Когда животные были заражены хантавирусом через 2 недели после второй иммунизации с теми же условиями иммунизации при помощи введения 1,2 мкл раствора, содержащего 100 бляшкообразующих единиц хантавируса, в каждую полость носа, в смыве из полости носа у невакцинированной контрольной группы был титр в 10 ² бляшкообразующих единиц/мл или выше.

В отличие от этого вирусный рост был полностью подавлен в группах, получавших две назальные вакцинации, каждая с сопровождением поли(I:C). Вирусный рост не был подавлен как в группе, получавшей две вакцинации, каждая с 1 мкг или более только вакцины, так и в группе, получавшей две вакцинации, только первая из которых давалась с 3 мкг или более поли(I:C).

Вирусный рост был значительно подавлен до 10^0,8 бляшкообразующих единиц/мл и 10^1,6 бляшкообразующих единиц/мл в группах, в которых только первая вакцинация сопровождалась 1 мкг и 0,1 мкг поли(I:C) соответственно. Вирусный рост не был подавлен в группе, получавшей две вакцинации, каждая из которых включала только вакцину.

Эти результаты суммированы в таблице 2.

Таблица 2
Вакцина	Титр вируса в смыве из полости носа (Среднее) (бляшкообразу- ющих единиц/мл:10n)
Первичная иммунизация	Вторичная иммунизация
Вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)	Вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)
1	10	1	10	<1*
1	10	1	-	<1*
1	3	1	3	<1*
1	3	1	-	<1*
1	1	1	1	<1*
1	1	1	-	0,8*
1	0,1	1	0.1	1,2*
1	0,1	1	-	1,6*
1	-	1	-	3,0
1	Денатурировано 1	1	Денатурировано 1	2,9
-	-	-	-	3,1
*: p<0,001

(2) Защита от пневмонии, вызванной летальной дозой хантавируса, при помощи введения назальной вакцины с поли(I:C)

За 6 недель до этого был назально введен 1 мкг вакцины с 10 мкг, 3 мкг или 1 мкг поли(I:C). За 2 недели до этого был дан активатор только с вакциной. Затем животные были простимулированы 40LD ₅₀ дозой хантавируса в 20 мкл раствора и были исследованы на защиту от пневмонии.

В невакцинированной группе все животные умерли (5/5) в течение недели. В этой группе титр вируса в легком достигал 10⁶ бляшкообразующих единиц или выше через 3 дня после стимуляции.

В отличие от этого в каждой из вакцинированных групп, получавших только вакцину с 1 мкг или более поли(I:C), все животные выжили.

Эти результаты показаны в таблице 3.

Таблица 3
Вакцина	Стимуляция (40LD50)	Легочный титр вируса (pfu/mL:10 )	Выжив-шие/общее
Первичная иммунизация	Вторичная иммунизация
Вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)	Вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)
1	10	1	10	Вирус	<0	5/5
1	10	1		Вирус	N.D.	5/5
1	3	1		Вирус	N.D.	5/5
1	1	1		Вирус	N.D.	5/5
1	CTB*	1	CTB*	Вирус	<0	5/5
-	-	-	-	Вирус	6,1±5,3	0/5

Вышеупомянутые наблюдения показывают, что поли(I:C) индуцирует ответы антител IgA слизистой при помощи индукции продукции секреторных антител IgA, достаточных для защиты от инфекции.

Пример 2: Защита, обеспеченная назальной хантавирусной вакциной, состоящей из инактивированных вирусных частиц и поли(I:C).

(Материалы)

Вакцина: хантавирусная НА вакцина, инактивированная эфиром; цельновирионная NC вакцина, инактивированная формалином

Мыши: линия BALB/c (6 недель, женская)

(Метод)

Назальная хантавирусная вакцина, содержащая 0,1 мкг цельновирионной NC хантавирусной вакцины, инактивированная формалином, и 0,1 мкг поли(I:C) (100-1000 п.о.; Toray Industries Inc.) была введена мышам BALB/c (6 недель, женская). По прошествии 3 недель была опять введена та же вакцина.

