белоксвязывающие производные метотрексата и содержащие их лекарства

Формула изобретения

1. Производное метотрексата структурной формулы I



где

R₁=H или СН₃ ,

R₂=H или СООН,

P₁=лизин, метионин,

Р₂=фенилаланин,

Р₃ =D-аланин, аланин,

Хаа=аргинин,

m=0,

n=0-5,

о=0-2,

P=1-10,

РМ представляет собой малеинимидную группу.

2. Производное метотрексата по п.1, где n=4.

3. Производное метотрексата по п.1, где R₁=СН₃.

4. Производное метотрексата по п.1, где R₂=COOH и р=4.

5. Производное метотрексата по п.1, где P₁=лизин.

6. Производное метотрексата по п.5, где Р₃=D-аланин.

7. Производное метотрексата по п.5, где Р₃=аланин.

8. Производное метотрексата по п.1, где P₁=метионин и P₃=аланин.

9. Производное метотрексата по пп.1-8, где о=0.

10. Производное метотрексата по пп.1-8, где о=2.

11. Способ получения производных метотрексата по любому из предшествующих пунктов, где производное метотрексата, имеющее общую структурную формулу II



где R₁=СН₃, Н или СОСF ₃

R₂=С(СН₃)₃, алкоксизамещенная бензильная группа или

триалкилсилильная группа,

подвергают взаимодействию в присутствии реагента для активации карбоновой кислоты с добавлением катализаторов / вспомогательных оснований со звеном «сшивающий агент - пептид» общей структурной формулы III



где R₃=Н, СООН или COOtBu,

P₁=лизин, метионин,

Р₂=фенилаланин,

P₃=D-аланин, аланин,

Хаа=аргинин,

m=0,

n=0-5,

о=0-2,

p=1-10,

РМ представляет собой малеинимидную группу,

где возможные нуклеофильные группы, возможно защищенные защитными группами, присутствуют в P₁, Р₂ и Хаа,

и на второй стадии обрабатывают кислотой возможно с добавлением катионудаляющих реагентов.

12. Способ по п.11, где реагент для активации карбоновой кислоты выбран из группы, состоящей из N,N'-диизопропилкарбодиимида, N,N'-дициклогексилкарбодиимида, (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония гексафторфосфата, 2-хлор-1-метилпиридиния иодида и O-(азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата.

13. Способ по п.11, где катализатор/вспомогательное основание выбрано из группы, состоящей из триалкиламинов, пиридина, 4-диметиламинопиридина (DMAP) и гидроксибензотриазола (HOBt) или их сочетания.

14. Способ по любому из пп.11-13, где O-(азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат в сочетании с N-этилдиизопропиламином используется в качестве реагента для активации карбоновой кислоты.

15. Способ по п.11, где хлороводород используется в качестве кислоты на второй стадии.

16. Способ по п.11, где трифторуксусная кислота используется в качестве кислоты на второй стадии.

17. Способ по п.11, где на второй стадии катионудаляющий реагент выбран из группы, состоящей из воды, фенола, тиоанизола, диизопропилсилана и 1,2-этандитиола или их сочетания.

18. Способ по п.11, где метотрексат- -трет-бутиловый эфир подвергают взаимодействию с трифторацетатом ((((6-малеинимидогексаноил)-D-аланил)фенилаланил)-трет-бутоксилкарбониллизил)-лизина при использовании O-(азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата в сочетании с N-этилдиизопропиламином и обрабатывают трифторуксусной кислотой на второй стадии.

19. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью антагониста фолиевой кислоты, содержащая эффективное количество производного метотрексата по любому из пп.1-10 возможно вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым вспомогательным агентом.

20. Применение производного метотрексата по любому из пп.1-10 для лечения раковых заболеваний.

21. Применение производного метотрексата по любому из пп.1-10 для лечения ревматических заболеваний.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к производным метотрексата и пептидным производным метотрексата, которые содержат белоксвязывающую группу и могут быть ферментативно расщеплены в теле, так что высвобождается активное соединение или низкомолекулярное производное активного соединения, к способу получения производных метотрексата, их применению и лекарствам, содержащим производные метотрексата.

