пептидный антибиотик бактериального происхождения латероцин, подавляющий развитие микроскопических водорослей

Формула изобретения

Циклодекапептидный антибиотик латероцин, выделенный из штамма Brevibacillus laterosporus В-10531, обладающий цианолитической активностью против сине-зеленых микроводорослей и имеющий первичную структуру [cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Met-)] и молекулярную массу 1240,60 Да.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и биохимии, в частности к выделению биологически активных соединений - антибиотиков для борьбы с микроскопическими водорослями.

Микроскопические водоросли при интенсивном развитии представляют серьезную экономическую и социальную проблемы. Экономические аспекты связаны с загрязнением природных водоемов и водохранилищ, обеспечивающих питьевой водой население. Следствием развития энергетики и промышленности в последние десятилетия явилось создание большого числа искусственных и технологических водоемов (водохранилищ и прудов), а также систем водоснабжения промышленных предприятий. Массовое увеличение численности микроводорослей в водоемах приводит к неблагоприятным последствиям, таким как «цветение» воды [1] и зарастанию микроводорослями водных резервуаров, используемых в металлургической промышленности и энергетике, а также обрастанию технологического оборудования в водных резервуарах.

Социальные аспекты обусловлены выделением некоторыми видами микроскопических водорослей в процессе их жизнедеятельности соединений со зловонным запахом, в частности геосмина, что сильно снижает качество питьевой воды, а также рекреационную привлекательность природных водоемов [2]. Микроскопические водоросли, в частности сине-зеленые водоросли (цианобактерии), продуцируют токсины, которые при гибели цианобактерий высвобождаются в водную среду. Описаны несколько видов токсинов - эндотоксины, нейротоксины, гепатотоксины. Уровень токсичности этих веществ исключительно высок. Так, микроцистин LR токсичнее цианида в 200 раз [3]. Нейротоксины блокируют нервную и мышечную систему и могут привести к изменениям в дыхательной системе. Гепатотоксины отравляют печень и другие внутренние органы, что часто ведет к смертельному исходу. Токсины могут продуцироваться и сохраняться в воде в течение нескольких недель. Они также могут накапливаться в рыбах, моллюсках, ракообразных. Концентрация токсинов, вызывающая 50%-ную гибель животных, колеблется от 15 мг/кг до 150 мг/кг веса животных. Антидотов к токсинам цианобактерий в настоящее время не выявлено. Сине-зеленые бактерии вызывают ряд аллергических заболеваний. Поэтому при высоком уровне "цветения" воды становится нежелательным использование водоемов в рекреационных целях, т.е. нужно до минимума ограничить время нахождения человека и домашних животных в такой воде. Концентрация токсина микроцистина в рекреационной воде не должна превышать 20 мкг/л.

Избыточное развитие цианобактерий сопровождается выбросом в воду ряда токсических соединений (фенолов, индола, скатола), а также органолептическими проявлениями гниения, в частности продукцией геосмина. Высокая численность клеток микроводорослей при их отмирании может приводить к гипоксии и гибели многих гидробионтов.

Серьезные экономические и медико-социальные проблемы, вызываемые микроводорослями, определяют необходимость поиска и разработки методов подавления развития микроскопических водорослей и прогнозирования состояния водных экосистем.

В настоящее время известны различные физические, химические и биологические средства подавления развития микроводорослей. Несмотря на эффективность химических альгицидных соединений в лабораторных условиях, массовое использование их в естественных условиях лимитируется по токсикологическим и гигиеническим требованиям. Кроме того, химические препараты не обладают избирательностью действия и оказывают ряд побочных биологических эффектов (летальный, мутагенный, тератогенный и т.д.) на растительные и животные организмы. Использование химических соединений для обработки водоемов ограничено по санитарно-гигиеническим нормам в связи с опасностью для человека и животных и также неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности других обитателей водоемов (гидробионтов).

Используемые физико-химические методы борьбы с микроводорослями - спуск воды из водоемов с последующим механическим удалением биомассы, аэрирование огромных водных пространств, применение химических препаратов и веществ коагулянтов, использование ультрафиолетового облучения и ультразвука малоэффективны и связаны с большими финансовыми затратами. Физические методы контроля микроводорослей направлены на создание условий либо препятствующих развитию водорослей либо разрушающих уже образовавшиеся сообщества микроводорослей, так называемых матов. Ультразвуковая обработка «цветущей» воды хотя и является достаточно эффективной по альгидному действию, приводит к нежелательным последствиям. Обработка «цветущей» воды ультразвуком снижает pH воды и количество общего азота и фосфора в воде, повышает температуру воды. Альтернативой химическим и физическим средствам для подавления развития микроводорослей в водной среде является применение биологических средств на основе бактерий и их метаболитов, обладающих альгицидными свойствами. Известны штаммы бактерий, подавляющие развитие микроводорослей [4-11].

