способ экспресс-диагностики ротавирусной инфекции в материалах из верхних дыхательных путей, иммуноглобулин флуоресцирующий сухой для его осуществления

Формула изобретения

1. Флуоресцирующий противоротавирусный конъюгат иммуноглобулина для определения антигена ротавируса, характеризующийся тем, что он представляет собой конъюгированный с флуоресциинизотиоцианатом (ФИТЦ) противовирусный иммуноглобулин, полученный из сыворотки крови кролика, иммунизированного ротавирусом G1P6, причем конъюгат получают при высаливании иммуноглобулина сернокислым аммонием в течение 16-29 ч при температуре (3±1)°С в виде осадка, который отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 2000 g при температуре (20±5)°С, растворяют в фосфатно-солевом буферном растворе, очищают от солей на колонке с сефадексом с последующим добавлением к раствору полученного иммуноглобулина при температуре (18±2)°С раствора ФИТЦ, перемешиванием в течение 2 ч, очисткой на колонке с сефадексом, консервированием жидкого конъюгата, который имеет соотношение ФИТЦ: иммуноглобулин 3,5:1 при концентрации иммуноглобулина в жидком конъюгате (1,5±0,5)%, мертиолатом и лиофильным высушиванием методом сублимационной сушки в течение 2 ч.

2. Флуоресцирующий противоротавирусный конъюгат иммуноглобулина по п.1, характеризующийся тем, что содержит мертиолат при концентрации его в препарате 1:10000.

3. Флуоресцирующий противоротавирусный конъюгат иммуноглобулина по п.2, характеризующийся тем, что является сухим лиофильно высушенным порошком, имеющим остаточную влажность не более 2,5%.

4. Способ экспресс-диагностики ротавирусной инфекции в материалах из верхних дыхательных путей, включающий взятие мазка, обработку его фосфатно-солевым буферным раствором, получение суспензии клеток центрифугированием, отличающийся тем, что полученные клетки цилиндрического эпителия слизистой оболочки носовой полости наносят на предметные стекла и антиген ротавируса в них определяют путем обработки стекол флуоресцирующим противоротавирусным конъюгатом иммуноглобулина по п.1 и подсчета флуоресцирующих клеток с помощью люминесцентного микроскопа, причем диагноз устанавливают при наличии специфического свечения 3-5 и более пораженных вирусом клеток.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской вирусологии и диагностике инфекционных болезней. Оно может быть использовано для экспресс-диагностики ротавирусной инфекции, протекающей как с симптомами поражения респираторного тракта, так и без них. Диагностику осуществляют путем прямого метода иммунофлуоресценции, что ранее не делали из-за отсутствия необходимого флуоресцирующего препарата иммуноглобулина.

Ротавирусная инфекция представляет собой глобальную медицинскую проблему. Ее переносит практически каждый человек, что подтверждается обнаружением специфических противоротавирусных антител - иммуноголобулинов G (IgG) у 60-90% детей уже в 6-летнем возрасте [Васильев Б.Я. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция, 2000. - 267 с.].

Ротавирус с момента первого выделения в Китае в 1984 г. долгое время рассматривался только как причина острых гастроэнтеритов у людей [Desselberger, U. - John Wiley & Sons, Ltd., 2000. - P.236-252., Viral Infections of the Gastrointestinal Tract. - N.Y., 1994. - Vol.5. - P.101-130.]. Однако в 90-х годах прошлого столетия рядом авторов помимо поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) отмечена большая частота развития катаральных симптомов в носоглотке как характерный признак инфекции, в связи с чем некоторое время заболевание носило название «кишечный грипп» [ЖМЭИ. - 1991. - № 4. - С.23-25, Actual.pharm. - 1991. - N.293. - Р.44-45.]. Кроме того, в 2007 г. показана одна из лидирующих ролей ротавирусной инфекции в этиологической структуре сочетанного поражения респираторного и ЖКТ у детей, являющейся причиной данной патологии в 25,6% случаев [Острые вирусные инфекции с сочетанным поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов у детей. - СПб, 2007. - 90 с.].