Метотрексат (MTX) представляет собой антагонист фолиевой кислоты, используемый при лечении опухолей и ревматоидного артрита. Его применение ограничено рядом побочных эффектов (например, головокружением, выпадением волос, стоматитом, желудочно-кишечными симптомами, повышенной восприимчивостью к инфекциям). Для улучшения профиля побочных эффектов и эффективности MTX и производных MTX высокомолекулярные транспортные формы MTX были созданы в ходе связывания активного соединения с синтетическими полимерами, такими как поли(этиленгликоль) (Riebeseel, К.; Biedermann, Е.; Löser, R.; Breiter, N.; Hanselmann, R. et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 773-785), сополимеры гидроксипропилметакрилата (HPMA) (Subr, V.; Strohalm, J. et al. Controlled Release 1997, 49, 123-132) или человеческий сывороточный альбумин (HSA) (Wunder, A.; Muller-Ladner et al., J. Immunol. 2003, 170, 4793-4801; Wunder, A.; Stehle, G. et al., Int. J. Oncol. 1997, 11, 497-507). Однако еще существует потребность в новых системах, содержащих MTX или производные MTX, которые обладают низким профилем побочных эффектов и существенно улучшенной эффективностью по сравнению со свободным MTX.

Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в создании пролекарств метотрексата, высвобождающих MTX или производные MTX в опухолевой ткани или ревматоидной ткани.

Данная техническая проблема решена в воплощениях, охарактеризованных в формуле изобретения.

В частности предложены производные метотрексата общей структурной формулы

где R₁=Н или CH₃ , R₂=Н или COOH, P₁-P₃=L- или D-аминокислоты, X_aa представляет собой аминокислоту, опосредующую растворимость, m=0-6, n=0-5, o=0-2, р=1-10, и PM представляет собой белоксвязывающую группу.

Согласно настоящему изобретению включенная, гидролитически или ферментативно расщепляемая, предопределенная точка разрыва позволяет высвободить активное соединение или производное "спейсер-активное соединение" in vivo регулируемым образом, так что производные метотрексата по настоящему изобретению составляют пролекарства.

Производные MTX по настоящему изобретению состоят из противоракового или противоревматического компонента метотрексата, молекулы спейсера, пептидной цепи и гетеробифункционального сшивающего агента. Данная структурная модель будет подробно описана ниже.

Противораковый компонент MTX по настоящему изобретению представляет собой активное соединение общей структурной формулы

где R₁=CH₃ или H.

Предпочтительное активное соединение представляет собой метотрексат. Молекула спейсера по настоящему изобретению представляет собой диамин общей структурной формулы

где R₂=Н или COOH,

p=1-10.

Предпочтительными спейсерами являются этилендиамин (R₂=H, p=1) и спейсер, в котором p=4 или 5. Особенно предпочтительным спейсером является L-лизин (R ₂=COOH, P=4).

В настоящем изобретении пептид состоит из расщепляемой ферментативным путем последовательности и N-концевого опосредующего растворимость компонента и имеет общую структурную формулу

где Р₁-Р₃=L- or D-аминокислоты,

X_aa = аминокислота со щелочной боковой цепью,

о=0-2.

В настоящем изобретении аминокислота P₁ выбрана из аминокислот лизин, метионин, аланин, пролин и глицин. Аминокислота Р₂ выбрана из аминокислот лейцин, фенилаланин, метионин, аланин, пролин и тирозин. Аминокислота Р₃ выбрана из аминокислот D-аланин, аланин, D-валин, валин, лейцин и фенилаланин. Предпочтительные аминокислоты в положении Р₁ представляют собой лизин, аланин и метионин. Предпочтительные аминокислоты в положении Р₂ представляют собой фенилаланин, метионин, аланин и тирозин. Предпочтительные аминокислоты в положении Р₃ представляют собой D-аланин, аланин, D-валин, валин и фенилаланин.

