средство для лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека, в виде вагинального суппозитория

Формула изобретения

Средство для лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека, в виде вагинального суппозитория, отличающееся тем, что содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, гидрофобную основу, состоящую из витепсола Н-15 и твердых полусинтетических глицеридов, включающих смеси эфиров глицерол моноолеата и глицерол монорицинолеата с высокомолекулярными спиртами, полиэтиленгликоль 1500, полиэтиленгликоль 400, консервант, хитозан со степенью деацетилирования 86% при следующем сочетании компонентов на 1 суппозиторий, вес.ч.:

Рекомбинантная композиция белков
Е7 вируса папилломы человека
16 и 18 типов, соединенных
с аминокислотной последовательностью
белка теплового шока м.м. 70 кДа из
М.tuberculosis	0,125-0,75
Хитозан со степенью деацетилирования 86%	0,055
Полиэтиленгликоль 1500	0,25-1,5
Полиэтиленгликоль 400	0,5-1,0
Консервант	0,1-0,5
Гидрофобная основа	До 3

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения предраковых и раковых заболеваний шейки матки. В настоящее время можно считать доказанной роль ВПЧ в развитии остроконечных кондилом и цервикального рака. Оказалось, что в большинстве случаев во всем мире (65-77%) выявляются вирусы папилломы человека (ВПЧ) 16/18 типов, относящихся к вирусам высокого онкогенного риска.

Распространение инфекции происходит преимущественно половым путем, достигая максимума инфицирования до 30 лет. Более 50% сексуально активного населения мира в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека, и это является «первичным» событием в патогенезе РШМ. Большинство случаев инфицирования заканчивается спонтанным выздоровлением. Однако в некоторых случаях развивается персистирующая инфекция, способная запускать механизмы клеточной трансформации эпителиальных клеток. Так при CIN 1 наблюдается активная репликация вируса и его бессимптомное выделение. Превращение CIN 1 в инвазивный рак происходит с большой частотой и, как правило, сопровождается интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина [Киселев В.И. (2004). Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. М.: Компания «Димитрейд График Групп®»].

ВПЧ высокой степени онкогенного риска (преимущественно 16 и 18 типов) обнаруживают в 50-80% образцов умеренной и тяжелой дисплазии плоского эпителия шейки матки и в 90% инвазивного рака. Важным обстоятельством является то, что клинические проявления ВПЧ-инфекции не обнаруживаются достаточно длительное время, однако последствия персистенции вируса от этого не становятся более легкими. Развитие легкой и умеренной дисплазии в тяжелую происходит, соответственно, в 10 и 20% случаев.

В связи с простотой организации вирусного генома оказалось довольно сложно разработать лекарственное средство, избирательно ингибирующее репродукцию вируса. По этой причине основные усилия направлены на создание вакцинных препаратов, так как хорошо обоснована роль иммунитета в спонтанной регрессии клинических проявлений вирусной инфекции

В патенте РФ № 2229307 описана разработка вакцины на основе гибридных белков Е7 и Hsp 70 M.tuberculosis. Авторы описывают инъекционную лекарственную форму, с помощью которой удается добиться регрессии опухолей индуцированных вирусом на экспериментальных моделях с перевиваемыми опухолями. Продемонстрированная эффективность вакцинации на этих моделях подтверждает правильность выбора белка Е7 как молекулярной мишени, против которой индуцируются иммунные реакции.

В заявке РФ 2008146809 описаны вагинальные суппозитории, содержащие композицию рекомбинантных белков, состоящую из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов соответственно, которые ковалентно соединены с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из M.tuberculosis, масло какао или твердый жир тип А, полиэтиленгликоль 1500, эмульгатор. Недостатком данной композиции является использование масла какао и твердого жира типа А в качестве основы для суппозиториев. Так как данные основы нестабильны при высоких температурах, то они дают метастабильные модификации и не могут быть использованы повторно на стадиях технологического процесса, что значительно повышает стоимость производства.

В патенте РФ 2377305 описаны мукозальные вакцины местного применения при заболеваниях, ассоциированных с вирусом папилломы человека, в том числе рака шейки матки. Отмечается, что вакцина в комплексе с хитозаном может использоваться в виде суппозиториев состава:

- раствор рекомбинантных белков, E716-Hsp 70, E718-Hsp 70,

- хитозан со степенью деацетиллирования 86%,

- ПЭГ 1500,

- твердый жир типа А,

- витепсол HW,

- TRIS фирмы МР Biomedicals Inc. cat. 195605.

Данный источник может быть указан в качестве наиболее близкого аналога-прототипа. Данные суппозитории более эффективны, чем раскрытые в заявке 2008146809, за счет введения хитозана. Однако они также недостаточно стабильны.

Задачей данного изобретения является создание средства, эффективного в применении, исключающего инъекционный путь введения как травматочный и небезопасный, а также обеспечивающего стабильность рекомбинантных белков, входящих в его состав, на протяжении длительного времени.