Еще через неделю были определены ответы антител в смыве из полости носа и в сыворотке мышей, как показатели защитного иммунитета слизистой и системного защитного иммунитета соответственно.

(Результаты)

Результаты показаны в таблице 4.

Таблица 4
Первичная вакцинация (0 недель)	Вторичная вакцинация (3 недели)	Анти-HA IgA смыва из полости носа (Среднее) (2 n)	Анти-HA сывороточный-IgA (Среднее) (4n)
NC вакцина (0,1 мкг)	(0,1 мкг)	NC вакцина (0,1 мкг)	(0,1 мкг)
Обработанный эфиром HA		Обработанный эфиром HA		1,4	3,1
Обработанный эфиром HA	Поли(I:C)	Обработанный эфиром HA	Поли(I:C)	1,9	4,2
Полная вирусная частица		Полная вирусная частица		5,0	5,3
Полная вирусная частица	Поли(I:C)	Полная вирусная частица	Поли(I:C)	7,8	6,2
Обработанный эфиром HA	CTB*	Обработанный эфиром HA	CTB*	7,1	6,9
Первичная вакцинация (0 недель)	Вторичная вакцинация (3 недели)	Анти-NA IgA (смыва из полости носа (Среднее) (2n )	Анти-NA сывороточный-IgA (Среднее) (4n)
NC вакцина (0,1 мкг)	(0,1 мкг)	NC вакцина (0,1 мкг)	(0,1 мкг)
Обработанный эфиром HA		Обработанный эфиром HA		1,1	0,9
Обработанный эфиром HA	Поли(I:C)	Обработанный эфиром HA	Поли(I:C)	1,5	2,9
Полная вирусная частица		Полная вирусная частица		3,5	3,7
Полная вирусная частица	Поли(I:C)	Полная вирусная частица	Поли(I:C)	5,4	5,4
Обработанный эфиром HA	CTB*	Обработанный эфиром HA		6,2	6,2

Результаты таблицы показывают, что защитный иммунитет слизистой и системный защитный иммунитет был повышен при помощи хантавирусной вакцины с использованием полных вирусных частиц в сочетании с поли(I:C).

Также было показано, что 0,1 мкг вакцина, использованная в сочетании с 0,1 мкг поли(I:C), вызывала ответы, сравнимые с таковыми в положительной контрольной группе, получавшей вакцину из продукта расщепления и СТВ*, сочетание, которое получает высокую адъювантную активность, для обеспечения эффективной защиты от вирусной инфекции.

Эти ответы даже больше, чем ответы, наблюдаемые с вакциной из продукта расщепления в сочетании с поли(I:C).

Эти наблюдения показывают, что назальная вакцина, содержащая вакцину из продуктов расщепления или другие типы вакцин, столь же эффективны, если они используются с поли(I:C).

Пример 3: Размер молекулы поли(I:C).

(Материалы)

Вирус: Хантавирус

Поли(I:C):

Размер (L): 1 до 300 п.о. (Fluka)

Размер (M): 100 до 1000 п.о. (Toray)

Размер (H): >3,3×10⁶ п.о. (Fluka)

Поли(A:U)

Мыши: линия BALB/c (6 недель, женская)

(Метод)

Вакцина из продуктов расщепления хантавируса (0,4 мкг) была введена назально мышам BALB/c (6 недель, женская) с 0,1 мкг поли(I:C) различных размеров. По прошествии 3 недель была опять введена та же вакцина.

Еще через неделю были определены ответы антител на НА и NA в смыве из носовой полости и сыворотке мышей, как показатели защитного иммунитета слизистой и системного защитного иммунитета соответственно.