Особенно предпочтительные пептидные последовательности перечислены в таблице ниже.

Р3	Р2	P1
D-Ala	Phe	Lys
Ala	Phe	Lys
D-Val	Leu	Lys
Val	Leu	Lys
Ala	Phe	Met
Phe	Ala	Met
Ala	Met	Met
Phe	Met	Met

Согласно настоящему изобретению группа X_aa, опосредующая растворимость, предпочтительно выбрана из аминокислот аргинин, лизин и гистидин. Особенно предпочтительная группа представляет собой аргинин.

В настоящем изобретении гетеробифункциональный сшивающий агент представляет собой карбоновую кислоту, имеющую белоксвязывающую группу, общей структурной формулы

где m=0-6,

n=0-5,

PM = белоксвязывающая группа.

Белоксвязывающая группа (PM) предпочтительно выбрана из 2-дитиопиридильной группы, галогенацетамидной группы, галогенацетатной группы, дисульфидной группы, эфирной группы акриловой кислоты, моноалкильной эфирной группы малеиновой кислоты, моноалкильной амидной группы малеиновой кислоты, N-гидрокси сукцинимидильной эфирной группы, изотиоцианатной группы, азиридиновой группы или малеинимидной группы. Особенно предпочтительной белоксвязывающей группой является малеинимидная группа.

Предпочтительные сшивающие агенты характеризуются m=3 и n=1, а также m=0 и n=4.

Согласно настоящему изобретению активное соединение и молекула спейсера соединены амидной связью между -карбоксильной группой активного соединения и первичной аминогруппой молекулы спейсера. Связь между молекулой спейсера и звеном сшивающий агент-пептид состоит из амидной связи между вторичной аминогруппой молекулы спейсера и C-концевой карбоксильной группой звена сшивающий агент-пептид. Связь между сшивающим агентом и пептидной цепью состоит из амидной связи между N-концом пептидной цепи и карбоксильной группы сшивающего агента.

Существенное свойство производных MTX по настоящему изобретению состоит в том, что связь между молекулой спейсера и сшивающим агентом может быть расщеплена ферментативным путем, в результате чего возможно контролируемое высвобождение активного соединения или производного активное соединение - спейсер в опухолевой ткани или ревматоидной ткани. Протеазы, такие как катепсины или плазмин, сверхэкспрессированы во многих опухолях человека и ревматоидной ткани, таким образом представляя идеальную цель заявки для ориентированной мишенью ферментативной активации пролекарств (Yan, S. et al., Biol. Chem. 1998, 2, 113-123; Leto, G. et al., Clin. Exp. Metastasis 2004, 91-106; Sloane, B..F.; Yan, S. et al., Seminars in Cancer Biology, 2005, 15, 149-157; Dano, K.; Behrendt, N. et al., Thrombosis & Haemostasis 2005, 93, 676-681; Hashimoto, Y.; Kakegawa, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, 283, 334-339; Ikeda, Y.; Ikata, T. et al., J. Med. Invest. 2000, 47, 61-75). Кроме того, производные MTX по настоящему изобретению показывают быстрое расщепление в экспериментальных гомогенатах опухоли и синовиальных жидкостях у пациентов, страдающих ревматоидным артритом (см. примеры 4 и 5).

Производные MTX по настоящему изобретению предпочтительно получают в ходе конденсации производных метотрексата общей структурной формулы

где R₁=CH₃, Н или COCF₃

R₂=C(CH₃ )₃, алкоксизамещенная бензильная группа или триалкилсилильная группа,

со звеном сшивающий агент-пептид общей структурной формулы

где R₃=H, COOH или COOtBu,

Р₁=лизин, метионин, аланин, пролин или глицин,

Р₂=лейцин, фенилаланин, метионин, аланин, пролин или тирозин,

Р₃=D-аланин, аланин, D-валин, валин, лейцин или фенилаланин,

X_aa=аминокислота со щелочной боковой цепью,

m=0-6,

n=0-5,

o=0-2,

p=1-10,

PM представляет собой белоксвязывающую группу,

где возможные нуклеофильные группы необязательно защищены в Р₁, Р₂ и X_aa защитными группами, известными квалифицированному специалисту.

