способ интраоперационной оценки эффективности защиты миокарда при коррекции врожденных пороков сердца

Формула изобретения

1. Способ интраоперационной оценки эффективности защиты миокарда при коррекции врожденных пороков сердца, включающий определение ультраструктуры кардиоцитов миокарда с использованием электронной микроскопии, отличающийся тем, что в биоптатах сердечной ткани проводят анализ степени повреждения ДНК кардиоцитов на аноксическом и реперфузионном этапах операции, при этом определяют интенсивность флуоресценции ДНК и показатель процентного соотношения фрагментированной ДНК в ядре и в цитоплазме кардиоцитов, при этом снижение средних значений интенсивности флюоресценции показывает нарастание гипоксии в миокарде, одновременное снижение интенсивности флуоресценции и значение показателя процентного соотношения фрагментированной ДНК в ядре и в цитоплазме, приближенное к 1:1, свидетельствуют об интраоперационном повреждении миокарда.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что забор биопсии проводят из ушка правого предсердия на этапах коррекции ВПС в конце пережатия аорты перед ее открытием - этап аноксии, на 20-30-й минуте реперфузии - реперфузионный этап операции.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после забора биопсийного материала в течение одного часа изготавливают криостатные срезы криостатным микротомом, для визуализации ДНК используют этидиум бромид, а анализ и оценку производят с использованием люминесцентного компьютеризированного микроскопа, выделяя в биоптате от 3 до 5 зон, включающих не менее 400 кардиоцитов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к анестезиологии и реаниматологии при кардиохирургических вмешательствах у пациентов с врожденными пороками сердца.

Исследования по разработке интраоперационных критериев адекватности защиты миокарда при коррекции врожденных пороков сердца (ВПС) проводятся с использованием современных методов морфологической оценки.

Известны способы оценки эффективности защиты миокарда на этапах коррекции врожденных пороков сердца с помощью метода определения уровня лактата (биохимического маркера гипоксического повреждения миокарда) при интраоперационном заборе крови из коронарного синуса (оттекающей из сердца крови) с контролем в артериальной крови (в притекающей к сердцу крови) с последующим анализом артериовенозной разницы (1).

Способ сопряжен с технической сложностью забора крови из коронарного синуса, особенно у пациентов раннего детского возраста, у которых данная хирургическая манипуляция при давлении на сердце приводит к транзиторной гипотонии, проколы коронарного синуса иглой не исключают опасность кровотечения. Забор артериальной крови из магистрали аппарата искусственного кровообращения предполагает определение уровня лактата, связанного непосредственно с адекватностью проведения искусственного кровообращения, что в дальнейшем влияет на результат артериовенозной разницы. В целом способ не отвечает критериям хирургической безопасности, а также надежности при оценке защиты миокарда с помощью биохимических параметров.

Известен способ оценки эффективности кардиопротекции, в котором анализ ультраструктуры кардиомиоцитов (2, 3) и состояния микрососудистого русла проводился методом электронной микроскопии (4). При этом оценка ультраструктурных изменений проводилась по митохондриальному индексу и по содержанию гликогена в кардиоцитах (5). При несомненной информативности данных морфологических характеристик этот метод является ретроспективным. При надежности морфологических характеристик способ существенно отсрочен во времени.

Известен способ оценки жизнеспособности миокарда на экспериментальных моделях хронической ишемии миокарда, основанный на использовании лазерно-индуцированной флуоресценции (6, 7). Наблюдаемое снижение интенсивности флуоресценции авторы связывают с потерей ядерного материала.

Цель изобретения - интраоперационная оценка адекватности защиты миокарда и предупреждение осложнений, связанных с проведением хирургической коррекцией ВПС.

Для достижения цели используют метод лазерно-индуцированной флуоресценции и анализ степени интраоперационного повреждения ДНК на аноксическом и реперфузионном этапах операции.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор биопсии из ушка правого предсердия на следующих этапах операции: 1) непосредственно перед пережатием аорты (АО) - исходный, 2 - перед открытием АО - этап аноксии, 3) на 20-30 минуте реперфузии. Биоптаты до поступления в лабораторию помещают в 4% формалин в пробирки Эппендорфа. В лаборатории изготавливают криостатные срезы 7 мкм на криостатном микротоме с их последующим окрашиванием этидиумом бромидом. Этидиум бромид используется как флуоресцентный краситель, интеркалирующий между парами двухцепочечной ДНК и позволяющий выявить уровень фрагментации ДНК. Срезы окрашивают в фосфатном буфере pH 7,4, содержащем 10 µG/ml этидиума бромида 5 минут при +25°C.