В настоящее время уже описаны морфологические изменения в верхних дыхательных путях (ВДП) при ротавирусной инфекции [Chin. Med. J. (Engi). - 1991. - Vol.104 (10). - P.830-833. J. Med. Virol. - 1991. - Vol.34(1). - P.29-37.], а также показана возможность антиген- и вирусемии с поражением ротавирусами многих органов и тканей [PLoS Medicine. - 2007. - Vol.4. - Issue 4. - e121. - P.0660-0668.].

Данные клинических наблюдений были подтверждены результатами лабораторных исследований. Новикова Н.А. с соавторами в 76,3% случаев гастроэнтеритов ротавирусной этиологии выявляла РНК этих вирусов в носоглоточных смывах [ЖМЭИ. - 1991. - № 4. - С.23-25.]. Аналогичные результаты были получены и в работах зарубежных исследователей, использовавших в качестве изучаемого материала также бронхолегочные аспираты [Chin. Med. J. (Engi). - 1991. - Vol.104(10). - P.830-833., J. Med. Virol. - 1991. - Vol.34(1). - P.29-37.].

Единственным методом, используемым для диагностики ротавирусной инфекции в ВДП, в настоящее время является полимеразная цепная реакция (ПЦР), для выполнения которой (помимо одинаковых для всех ПЦР наборов реагентов, отличающихся высокой стоимостью) при диагностике определенной инфекции необходимо наличие специфических праймеров. Обычно эти короткие олигонуклеотиды, длиной порядка двадцати оснований, получаемые в результате химического синтеза. Они комплементарны искомой ДНК-мишени, гибридизуются с ней, а затем копируются полимеразой. Кроме того, для диагностики РНК-содержащих вирусов в состав реакционной смеси необходимо дополнительное введение обратной транскриптазы. Однако ПЦР имеет неоспоримые недостатки, заключающиеся в ряде его преимуществ. И в первую очередь, высокая чувствительность метода (позволяет выявить всего лишь одну молекулу нуклеиновой кислоты в пробе) нередко приводит к получению ложноположительного результата, связанного либо с персистенцией вирусов, либо с контаминацией образцов на разных этапах диагностического процесса (забор материала, хранение и транспортировка, пробоподготовка и т.д.) [Детские инфекции. - 2006. - № 1. - С.61-64.; J. Med. Virol. - 2006. - Vol. 78(11). - P.1498-1504.]. Поэтому ПЦР требует для своего выполнения несколько специальных помещений для разделения разных этапов диагностического процесса, снабженных отдельными комплектами оборудования, материалов, лабораторной одежды. Во-вторых, несмотря на то, что новейшие достижения генной инженерии и биотехнологии позволяют в одной реакции амплификации определять нескольких возбудителей (Multiplex PCR), чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению реагентов и ограничивается одновременным определением 3-х разных возбудителей, т.е. невозможно проведение дифференциальной диагностики с большим количеством возбудителей в одной реакции, а при необходимости таковой во много раз увеличивает стоимость исследования. В-третьих, спектр применения ПЦР в условиях практического здравоохранения пока ограничивается и достаточно высокой стоимостью препаратов, квалификацией исследователей и необходимостью специального оборудования. Кроме того, и главное: обнаружение РНК ротавирусов в материалах из ВДП методом ПЦР не доказывает факт их репродукции в клетках слизистых оболочек, а может являться следствием контаминации носоглотки рвотными массами, содержащими вирус.

Выбранный нами метод прямой иммунофлуоресценции (ИФМ) ранее не использовался для диагностики ротавирусной инфекции в материалах из ВДП, так как долгое время оставался открытым вопрос о самой возможности поражения респираторного тракта ротавирусами.