Согласно настоящему изобретению в качестве реагентов для активации карбоксильной группы звена сшивающий агент-пептид предпочтительно используют O-(азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (HATU), (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония гексафторфосфат (BOP), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIPC), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или 2-хлор-1-метилпиридиния иодид с добавлением общепринятых катализаторов или вспомогательных оснований, таких как N-этилдиизопропиламин (DIEA), триалкиламин, пиридин, 4-диметиламинопиридин (DMAP) или гидроксибензотриазол (HOBt). Реакцию, например, выполняют в полярном органическом растворителе, предпочтительно в N,N-диметилформамиде. Реакции, например, осуществляют при температуре от -10°С до комнатной температуры, где время реакции составляет например между 30 минутами и 48 часами. Выделение промежуточного продукта, например, достигают осаждением из неполярного растворителя, предпочтительно диэтилового эфира.

На второй последующей стадии синтеза согласно данному изобретению удаляют защитную группу R₂ вместе с возможными защитными группами нуклеофильных групп в Р₁ , Р₂ и X_aa. Данное разложение обычно достигается при обработке с кислотой, предпочтительно трифторуксусной кислотой или хлороводородом. В предпочтительном воплощении изобретения продукт первой стадии синтеза обрабатывают смесью трифторуксусной кислоты и дихлорметана в отношении 1:1 в течение приблизительно 30 минут. Неочищенный продукт выделяют в ходе осаждения из неполярного растворителя, предпочтительно диэтилового эфира.

Согласно настоящему изобретению неочищенный продукт очищали, например, кристаллизацией или колоночной хроматографией, предпочтительно на обращенно-фазовом силикагеле.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения метотрексат- -трет-бутиловый эфир объединяли с EMC-D-Ala-Phe-Lys(Boc)-Lys-OH (ЕМС = 6-малеинимидокапроновая кислота), используя HATU в качестве связующего реагента, и затем обрабатывали трифторуксусной кислотой (см. пример 1).

Белоксвязывающие производные метотрексата по настоящему изобретению можно вводить парентерально, предпочтительно внутривенно. С этой целью производные MTX по настоящему изобретению получают в виде растворов, твердых веществ или лиофилизатов, возможно используя общепринятые фармацевтически приемлемые вспомогательные агенты, такие как носители, разбавители или растворители. Примерами подобных вспомогательных агентов являются полисорбаты, глюкоза, лактоза, маннит, декстраны, лимонная кислота, трометамол, триэтаноламин, аминоуксусная кислота или синтетические полимеры, или их смеси. Предпочтительно производные MTX по настоящему изобретению вводят при растворении в изотоническом буфере. Растворимость производного MTX может быть улучшена посредством фармацевтически приемлемых растворителей, таких как 1,2-пропандиол, этанол, изопропанол, глицерин или поли(этиленгликоль), имеющих молекулярную массу от 200 до 600 г/моль, или их смесей, предпочтительно поли(этиленгликоля), имеющего молекулярную массу 600 г/моль, или медиатора растворимости, такого как Твин 80, Кремофор или поливинилпирролидон, или их смесей.