(Результаты)

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5
Первичная вакцинация (0 недель)	Вторичная вакцинация (3 недели)	Анти-HA IgA (смыва из полости носа (Среднее) (2n )	Анти-HA сывороточный-IgA (Среднее) (4n)
NC вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)	NC вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)
0,4	0,1(M)	0,4	0,1(M)	3,2	5,4
0,4	0,1(H)	0,4	0,1(H)	3,3	5,8
0,4	0,1(L)	0,4	0,1(L)	2,3	5,7
Первичная вакцинация (0 недель)	Вторичная вакцинация (3 недели)	Анти-NA IgA (смыва из полости носа (Среднее) (2n )	Анти-NA сывороточный-IgA (Среднее) (4n))
NC вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)	NC вакцина (мкг)	Поли(I:C) (мкг)
0,4	0,1(M)	0,4	0,1(M)	2,2	4,2
0,4	0,1(H)	0,4	0,1(H)	2,4	4,1
0,4	0,1(L)	0,4	0,1(L)	1,2	3,8

Как можно видеть из результатов, представленных в таблице, группы, получавшие поли(I:C) с размером молекулы 10-300 п.о., проявляли более низкие ответы слизистой, чем другие группы, что показывает, что поли(I:C) должен иметь размер молекулы от приблизительно 300 п.о. или более, чтобы вести себя как эффективный адъювант.

Пример 4: Индукция антител и защита от инфекции при помощи назальной вакцины с использованием кристаллизованного порошка из раковин спизулы в качестве адъюванта.

1. Материалы

Были использованы следующие материалы:

Мыши: Линия BALB/c (6 недель, женская)

Вирус: штамм хантавируса (полученный из Центра наблюдения за инфекционными заболеваниями (Токио)

Вакцина: вакцина из штамма хантавируса (Центр наблюдения за инфекционными заболеваниями), инактивированная эфиром

Адъюванты: СТВ* в качестве положительного контроля (СТВ (токсическая субъединица В холеры), содержащая 0,1% СТ (холерный токсин) и кристаллизованный порошок из раковин спизулы

2. Метод

Шестинедельные мыши BALB/c были разделены на группы по 5 животных.

Каждому животному было назально введено 3 мкг вакцины в 5 мкл раствора с 10 мкг или 100 мкг адъюванта кристаллизованного порошка из раковин спизулы. По прошествии 3 и 5 недель были назально введены те же дозы вакцины и адъюванта. По прошествии еще 2 недель животных инфицировали хантавирусом при помощи введения в каждую полость носа 1,2 мкл раствора, содержащего 100 бляшкообразующих единиц хантавируса.

Группа, получавшая 1 мкг СТВ* (СТВ (токсическая субъединица В холеры), содержащий 0,1% СТ (холерный токсин), служила в качестве положительного контроля для адъюванта. В качестве контрольных служили группы, получавшие только 3 мкг, или необрабатываемые.

Через 3 дня после заражения были собраны смыв из полости носа и сыворотка. Был проведен количественный анализ IgA смыва из полости носа и IgG сыворотки при помощи ELISA. Титр вируса смыва из полости носа был определен при помощи анализа бляшкообразования с использованием клеток MDCK.

Между тем, мыши были назально иммунизированы таким же образом и привиты 20 мкл раствора, содержащего летальную дозу хантавируса (40LD₅₀, 10^4,7). Был отслежена выживаемость животных.

3. Результаты

Активность кристаллизованного порошка из раковин спизулы как адъюванта слизистой была оценена следующим способом. За шесть недель до этого были назально введены 3 мкг вакцины и 10-100 мкг кристаллизованного порошка из раковин спизулы. Далее следовало два назальных введения тех же доз вакцины и адъюванта с 2-недельным интервалом. Ответы антител IgA в слизистой носа и ответы сыворотки IgG были количественно проанализированы.