В качестве ближайшего аналога заявляемого объекта рассмотрено цианолитическое (альгицидное) соединение аргимицин А, синтезируемое бактериями Sphingomonas sp. М-17 [12]. Аргимицин А вызывает подавление процессов фотосинтеза.

Задачи заявляемого изобретения:

- выделение нового цианолитического соединения, продуцируемого штаммом бактерий Brevibacillus laterosporus В-10531;

- характеристика химической структуры и физических свойств нового цианолитического соединения.

Заявляемое нами цианолитическое соединение, названное нами латероцином, не известно из источников информации. Латероцин подавляет развитие сине-зеленых водорослей. Латероцин представляет собой белое аморфное твердое вещество, имеющее формулу [cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Met-)] и молекулярную массу 1240,6 Да. Латероцин растворяется в метаноле, этаноле, других низших спиртах, не растворяется в воде.

Заявляемое цианолитическое соединение выделено из природного штамма Brevibacillus laterosporus, полученного путем многоступенчатой селекции и депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-10531. Штамм образует округлые колонии диаметром 3-5 мм с гладкой поверхностью светлого кремового цвета и неровным краем.

Биологическое соединение латероцин заявляется как фактор, оказывающий альгицидный (антагонистический) эффект на разные виды микроскопических водорослей.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Культивирование штамма ВКПМ В-10531 - продуцента латероцина

Для культивирования штамма В-10531 используют среду NBY [13]. Среду готовят на дистиллированной воде, доводят значение pH до 7,0; разливают в колбы по 50 мл и стерилизуют при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы с содержащейся в них средой охлаждают до +20°С. Стерильность и pH среды контролируют путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала используют 5 мл культуры ВКПМ В-10531, полученной при культивировании в среде NBY 16 часов при 30°С при встряхивании 250 об/мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. Продуктивность штамма определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду.

Пример 2. Культивирование микроскопических водорослей

Используют штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - получен с кафедры микробиологии Ленинградского государственного университета; Nostoc sp. A-10 - получен из коллекции IMET, Йена, ГДР. Штаммы не фиксирующих азот одноклеточных цианобактерий Microcystis aeruginosa 562 и 905 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г.Ухань).

Штаммы цианобактерий Anabaena и Nostoc выращивают в модифицированной среде BG-11 [14]. Штаммы Microcystis aeruginosa 562 и 905 выращивают в среде В-12

[15]. Микроводоросли культивируют в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл в 100 мл среды без аэрации при температуре 20°С и круглосуточном освещении в течение двух недель. Используют люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивают освещенность 40 мкмоль квантов·м^-2·с^-1 в области ФАР (фотосинтетически активной радиации).

Пример 3. Выделение и очистка латероцина из штамма Brevibacillus laterosporus В-10531

Штамм Brevibacillus laterosporus В-10531 культивируют в жидкой питательной среде NBY 90 часов, как описано выше. По окончании культивирования клетки бактерии Brevibacillus laterosporus отделяют центрифугированием на высокоскоростной центрифуге со скоростью 10000 об/мин в течение 50 мин при температуре 4°С. К осадку добавляли холодный (5°С) абсолютный спирт из расчета 6 мл/г биомассы и оставляют на сутки в холодильнике. Затем спиртовой экстракт отделяют от биомассы на воронке Бюхнера, используя фильтр с размером пор 0,2 мкм, и подвергают фракционированию с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Luna 5u C5, 250×10 мм, уравновешенной раствором А (5% ацетонитрил, 60% метанол), в линейном градиенте раствора Б (22,5% ацетонитрил, 75% метанол) от 0 до 100% в течение 40 мин (2,5% мин^-1) при скорости потока 1,6 мл/мин. Детектирование ведут при длине волны 214 нм, на колонку наносят по 0,5 мл спиртового экстракта. Аликвоты полученных фракций тестируют на цианолитическую активность методом совместного инкубирования. В результате хроматографического разделения на колонке Luna 5u C5 получают активную фракцию, которая соответствует основному пику, выходящему с колонки при концентрации ацетонитрила 17,5% и метанола 70,5%. Активную фракцию дважды подвергают рехроматографии на той же колонке, уравновешенной раствором А. Первую рехроматографию проводят в линейном градиенте раствора Б от 30% до 100% в течение 40 минут (1,75% мин^-1 ) при скорости потока 1,6 мл/мин. Пик, содержащий активную фракцию, выходит с колонки при концентрации ацетонитрила 15,5% ацетонитрила и метанола 69%. Вторую рехроматографию проводят в изократическом режиме на колонке, уравновешенной смесью растворов А и Б в соотношении 40:60 по объему. Скорость элюции - 1,6 мл/мин. Пептид латероцин, обладающий цианолитической активностью, элюируется с колонки на 15-й минуте. Индивидуальность выделенного пептида латероцина подтверждают методами масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