Важнейшее свойство производных MTX по настоящему изобретению состоит в быстром ковалентном связывании с белками сыворотки посредством белоксвязывающей группы, в результате чего образуется высокомолекулярная транспортная форма активного соединения. Известно, что белки сыворотки, такие как трансферрин, альбумин и ЛПНП (липопротеины низкой плотности), имеют повышенное поглощение в опухолевой ткани и накопление в ревматоидной ткани (Kratz F., Beyer U., Drug Delivery 1998, 5, 281-299; Adams, В.K., Al Attia, H.M. et al., Nuclear Med. Commun. 2001, 22, 315-318; Sahin, M., Bernay, I. et al., Ann. Nuclear Med. 1999, 13, 389-395; Liberatore, M., Clemente, M. et al., J. Nuclear Med. 1992, 19, 853-857), таким образом они могут быть использованы в качестве эндогенных носителей для цитостатических агентов в объеме настоящего изобретения. Особенно предпочтительным белком сыворотки является циркулирующий альбумин человеческой сыворотки (HSA), который составляет основной компонент человеческой крови со средней концентрацией 30-50 г/л (Peters Т., Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161-245) и имеет свободную цистеиновую группу (цистеин-34-группа) на поверхности белка, которая подходит для связывания тиолсвязывающих групп, таких как малеинимиды или дисульфиды (WO 00/76551). Тот факт, что малеинимидфункционализированные производные MTX по настоящему изобретению быстро и селективно связываются с HSA, показан в примере 2. Также реакцию новых производных MTX с белками сыворотки можно осуществлять экстракорпорально, например с количеством альбумина, крови или сыворотки, предусмотренным для инфузии.

В сравнении с конъюгатами метотрексата, имеющими синтетические полимеры в качестве систем носителей, пептидные производные MTX по настоящему изобретению обладают дополнительным преимуществом, а именно, они однозначно определены химически.

Фигуры показывают:

Фигура 1: хроматограммы плазмы человека, EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (3) и EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (3) после 2 минут инкубации с плазмой человека при 37°С (детектирование при =300 нм).

Фигура 2: хроматограммы EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH (С162) (200 мкМ) после 2 минут инкубации с плазмой человека при 37°С и после 5 минут инкубации с плазмой человека, предварительно инкубированной с ЕМС (1000 мкМ) в течение 30 минут.

Фигура 3: хроматограмма HSA конъюгата EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH после 4 часов инкубации с плазмином человека (детектирование при =370 нм).

Фигура 4: хроматограммы HSA конъюгата EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (3) после 0, 1, 4 и 20 часов инкубации с плазмином человека и после 24 часов в буфере (детектирование при =300 нм).

Фигура 5: хроматограмма HSA конъюгата EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH после 4 часов инкубации с катепсином B (детектирование при =370 нм).

Фигура 6: хроматограммы HSA конъюгата EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (3) после 0, 1, 4 и 24 часов инкубации с катепсином В и после 24 часов в буфере (детектирование при =300 нм).

Фигура 7: хроматограмма HSA конъюгата EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH после 4 часов инкубации с гомогенатом опухоли OVCAR-3 (линиями клеток рака яичников человека) (детектирование при =370 нм).

Фигура 8: хроматограмма HSA конъюгата EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH (С162) после 4 часов инкубации с синовиальными жидкостями пациентов, страдающих РА (ревматоидным артритом) (детектирование при =370 нм).

Фигура 9: графическая иллюстрация, показывающая ход роста опухоли в OVCAR-3 модели.

Фигура 10: графическая иллюстрация, показывающая направление показателя РА в модели коллагениндуцированного артрита.

Фигура 11: графическая иллюстрация, показывающая направление образования артрита в модели коллагениндуцированного артрита с протоколом раннего лечения (начало лечения на 14 день после иммунизации).

Фигура 12: графическая иллюстрация, показывающая направление шкалы артрита в модели коллагениндуцированного артрита с протоколом раннего лечения (начало лечения на 14 день после иммунизации).

Фигура 13: графическая иллюстрация, показывающая направление шкалы артрита в модели коллагениндуцированного артрита с протоколом позднего лечения (начало лечения на 42 день после иммунизации).

Фигура 14: графическая иллюстрация, показывающая направление шкалы артрита в модели коллагениндуцированного артрита с протоколом промежуточного лечения (начало лечения на 30 день после иммунизации).

Фигура 15: результаты измерения концентраций цитокина, хемокина и фермента в модели коллагениндуцированного артрита.

Следующие примеры объясняют настоящее изобретение более подробно, не ограничивая его.