Чтобы определить, изменяется ли адъювантная активность кристаллизованного порошка из раковин спизулы дозозависимо, кристаллизованный порошок из раковин спизулы давали в двух разных дозах по 10 мкг и 100 мкг. Оказалось, что 10 мкг кристаллизованного порошка из раковин спизулы индуцировало ответы IgA антител в слизистой полости носа. Количество IgA антител, индуцированных в слизистой полости носа, зависело от дозы кристаллизованного порошка из раковин спизулы: адъювантная активность возрастала, когда дозу кристаллизованного порошка из раковин спизулы повышали до 100 мкг.

Животных инфицировали вирусом PR8 через 2 недели после третьей иммунизации при тех же условиях иммунизации введением 1,2 мкл раствора, содержащего 100 бляшкообразующих единиц вируса в каждую полость носа. В смыве из полости носа у невакцинированной контрольной группы был титр в 10³ бляшкообразующих единиц/мл или выше. В отличие от этого вирусный рост был полностью подавлен в группах, получавших три назальные вакцинации, каждая в сопровождении кристаллизованного порошка из раковин спизулы. Вирусный рост не был подавлен в группе, получавшей две вакцинации, каждая с 1 мкг или более только вакцины, так и в группе, получавшей три вакцинации, каждая из которых состояла только из 3 мкг вакцины.

Эти результаты показывают, что кристаллизованный порошок из раковин спизулы ведет себя как мощный адъювант.

Результаты суммированы в таблице 6.

Таблица 6
Вакцина	Анти-HA IgA (Смыв из полости носа) Среднее (мкг/мл)	Анти-HA IgG (сыворотка) Среднее (мкг/мл)	Титр вируса в смыве из полости носа (Среднее) (бляшкообразующих единиц/мл:10n)
Вакцина (мкг)	Керамифицированный порошок из раковин спизулы (мкг)
3	100	0,5	27,1	<1*
3	10	0,15	10,0	<1*
1	CTB*	1,20	23,1	<1*
3	-	0	<0,1	3,3
-	-	0	0	3,2

*: p<0,05

Принимая во внимание индуцированный подкласс антител IgG сыворотки, преимущественно индуцируется антитело IgG₁ по сравнению с антителом IgG_2a, показывая преобладание Th2 иммунных ответов. Эти результаты показаны в таблице 7.

Таблица 7
Вакцина	Титр антител (2n) (Среднее)	Отношение Th1/Th2 (IgG1/IgG2a)
Вакцина (мкг)	Керамифицированный порошок из раковин спизулы (мкг)
IgG1	IgG2a
3	100	15,0	7,6	1,97
3	10	14,4	7,1	2,03
1	CTB*	17,0	13,8	1,23

Пример 5: Инфекция новорожденных мышей

Новорожденные мыши были заражены в инфекционном эксперименте.

Новорожденным мышам назально вводили антиген (хантавирус) и поли(I:C) в качестве адъюванта, и измеряли титр антител.

В частности, группе животных вводили 1 мкг антигена и 10 мкг поли(I:C) дважды за 3-недельный интервал. Ответы антител в смыве из полости носа и сыворотке мышей были количественно измерены через неделю. Было определено, что титр антител IgA в 1 мл смыва из полости носа составил около 200 нг/мл, а титр антител IgG сыворотки составил 3-4 мкг/мл.

Другой группе животных был введен 1 мкг антигена и 3 мкг поли(I:C) дважды за 3-недельный интервал. Ответы антител в смыве из полости носа и сыворотке мышей были количественно измерены через неделю. Было определено, что титр антител IgA в 1 мл смыва из полости носа составил около 100 нг/мл, а титр антител IgG сыворотки составил 2-3 мкг/мл.

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Как было указано, назальное введение инактивированной флавивирусной вакцины с поли(I:C) или кристаллизованным порошком из раковин спизулы в качестве адъюванта индуцирует секрецию IgA и IgG антител, специфичных для флавивирусов, и обеспечивает защиту от вирусов и других патогенов.

В сложившейся ситуации, когда не доступны эффективные адъюванты вакцин, настоящее изобретение имеет существенную медицинскую значимость, так как оно может применяться к вакцинам, наносимым на слизистую, против других патогенов.