Пример 4. Определение структуры латероцина

Для определения структуры выделенного антибиотика применяют метод ЯМР-спектроскопии. 1,0 мг пептида латероцина растворяют в 450 мкл метанола (pH 6,2). ЯМР-спектры пептида получают при температуре 33°С на спектрометре Bruker AvanceIII-600 (Германия) с рабочей частотой 600 МГц. Для измерения ЯМР-спектров используют датчик тройного резонанса (¹H, ¹³C, ¹⁵ N) с криогенно охлажденной ¹Н катушкой (Bruker, Германия). На основании анализа двумерных ¹Н-ЯМР-спектров COSY, TOCSY, NOESY и ROESY при помощи стандартной процедуры [16] проводят полное отнесение сигналов ядер ¹Н исследуемого образца. На основании анализа двумерных ¹³С-ЯМР-спектров HSQC и НМВС проводят полное отнесение сигналов ¹³С ядер исследуемого образца. Полученое отнесение соответствует аминокислотной последовательности латероцина: [cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Met-)].

После анализа баз данных по аминокислотным последовательностям выявлено, что приведенная выше структура не описана ранее, а выделенный нами циклодекапептид является новым антибиотиком. Данный пептид, названный нами латероцином и обладающий цианолитической активностью, относится к семейству тироцидиновых антибиотиков.

Пример 5. Определение молекулярной массы пептида латероцина и подтверждение его структуры методом масс-спектрометрии

Масс-спектры получают на гибридном масс-спектрометре LTQ FT (Thermo Electron, Германия), который состоит из линейной квадрупольной ионной ловушки и масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ). В качестве источника ионов используют универсальный источник ионизации Finnigan Ion Max Source (Thermo Electron, Германия) в режиме электрораспыления. Для пептида латероцина наблюдают однозарядный ион с m/z 1241,61, соответствующий протонированному молекулярному иону (М+Н) ⁺ и моноизотопной молекулярной массе пептида 1240,60±0,01 Да. Полученная масса с учетом точности измерения совпадает с расчетной моноизотопной молекулярной массой пептида латероцина (1240,60 Да). Масс-спектрометрический анализ подтверждает заявляемую структуру пептида латероцина.

Пример 6. Определение спектра цианолитической активности латероцина

Цианолитическую активность латероцина выявляют при смешанной инкубации пептида с двухнедельными культурами различных микроводорослей. Измеряют оптическую плотность смеси на спектрофотометре при длине волны 590 нм в нулевой момент времени и после инкубации при комнатной температуре и круглосуточном освещении. Цианолитическую активность оценивают по падению оптической плотности через 24 часа инкубации. Определяют остаточную оптическую плотность по формуле: (ОП _О), как (ОП_Т/ОП_Н)×100, где ОП _Н - начальная ОП, ОП_Т - ОП - после инкубации в течении Т часов соответственно. Латероцин вызывает падение оптической плотности в инкубационных смесях (таблица 1). При оптической микроскопии выявляется лизис клеток цианобактерий.