Примеры

Пример 1

Получение EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH

DIEA (27,2 мкл, 159 мкмоль) и HATU (13,29 мг, 34,96 мкмоль) последовательно добавляли к раствору метотрексат- -трет-бутилового эфира (MTX- -OtBu) (17,85 мг, 34,96 мкмоль) в 150 мкл безводного ДМФА. После 2 минут обработки на ультразвуковой бане реакционную смесь добавляли к раствору ЕМС-D-Ala-Phe-Lys(Boc)-Lys-OH (31,78 мкмоль) в 1,5 мл безводного ДМФА и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем реакционную смесь добавляли к 100 мл диэтилового эфира, осадок центрифугировали, дважды промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. Для удаления защитных групп неочищенный продукт обрабатывали в течение 1 часа 5 мл дихлорметана / ТФУ 1:1 и добавляли к 100 мл диэтилового эфира, осадок центрифугировали, дважды промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. После препаративной ВЭЖХ (обращенная фаза С18, MeCN/вода 30:70, 0,1% ТФУ) и лиофилизации EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH получали в виде светло-желтого твердого вещества.

ESI-MS (4,0 kV, MeCN): m/z (%) 1122,3 ([М+Н] ⁺, 100), 1144,4 ([М+Na]⁺, 73).

Пример 2

Связывание EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH с HSA в плазме человека

Образец плазмы крови человека инкубировали с EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (200 мкМ) в течение 2 минут при 37°С и затем анализировали с помощью хроматографии на С₁₈-ОФ-ВЭЖХ колонке (Symmetry^® 300-5 4,6×250 мм от Waters с предколоночным фильтром) с градиентным элюированием (расход: 1,2 мл/мин; элюент А: 30% 20 мМ K₂HPO₄ pH 7, 70% ацетонитрил; элюент В: 85% 20 мМ K₂HPO ₄ pH 7, 15% ацетонитрил; градиент: 20 минут элюент В изократический, 25 минут 0-100% элюент А линейный, 5 минут элюент А изократический). Детектирование на длине волны 300 нм, характерной для производных MTX, показывает почти полное уменьшение пика пролекарства и увеличение в абсорбции при времени удерживания альбумина (t~32 мин) (см. Фигуру 1).

Кроме того, дополнительный анализ после 24 часов показывает исходя из соответствующих площадей пиков, что потеря MTX менее 10%.

Пример 3

Связывание EMC-Arq-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH (С162) с HSA в плазме человека

Образец плазмы крови человека инкубировали с EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH (200 мкМ) в течение 2 минут при 37°С и затем анализировали с помощью хроматографии на С₁₈-ОФ-ВЭЖХ колонке (Symmetry^® 300-5 4,6×250 мм от Waters с предколоночным фильтром) с градиентным элюированием (расход: 1,2 мл/мин; элюент А: 30% 20 мМ K₂HPO₄ pH 7, 70% ацетонитрил; элюент В: 85% 20 мМ K₂HPO ₄ pH 7, 15% ацетонитрил; градиент: 20 минут элюент В изократический, 25 минут 0-100% элюент А линейный, 5 минут элюент А изократический). Детектирование на длине волны 300 нм, характерной для производных MTX, показывает почти полное уменьшение пика пролекарства и увеличение в абсорбции при времени удерживания альбумина (t=40 мин) (см. Фигуру 2).

Повторение теста с плазмой крови человека, предварительно инкубированной с ЕМС (1000 мкМ) в течение 5 минут, результатом чего является блокировка цистеин-34-группы альбумина, не показывает связывание пролекарства с альбумином в ходе последующей инкубации с EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH. На хроматограмме можно детектировать только свободное пролекарство при 370 нм.

Пример 4

Ферментативное расщепление альбуминового конъюгата из EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH под действием катепсина В и плазмина

Получение альбуминового конъюгата: 4,00 мг EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH растворяют в 8 мл 5% HSA раствора (Octopharm) при комнатной температуре и встряхивают при 37°С в течение 2 часов. Затем образец доводят до концентрации 700 мкМ в ходе концентрирования с доступными концентраторами Centriprep ^®.