В то же время, ИФМ широко применяется с целью этиологической расшифровки респираторных инфекций, отличаясь простотой, скоростью, низкой стоимостью и, в целом, не уступает по чувствительности и специфичности другим методам [J. Clin. Virol. - 1999. - Vol.14. - P.133-136; J. Clin. Microbiol. - 1987. - Vol.25(2). - P.355-357.].

Минимальное количество вещества, определяемое ИФМ, составляет около 10⁵ - 10⁶ тесно расположенных молекул антигена. Во многих странах мира он введен как обязательный диагностический тест для распознавания ряда инфекционных заболеваний непосредственно в клинических материалах от больного и позволяет одновременно определять антигены неограниченного числа возбудителей, что нередко исключает необходимость использования дополнительных методов исследования.

Отличительной особенностью ИФМ и его преимуществом является возможность положительного результата только при условии репродукции искомого вируса в клетках, что позволяет уже на ранних сроках заболевания назначить адекватную этиотропную терапию и ограничить использование антибиотиков, неэффективных при вирусной этиологии заболевания, а также способствующих развитию дисбиоза и формированию устойчивых штаммов бактерий.

Как и в случае с ПЦР, ИФМ не ограничен использованием определенных материалов для исследования. Это могут быть эпителиальные клетки слизистых, клеточные культуры, зараженные материалом от больного, биоптаты и секционный материал и др. Однако в отличие от ПЦР обработка проб не требует строгих предосторожностей для предотвращения контаминации. Для проведения реакции достаточно наличия одного помещения, в котором может располагаться все необходимое оборудование, материалы и лабораторная одежда. Кроме того, диагностика ДНК- и РНК-содержащих вирусов проводится одновременно и не требует дополнительных расходов на реагенты.

Методика проведения ИФМ чрезвычайно проста и не нуждается в использовании дорогостоящего оборудования, однако необходима квалификация исследователя и опыт работы, так как оценка результатов носит субъективный характер. Результат считают положительным, если в препарате обнаруживают 3-5 и более пораженных вирусом клеток, дающих в люминесцентном микроскопе под влиянием коротковолновой части спектра (сине-фиолетовых лучей) видимое длинноволновое (зеленое) свечение на 3-4+ (проявляется в виде четкой диффузной или гранулярной флуоресценции, локализованной в ядрах или цитоплазме клеток) [Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом, 2006].

Задачей настоящей работы явилась разработка нового способа экспресс-диагностики ротавирусной инфекции в материалах из ВДП на основе ИФМ, а также получение препарата, необходимого для его осуществления. Способ позволяет получить результат уже в первые сутки от начала заболевания и дает возможность проводить дифференциальную диагностику катаральных явлений в ВДП с известными респираторными инфекциями. Его осуществляют путем определения антигенов возбудителя в эпителиальных клетках слизистой носа.

Первым этапом работы было получение диагностического препарата, в отличие от праймеров ПЦР не связанное с процессом химического синтеза. С этой целью было необходимо получить сыворотку крови предварительно иммунизированного ротавирусом кролика, содержащую высокий титр противоротавирусных антител. Затем выделить иммуноглобулин и провести его конъюгацию с флуоресциинизотиоцианатом.

«Иммуноглобулин флуоресцирующий сухой для ранней диагностики ротавирусной инфекции» получен на основе штамма, выделенного из фекалий пациента Н., 6 лет, госпитализированного с симптомами острого гастроэнтерита в ФГУ «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2006 г.). Ротавирусная этиология заболевания у пациента была доказана методом просвечивающей микроскопии (фиг.1. Электронная микрофотография. 1. Скопление частиц ротавируса в осадке культуральной жидкости. Негативное контрастирование, масштабный отрезок 100 нм. Использовался электроный микроскоп JEM-100S (JEOL, Япония), затем вирус типирован как G1P6 по методике Fischer [J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol.38(1). - P.264-267; Rev. Med. Virol. - 2004. - Vol.14(2). - P.71-82.].