Далее препараты заключаются в полистерол.

Проводят флюориметрию гистологических препаратов (поглощение 510-523 нм, испускание 595-605 нм). Для точности измерения в биоптате выделяют от 3 до 5 зон, включающих не менее 400 кардиоцитов.

Препараты фотографировались с помощью микроскопа Axioskop FL 40. Для получения изображений использовался Axioskop FL-40 с камерой AxioCam MRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 3.1 и его программный модуль полуавтоматических измерений, объектив Plan-Neofluar × 40 с конечным увеличением 460 крат, блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).

Анализ изображений выполняют «маркером» в режиме RGB, на каждом срезе выбирают не менее 400 точек в ядрах и не менее 400 точек в цитоплазме. После чего вычисляют средние значения интенсивности флюоресценции.

Обследовано 12 пациентов с ВПС, средний возраст - 11 месяцев. Исследование проводили на следующих этапах: до окклюзии аорты - 1 этап, в конце пережатия аорты перед ее открытием - второй этап (этап аноксии), на 20-30 минуте реперфузии - этап третий (реперфузионный этап). Для защиты миокарда использовали раствор «Custodiol». Забор биопсии из ушка правого предсердия производили на каждом этапе. Изготавливали криостатные срезы и фиксировали этидиумом бромидом.

Наличие флуоресценции отмечено как в ядре, так и в цитоплазме кардиоцитов. Абсолютные показатели интенсивности флуоресценции кардиоцитов на 1, 2 и 3 этапах коррекции ВПС представлены в таблице 1.

Таблица 1
Средние значения интенсивности флуоресценции фрагментов ДНК в ядре и цитоплазме кардиоцитов на 1, 2, 3 этапах коррекции ВПС при защите миокарда раствором Custodiol
Этап	Показатели	N	Среднее значение	Min	Max	Стандартное отклонение	Ошибка среднего
	А0	34	60,47	25,00	87,00	22,06	3,78
	ИК	34	112,09	53,00	157,00	31,36	5,38
1 этап	ядро	18	121,94	41,00	277,00	83,36	19,65
	цитоплазма	18	68,39	27,00	156,00	43,30	10,21
2 этап	ядро	23	168,65	49,00	307,00	93,83	19,56
	цитоплазма	23	104,26	26,00	215,00	63,96	13,34
3 этап	ядро	13	98,69	37,00	285,00	73,06	20,26
	цитоплазма	13	58,46	23,00	194,00	49,24	13,66

Показатели процентного и относительного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов относительно клеточного ядра на этапах коррекции ВПС при защите миокарда раствором «Custodiol» показано в таблице 2.

Таблица 2
Показатели процентного и относительного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов относительно клеточного ядра на 1, 2, 3 этапах коррекции ВПС при защите миокарда раствором Custodiol
	Показатели	N	Среднее	Медиана	Min	Мах	Стандартное отклонение	Ошибка среднего
1 этап	Ядро/цитоплазма	18	0,62	0,57	0,22	1,00	0,21	0,05
	%	18	62,04	56,82	22,13	100,00	21,32	5,02
2 этап	Ядро/цитоплазма	23	0,61	0,61	0,41	0,82	0,11	0,02
	%	23	61,14	60,51	40,74	82,00	10,73	2,24
3 этап	Ядро/цитоплазма	13	0,57	0,56	0,44	0,72	0,09	0,03
	%	13	57,20	55,56	43,86	72,31	9,35	2,59

Вид сохранного миокарда при оценке структуры ядер данным способом представлен на фиг.1. Вид миокарда при частичном повреждении ДНК на этапе аноксии и реперфузии представлен на фиг.2. У пациента с неблагоприятным исходом отмечен поврежденный миокард (фиг.3), соотношение показателя ядро-цитоплазма приближено к 1:1 при одновременном снижении интенсивности флуоресценции на 2 и 3 этапах операции, что ставит под сомнение адекватность кардиопротекции в данном случае. Снижение средних значений интенсивности флюоресценции показывает нарастание гипоксии в миокарде. Клинику сердечной недостаточности необходимо соотносить со стадией порока пациента и кризовым течением послеоперационного периода.