Расщепление под действием плазмина: 100 мкл раствора альбуминового конъюгата разбавляют 500 мкл буфера (4 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,4), 20 мкл плазмина плазмы человека (370 мЕД) добавляют и смесь инкубируют при 37°С.Определение продуктов расщепления осуществляют с помощью метода ВЭЖХ, описанного в примере 2 (Фигуры 3 и 4).

Расщепление под действием катепсина В: 180 мкл раствора альбуминового конъюгата разбавляют 270 мкл буфера (50 мМ ацетат натрия, 100 мМ NaCl, 4 мМ ЭДТА*2Na, 8 мМ L-цистеин, pH 5,0), 90 мкл катепсина В человека (2,1 мЕД) добавляют и инкубируют при 37°С. Определение продуктов расщепления осуществляют с помощью метода ВЭЖХ, описанного в примере 2 (Фигуры 5 и 6).

Результат: Через один и четыре часа, соответственно, инкубации с ферментами в обоих случаях можно наблюдать образование H-Lys( -MTX)-OH в качестве продукта расщепления при ~ 4 минутах. Кроме того, очевидно, что с течением времени концентрация альбуминового конъюгата уменьшается и концентрация продукта расщепления увеличивается. Таким образом, продукт расщепления получается в результате протеолитического расщепления связи Lys-Lys.

Пример 5

Расщепление HSA-EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH в гомогенате овариального ксенотрансплантата человека (OVCAR-3)

Получение гомогената опухоли: Материал опухоли измельчают с помощью скальпеля и 200 мг массы гомогенизируют в аппарате для встряхивания с 800 мкл буфера (трис-буфер pH 7,4) с добавлением 3-4 стеклянных шариков. Затем осуществляют центрифугирование при 4°С и распределяют супернатант аликвотами по 200 мкл.

100 мкл раствора альбуминового конъюгата EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH, описанного в примере 4, разбавляют 500 мкл раствора гомогената (гомогенат, 1:2 разбавленный буфером [4 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,4]), и инкубируют при 37°С. Определение продуктов расщепления осуществляют с помощью метода ВЭЖХ, описанного в примере 2 (Фигура 7).

Результат: Через четыре часа инкубации с гомогенатом опухоли OVCAR-3 можно наблюдать образование H-Lys( -MTX)-OH в качестве продукта расщепления.

Пример 6

Расщепление EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH (С162) в синовиальных жидкостях пациентов, страдающих РА

Получение альбуминового конъюгата: 4,00 мг EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH растворяют в 8 мл 5% HSA раствора (Octopharm) при комнатной температуре и встряхивают при 37°С в течение 2 часов. Затем образец доводят до концентрации 700 мкМ в ходе концентрирования с доступными концентраторами Centriprep ^®.

70 мкл раствора альбуминового конъюгата EMC-Arg-Ala-Phe-Met-Lys( -MTX)-OH разбавляют 140 мкл синовиальной жидкости (синовиальная жидкость шести пациентов, страдающих ревматоидным артритом, разбавленная 1:1 дистиллированной водой) и инкубируют при 37°С. Определение продуктов расщепления осуществляют с помощью метода ВЭЖХ, описанного в примере 2 (Фигура 8).

Результат: Через четыре часа инкубации с синовиальной жидкостью пациентов, страдающих ревматоидным артритом, можно наблюдать образование H-Lys( -MTX)-OH в качестве продукта расщепления.

Пример 7

Эффективность EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH и EMC-Arg-Arg-Ala-Met-Lys( -MTX)-OH in vivo (опухольингибирующие свойства)

Биологические данные, приведенные ниже и на Фигуре 9, показывают увеличенную in vivo эффективность EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (AW054-EMC) и EMC-Arg-Arg-Ala-Met-Lys( -MTX)-OH (С175) по сравнению со свободным метотрексатом.

Животные: бестимусные мыши NMRI; модель опухоли: OVCAR-3 (карцинома яичника, возникающая подкожно).