Биомассу ротавируса накапливали в клеточной культуре МА104 (почка обезьяны резус макаки). Заражение клеток проводили 10% суспензией фекалий пациента Н. с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и линкомицина) в расчете 200 ед. на 1 мл среды. Полученную вируссодержащую жидкость осветляли путем ультрацентрифугирования, затем проводили очистку в градиенте плотности сахарозы с последующим осаждением и определением концентрации белка. 800 мкг полученного концентрата белка соединяли в равных концентрациях с адъювантом и проводили двукратную иммунизацию кролика.

В первый раз вводили 1 мл внутрикожно, через 14 дней - 1-2 мл внутримышечно. На 21 день брали пробную сыворотку и проверяли титр соответствующих противовирусных антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) с помощью антивидовой (против глобулинов кролика) люминесцирующей сыворотки. Сыворотки с титром антител 1:160 и выше использовали для получения противовирусного иммуноглобулина (забор крови осуществлялся еженедельно в течение 1-1,5 месяцев).

Осаждение противоротавирусного иммуноглобулина из сыворотки кролика проводили неспецифическим высаливанием сернокислым аммонием 75% насыщения. Затем проводили очистку раствора иммуноглобулина от солей на сефадексе G-25.

Содержание белка определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Процентное содержание белка (2,5±0,5)% определяли по формуле:

Б=Е^ИГ ₂₈₀×50/Е^ИГ ₂₈₀,

где Е^ИГ ₂₈₀ - средняя величина экстинции 1%-раствора глобулиновой фракции нормальной сыворотки кролика при длине волны 280 нм, составляющая 9±1.

Противоротавирусный иммуноглобулин из сыворотки крови кролика, полученный высаливанием, конъюгировали с флуоресциинизотиоцианатом - ФИТЦ (марка Sigma) из расчета 2 мг ФИТЦ на 100 мг белка с последующей очисткой от несвязавшегося флуорохрома. Из большого числа флуоресцентных веществ (флуоресцеин, кумарин, родамин, фикоэритрин, хлорид сульфородаминовой кислоты (техасский красный) и др.) выбор ФИТЦ в качестве флуоресцентной метки полученного противоротавирусного иммуноглобулина был основан на широком использовании именно его в предлагаемом иммунофлуоресцентом методе, что делает полученный конъюгат совместимым с уже имеющимися для диагностики других вирусных инфекций. Благодаря удовлетворительным спектральным характеристикам (высокий квантовый выход флуоресценции, максимум эмиссии которой лежит в видимой области спектра) и хорошей растворимости в воде ФИТЦ соответствует требованиям для осуществления поставленной задачи [Биоорганическая химия, 1987, том 13, с.1606-1608].

Жидкий препарат (конъюгат) консервировали мертиолатом, добавляя 1 мл 1%-ного раствора мертиолата на 100 мл конъюгата (конечная концентрация мертиолата в препарате 1:10000).

Затем определяли красящий титр (специфическую активность) полученного конъюгата, который составил 1/16. В работе использовалось разведение 1/8.

В полученном жидком конъюгате (слегка опалесцирующей жидкости зеленовато-желтого цвета) определяли концентрацию белка (1,5±0,5%) и соотношение ФИТЦ/белок (до 3,5). Свободного ФИТЦ препарат не содержал. Затем его разливали по 1 мл в ампулы, проводили лиофильную сушку и ампулы запаивали.

Полученный сухой препарат имел вид аморфной массы от желто-оранжевого до оранжевого цвета. Остаточная влажность составляла не более 2,5%. При добавлении в ампулу 1,0 мл дистиллированной воды при непрерывном встряхивании содержимое полностью растворялось в течение 3 минут. Растворенный препарат при визуальном определении в проходящем свете представлял собой слегка опалесцирующую жидкость зеленовато-желтого цвета без осадка и посторонних включений.

Предлагаемый диагностикум получен впервые. Его преимуществом является возможность длительного хранения ампул с сухим конъюгатом, а также легкость применения в любых диагностических лабораториях.