Таблица 1.
Цианолитическая активность латероцина.
Образец сине-зеленых водорослей	Остаточная оптическая плотность через 24 часа (%)
Микроводоросли
Nostoc	Anabaena	Microcystis aeruginosa
Без добавления латероцина	100	100	100
С добавлением латероцина	23,50	28,60	35,25

Пример 7. Определение минимальной цианолитической концентрации латероцина методом измерений интенсивностей флуоресценции хлорофилла на суспензиях микроводорослей

Регистрацию интенсивностей флуоресценции хлорофилла проводят на флуорометре с амплитудной модуляцией возбуждающего света «МЕГА-25». В качестве детектора флуоресценции в этом приборе используют фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) R7400U-20 фирмы «HAMAMATSU». Перед ФЭУ устанавливают граничный светофильтр КС 18, позволяющий регистрировать флуоресценцию хлорофилла с длиной волны более 680 нм. Для исключения недопустимой засветки ФЭУ прибор снабжают шторкой, автоматически закрывающей ФЭУ при открытии камеры. Интенсивность флуоресценции хлорофилла при открытых (F₀) и закрытых (Fm) реакционных центрах фотосистемы 2 проводят при возбуждении светом с плотностью мощности 0,8 мкмоль·м^-2·с^-1 и 6000 мкмоль·м^-2·с^-1 соответственно [17, 18].

Отношение (Fm-Fo)/Fm (относительная переменная флуоресценция) равно потенциально возможной эффективности использования энергии света РЦ ФС 2 и является безразмерной величиной, способной приобретать значения от 0 до 0,84 в зависимости от состояния фотосинтетического аппарата растительного объекта. Величина относительной переменной флуоресценции может быть определена для любых растительных организмов и не зависит от содержания хлорофилла в исследуемой пробе.

Для оценки минимальной цианолитической концентрации латероцина используют метод измерения эффективности использования энергии света РЦ ФС 2 по флуоресценции хлорофилла. Измерение интенсивностей флуоресценции хлорофилла проводят на флуорометре с амплитудной модуляцией возбуждающего света.

Флуоресценцию определяли фотоэлектрическим умножителем через граничный фильтр, пропускающий свет с длиной волны больше 680 нм. Интенсивность флуоресценции хлорофилла при открытых (F₀) и закрытых (Fm) реакционных центрах фотосистемы 2 проводили при возбуждении светом с плотностью мощности 0,8 мкмоль · м^-2 · с^-1 и 6000 мкмоль · м^-2 · с^-1 соответственно.

Таблица 2.
Влияние латероцина на эффективность использования энергии света РЦ ФС 2 на суспензию цианобактерий Nostoc, измеренное по значению переменной флуоресценции хлорофилла (Fm-Fo)/Fm.
Концентра ция латероцина, мкг/мл	Время инкубации, час
0	0,25	0,66	1	1,66	3	5	24
Контроль Nostoc sp.	0,51	0,5	0,51	0,5	0,5	0,51	0,5	0,53
4	0,51	0,5	0,5	0,46	0,5	0,5	0,5	0,54
10	0,51	0,49	0,48	0,48	0,45	0,47	0,44	0,48
40	0,49	0,47	0,44	0,43	0,37	0,35	0,3	0,35
100	0,46	0,46	0,39	0,36	0,28	0,21	0,22	0,15

Из таблицы 2 следует, что латероцин подавляет процессы фотосинтеза цианобактерий в концентрациях выше чем 10 мкг/мл.

Пример 8. Определение минимальной цианолитической концентрации латероцина при регистрация спектров поглощения суспензий микроводорослей

Регистрацию спектров поглощения суспензий цианобактерий проводят в диапазоне от 350 до 850 нм на однолучевом спектрофотометре с интегрирующей сферой на базе спектрометра USB 2000 ("Ocean Optics", США) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см [19]. Разрушение фикобилинов цианобактерий определяют по отношению поглощения при 630 нм, соответствующему максимуму поглощения фикоцианина, к поглощению при 680 нм, соответствующему поглощению хлорофилла.

Таблица 3.
Влияние латероцина на разрушение фикобелинов суспензии цианобактерий Nostoc, измеренное по значению отношения оптических плотностей при 630 нм и 680 нм.
Концентрация латероцина, мкг/мл	Время инкубации, час
0	1,33	3	5
Контроль Nostoc	1,163	1,163	1,163	1,163
4	1,163	н/д	1,152	1,150
10	1,163	1,135	1,121	1,094
40	1,163	1,032	0,968	0,902
100	1,163	0,962	0,854	0,747

Из таблицы 3 следует, что действие латероцина приводит к разрушению фикобилинов цианобактерий в концентрациях выше, чем 10 мкг/мл.