Предлагаемый способ интраоперационной оценки эффективности защиты миокарда при коррекции ВПС был использован при сравнительной оценке методов защиты миокарда у детей первого года жизни - фармакохолодовая кардиоплегия - ФХПК, кровяная кардиоплегия, раствор Custodiol.

Результаты морфологической оценки представлены на фиг.4 и подтверждены анализом клинических характеристик адекватности защиты миокарда в таблице 3.

Таблица 3
Клинические критерии адекватности защиты миокарда при применении ФХКП, кровяной кардиоплегии и раствора Custodiol
Критерии	ФХКП (9 пациентов)	Кровяная кардиоплегия (7 пациентов)	Раствор Custodiol (12 пациентов)
I Тип восстановления
сердечной деятельности
a) Через A-V блок
b) Через фибрилляцию	6 (67%)	3 (43%)	3 (25%)
1 (8%)
II Тип нарушения ритма
в ближайшем послеоперационном периоде
a) Блокада правой
ножки пучка Гиса	6 (67%)	2 (29%)	5 (42%)
b) Фибрилляция
c) Предсердный ритм	1 (11%)
d) Ритм A-V узла	1 (11%)
e) Предсердная экстрасистолия	1 (11%)	1 (14%)	1 (8%)
f) Пароксизмальная тахикардия	1 (11%)
g) Удлинение электрической систолы желудочков	1 (11%)
		4 (57%)
III Ухудшение метаболизма миокарда (ЭКГ)	4 (44%)	4 (57%)	НЕТ
IV Нарушения локальной сократимости миокарда (ЭХО КГ)	1 (11%)	1 (14%)	НЕТ

При сравнительном клинико-морфологическом анализе предложенным методом выявлено предпочтение использования раствора "Custodiol" для защиты миокарда у пациентов первого года жизни.

Результаты оценки защиты миокарда у пациентов первого года жизни раствором "Custodiol" по критерию интенсивности флуоресценции и вычисление процентного соотношения содержания фрагментированной ДНК в ядре и в цитоплазме кардиоцитов согласуются с данными из НЦССХ им. А.Н.Бакулева по оценке эффективности защиты миокарда у детей первого года жизни при применении раствора "Custodiol" по митохондриальному индексу и содержанию гликогена в кардиоцитах (5).

Изучение вопросов адекватности защиты миокарда актуально и способствует профилактике послеоперационных осложнений. Оценка адекватности защиты миокарда на этапах коррекции ВПС методом лазерно-индуцированной флуоресценции и анализом степени интраоперационного повреждения ДНК на аноксическом и реперфузионном этапах является современным методом исследования. Он позволяет оценить адекватность кардиопротекции с помощью новых морфологических характеристик, отвечает требованиям хирургической безопасности, дает возможность проведения оценки биопсийного материала в течение одного часа после его забора и выявляет вероятные причины послеоперационной сердечной недостаточности.

Данный способ позволяет осуществить своевременную диагностику причин сердечной недостаточности и своевременно начать патогенетически обоснованное лечение.

Литература

1. Дементьева И.И., Бабалян Г.В., Соловова Л.Е. Влияние комбинированной холодовой и фармакологической защиты на метаболизм миокарда при временной аноксии сердца. Cor et vasa, 1982. V.24 P.16-26.

2. Казанская Г.М., Волков A.M., Цветовская Г.А., Князькова Л.Г., Часовских Г.Г., Дьяконица Г.П., Жданов Г.П., Ломиворотов В.В. Изменения метаболизма миокарда и ультраструктуры его микрососудов при проведении фармакохолодовой кардиоплегии в условиях бесперфузионной гипотермии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, том 134, № 11. С.580-584.

3. Ларионов П.М., Мандрик М.М. Журнал прикладной спектроскопии. - Новосибирск, 2003. - Т.70, № 1. - С.38-42.

4. Мазур А.П. Захист мiокарду при операцiях з штучним кровообiгом у новонароджених i детей першого року життя. Автореф. дисс к.м.н. Киев, 2001.

5. Островский Ю.П., Шестакова Л.Т. Защита миокарда в хирургии сердца. - Минск, 1999.

6. Потапенко М.М. Оценка жизнеспособности миокарда изолированного сердца методом лазерно-индуцированной флуоресценции в сопоставлении с комплексным морфологическим анализом (экспериментальная работа). Автореф. дисс к.м.н. Новосибирск, 2006.

7. Шебаев А.В. Защита миокарда при коррекции врожденных пороков сердца у детей первого года жизни. Автореф. дис к.м.н. М., 2004.