На втором этапе работы проведено сравнение диагностической ценности предложенного экспресс-метода диагностики ротавирусной инфекции (ИФМ) с ПНР. Учитывая высокую чувствительность последней и, в связи с этим, возможность получения положительного результата в ней по причине контаминации образцов из носоглотки рвотными массами, материал для обоих методов исследования забирался только из носовых ходов.

Забор осуществляли двумя стерильными ватными тампонами, которые вводили через носовые отверстия вглубь нижних носовых ходов, ротационными движениями собирали эпителиальные клетки (цилиндрический эпителий слизистой оболочки носовой полости). Затем тампоны погружали в пробирки с ФСБ в концентрации 0,01 моль/л (pH 7,2-7,5). Для получения суспензии клеток ватные тампоны встряхивали и отжимали. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5-6 минут. Надосадочную жидкость сливали, клеточный осадок ресуспендировали в нескольких каплях оставшегося раствора, затем 100 мкл вносили в одноразовую пробирку типа «Эппендорф» с консервирующим раствором для ПЦР, а оставшуюся часть наносили на предметные стекла раздельными каплями для иммунофлуоресцентного исследования. Полученные мазки высушивали и фиксировали в течение 10 минут в охлажденном (4°С) ацетоне.

Перед окраской препаратов готовили рабочий раствор флуоресцирующего иммуноголбулина. С этой целью «Иммуноглобулин флуоресцирующий сухой для ранней диагностики ротавирусной инфекции» (конъюгат) растворяли в 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывали, фасовали по 0,1 мл и хранили при температуре не выше +10°С. Непосредственно перед употреблением конъюгат разводили ФСБ для получения рабочего разведения (1/8). Разведенный конъюгат хранили при t+4°C в течение 20 дней.

Во время окраски фиксированные препараты помещали во влажную камеру, на каждый мазок наносили каплю (50 мкл) рабочего разведения флуоресцирующего иммуноглобулина и оставляли на 30 минут. Затем препарат ополаскивали дистиллированной водой и погружали в ФСБ pH 7,2-7,5. ФСБ меняли 2 раза, препараты промывали покачиванием 10 минут, после чего ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.

Анализ препаратов проводили с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-2 с использованием иммерсионного объектива ×90, сине-фиолетовых светофильтров возбуждения (СФ-1-2, СЗС-7-2) и запирающего светофильтра № 2. Использовали только нефлуоресцирующее иммерсионное масло.

При люминесцентной микроскопии препаратов в мазках из нижних носовых ходов выявляли различные эпителиальные клетки, лейкоциты, клеточный детрит, слизь. Диагностически значимым считали обнаружение вирусных антигенов в клетках цилиндрического эпителия в виде четкой диффузной или гранулярной флуоресценции, локализованной в ядрах или цитоплазме клеток. Во время учета результатов не учитывали свечение крупных, полигональных клеток плоского эпителия, лейкоцитов и клеточного детрита.

Результат исследования расценивали как положительный в случаях обнаружения 3-5 и более пораженных ротавирусом клеток, флуоресцирующих специфическим зеленым цветом (Фиг.2. Люминисцентная микроскопия. Специфическое свечение эпителиальных клеток слизистой носа, пораженных ротавирусом).

ПЦР выполняли согласно прилагаемой инструкции в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ГУ НИИ гриппа РАМН (рук. к.б.н. Грудинин М.П.) с использованием коммерческой ПЦР-тест-системы фирмы «АмплиСенс» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспротребнадзора).