Поставленная задача решается вагинальным суппозиторием, который содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, гидрофобную основу, состоящую из витепсола Н-15 и твердых полусинтетических глицеридов, включающих смеси эфиров глицерол моноолеата и глицерол монорицинолеата с высокомолекулярными спиртами, полиэтиленгликоль 1500, полиэтиленгликоль 400, консервант, хитозан со степенью деацетилирования 86% при следующем сочетании компонентов на 1 суппозиторий, вес.ч.:

- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:

М.tuberculosis	0,125-0,75
Хитозан, со степенью деацетилирования 86%	0,055
Полиэтиленгликоль 1500	0,25-1,5
Полиэтиленгликоль 400	0,5-1,0
Консервант	0,1-0,5
Гидрофобная основа	до 3

Гидрофобная основа в заявленном соотношении обеспечивает необходимую скорость высвобождения рекомбинантной композиции белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М. tuberculosis, не имея отрицательных свойств масла какао и твердого жира типа А, таких как нестабильность при высоких температурах, метастабильные модификации.

Витепсол Н-15 представляет собой основу, содержащую кокоглицериды. Основа совместима с большинством современных лекарственных веществ. Представляет собой белую, твердую, хрупкую, легкоплавящуюся при температуре тела массу без вкуса и запаха.

В качестве твердых полусинтетических глицеридов, включающих смеси эфиров глицерол моноолеата и глицерол монорицинолеата с высокомолекулярными спиртами, предпочтительно использовать основу Ovucire, зарегистрированную фирмой Gattefosse.

Хитозан со степенью деацетилирования 86% способен усиливать абсорцию гидрофильных соединений, например белковых и пептидных лекарственных препаратов, на эпителии. Он увеличивает проницаемость апикальных клеточных мембран и перераспределяет белки цитоскелета вследствие своей катионной природы. Его взаимодействие с клеточной мембраной приводит к структурной реорганизации белков, связанных с плазматическими мембранами, что, в свою очередь, увеличивает проницаемость для лекарственных препаратов.

Кроме того, введение хитозана со степенью деацетилирования 86% в состав лекарственных препаратов с белковыми соединениями обеспечивает повышение их стабильности в лекарственной форме за счет образования комплекса между белком и хитозаном.

В качестве консерванта используют любые физиологически приемлемые консерванты, проявляющие антигрибковое и антибактериальное свойства. Предпочтительно в качестве консерванта могут быть использованы нипагин, нипазол, бензалконий хлорид и т.п.

Предлагаемые средства отвечают всем требованиям, предъявляемым к лекарственным формам: высокая биодоступность и стабильность активных ингредиентов, удобство применения.

Пример 1

- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:

М.tuberculosis	0,125
Хитозан со степенью деацетилирования 86%	0,055
Полиэтиленгликоль 1500	1,0
Полиэтиленгликоль 400	0,5
Нипагин	0,1
Витепсол Н-15/Ovucire	до 3

Пример 2

- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:

М. tuberculosis	0,75
Хитозан со степенью деацетилирования 86%	0,055
Полиэтиленгликоль 1500	0,25
Полиэтиленгликоль 400	1,0
Нипазол	0,2
Витепсол Н-15/ Ovucire	до 3

Пример 3

Сравнительное исследование стабильности рекомбинантных белков Е7-16-Hsp и E7-18-Hsp

Суппозитории, содержащие рекомбинантные белки E7-16-Hsp и E7-18-Hsp в концентрации 250 мкг каждого, изготавливаются в соответствии с рецептурой, описанной в заявке на патент № 2377305.

Определение содержания рекомбинантных белков проводили методом иммуноферментного анализа, описанного в статье «Разработка диагностической системы для определения онкобелков Е7 вируса папилломы человека 16-го и 18-го типов методом твердофазного иммуноферментного анализа» Киселев В.И., Солопова О.Н., Свешников П.Г и другие. Молекулярная медицина, 2010, № 2, стр.52-57.

Таблица 1 Стабильность рекомбинантных белков
Хранение при комнатной температуре.
Суппозитории по патенту 2377305	Суппозитории по примеру 1	Сроки измерений (дни)
Е7-16 (мкг)	Е7-18 (мкг)	Е7-16 (мкг)	Е7-18 (мкг)
250	250	250	250	1
154	120	200	180	14
110	70	150	130	30
60	40	100	100	60
50	35	80	60	90

Пример 4

Результаты фармакокинетических исследований

Исследования проведены на экспериментальных животных (кроликах) в соответствии с Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А. «Фармакокинетика», Ростов, 2001.

Было установлено, что максимальный уровень концентрации рекомбинантного белка E7-16-Hsp 70 (в пределах 180-250 нг/мл) в крови экспериментальных животных при интравагинальном введении достигается через 2 часа после интравагинального введения в дозе, соответствующей составу по примеру 1, в то время как при инъекционном пути введения этот показатель составляет 0,5 часа при той же величине концентрации.

Длительность действия препарата составляет около 12.5 часов.

Данные фармакологических испытаний подтверждают сохранение фармакологических свойств активного начала. Состав может быть эффективно применен для лечения различных ассоциированных с вирусом папилломы человека заболеваний шейки матки, таких как дисплазия, рак шейки матки, кандиломы.