Терапия: день 7, 14, 21, 28; внутривенно (буфер 10 мМ фосфата натрия / 5% D-глюкозы pH 6,4); дозы сопоставимы с эквивалентами метотрексата.

соединение	доза [мг/кг]	изменение веса тела [%]	Т/С [%] максимум
MTX	4×100	+19	69
AW054-EMC	4×15	+12	29
С175	3×15	+7	40

Пример 8

Эффективность EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH in vivo (противоревматические свойства)

Биологические данные, приведенные ниже и на Фигуре 10, показывают увеличенную in vivo эффективность EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (AW054-ЕМС) по сравнению со свободным метотрексатом.

Животные: мыши (самцы, DBA/1; модель: модель коллагениндуцированного артрита).

Терапия: день 30, 34, 37, 41, 44, 48; внутривенно (буфер 10 мМ фосфата натрия/5% D-глюкозы pH 6,4); дозы сопоставимы с эквивалентами метотрексата.

соединение	доза [мг/кг]	изменение веса тела [%]	шкала РА 55 дней
контроль	-	+9,5	8,10
MTX	6×35	+6,9	8,30
AW054-EMC	6×20	-0,2	5,00

Биологические данные, приведенные ниже, на Фигурах 11-15 и таблице 1, также показывают увеличенную in vivo эффективность EMC-D-Ala-Phe-Lys-Lys( -MTX)-OH (AW054-EMC) по сравнению со свободным метотрексатом.

Животные: мыши (самцы, DBA/1; модель: модель коллагениндуцированного артрита).

Терапия: два раза в неделю на 14, 42 и 30 день, соответственно; внутривенно (буфер 10 мМ фосфата натрия / 5% D-глюкозы pH 6,4); дозы сопоставимы с эквивалентами метотрексата. Соединения и дозы указаны на Фигурах 11-15.

Измерения концентрации белка в сыворотке после 6-дня лечения проводятся посредством ИФА (имеется в продаже от R&D Systems Висбаден Германия) согласно протоколу изготовителя.

Следующая таблица показывает реакцию на лечение с MTX или разными дозами AW054 по сравнению с NaCl контролем в протоколе своевременного лечения. Лечение с AW054 приводит к пониженному появлению развитого артрита в конце теста, уменьшает средний показатель артрита, увеличивает время первого возникновения артрита и вызывает улучшение или хотя бы ослабление развитого артрита.

(± среднеквадратичное отклонение)	NaCl контроль n=29	MTX 35 мг/кг n=15	AW054 21 мг/кг n=14	AW054 42 мг/кг n=11
появление артрита в конце теста (%)	29(100)	9(60)	9(64)	2(18)
средний показатель артрита в конце теста	11,1 (±3,1)	3,1 (±3,4)	3,7 (±4,3)	0,8 (±2,4)
средний период времени до появления восстановленного артрита после начала лечения в днях	8,3 (±5,7)	17,3 (±10,8)	6,8 (±7,6)	11,5 (±11,1)
улучшенное или достигнутое ослабление после вызванного заболевания	0(0)	8(53)	10(71)	8(73)

Из примеров становится очевидно, что после инкубации с плазмой крови человека соответствующий альбуминовый конъюгат главным образом образуется уже через 2 минуты. Конъюгаты показывают существенную стабильность в плазме, и можно наблюдать эффективное расщепление в присутствии как плазмина человека, так и катепсина В. Расщепление приводит к образованию, например, H-Lys( -MTX)-OH, что представляет собой только низкомолекулярный продукт расщепления. Однако затем данный продукт расщепления больше не расщепляется на MTX и лизин, и тесты in vivo соответственно показывают, что производное MTX-лизина по настоящему изобретению по существу является высокоактивными. В сравнении с метотрексатом производное проявляет увеличенную эффективность с гораздо меньшей дозой. В случае модели коллагениндуцированного артрита это составляет около 20% соответствующей эквивалентной дозы метотрексата. Кроме того, данное производное активно в течение длительного периода времени и сывороточные концентрации, например SDF-1, OPG и IL-10, значительно уменьшены.