С целью сравнения точности результатов применения ИФМ с ПЦР при диагностике ротавирусной инфекции в материалах из ВДП было обследовано 110 пациентов в возрасте от 1 мес до 17 лет, госпитализированных с симптомами желудочно-кишечной (ЖК) дисфункции (в том числе в 58,1% случаев сопровождавшихся катаральными явлениями в носоглотке). В целом, статистически значимых различий в частоте выявления ротавирусной инфекции в материалах из ВДП сравниваемыми методами не выявлено (в 17,3 и 22,7% соответственно, р>0,05) (табл.1). Кроме того, отмечено, что положительный результат исследования достоверно чаще выявлялся в случаях с доказанной ротавирусной инфекцией в фекалиях с некоторым преимуществом ПЦР, однако без статистически значимых различий (ПЦР выявляла ротавирусную инфекцию в 1,3 раза чаще чем ИФМ). Данный факт может объясняться большей чувствительностью ПЦР, а также вероятностью контаминации носовых ходов во время рвоты.

Таблица 1
Сравнительные результаты использования ИФМ и ПЦР при диагностике ротавирусной инфекции в материалах из ВДП
Результат исследования фекалий на ротавирус	Число материалов из ВДП	С положительным результатом (абс./%)
ИФМ	ПЦР
пол.	55	16/29,1*	22/40,0*
отр.	49	2/4,1	3/6,1
не обследован	6	1/16,7	0
Всего	110	19/17,3	25/22,7
Пол. - положительный; отр. - отрицательный; нет - исследования фекалий на ротавирус не проводилось; * - различия статистически значимы при сравнении с результатами в группе с отрицательным результатом исследования фекалий на ротавирус.

Обнаружение ротавирусной инфекции в материалах из ВДП у пациентов с невыявленной ротавирусной инфекцией в фекалиях зафиксировано в единичных случаях при использовании как ИФМ, так и ПЦР. Это может объясняться ложноположительным результатом в любом из методов, в том числе и при исследовании фекалий, а также возможностью изолированного поражения ротавирусом респираторного тракта, как показано другими исследователями [Chin. Med. J. (Engl). - 1991. - Vol.104(10). - P.830-833; J. Med. Virol. - 1991. - Vol.34(1). - P.29-37; PLoS Medicine. - 2007. - Vol.4. - Issue 4. - e121. - P.0660-0668.].

Сравнительный анализ диагностических параметров ИФМ с ПЦР проведен по методу Buck and Cart (табл.2).

Таблица 2
Диагностические параметры ИФМ для диагностики ротавирусной инфекции в материалах из ВДП в сравнении с результатами ПЦР
Результат ИФМ	Результат ПЦР (абс)	Диагностические параметры (%)
+	-	Чувствительность	Специфичность	Общее совпадение
+	16	5	59,3%	94,0	85,5
-	10	79
(+) - положительный; (-) - отрицательный.

Выявленная умеренная чувствительность ИФМ диагностики ротавирусной инфекции в материалах из ВДП (59,3%) при специфичности в 94,0% свидетельствует скорее о его преимуществе перед ПЦР, так как доказывает факт репродукции ротавируса в эпителии слизистой носа и, соответственно, участия в патогенезе заболевания. Напротив, результат ПЦР лишь свидетельствует о присутствии вируса (в 18% случаев ПЦР выявляет ротавирусную инфекцию в фекалиях здоровых детей) [J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol.46(5). - Р.1842-1843.].

В практической работе ИФМ имеет явное преимущество перед ПЦР: доступность метода исследования позволяет точно установить диагноз и своевременно назначить необходимое лечение.

Третий этап работы заключался в использовании полученного препарата («Иммуноглобулина флуоресцирующего сухого для ранней диагностики ротавирусной инфекции») для выявления антигенов ротавируса в материалах из носоглотки больных. В исследование были включены пациенты с клиническими проявлениями острой кишечной инфекции (ОКИ), протекающей как изолированно (группа ОКИ, n=129), так и в сочетании с симптомами поражения верхних дыхательных путей, т.е. острым респираторным заболеванием (ОРЗ) (группа ОРЗ + ОКИ, n=109). Контрольную группу составили дети с респираторными заболеваниями без симптомов ЖК дисфункции (группа ОРЗ, n=159). Полученные результаты выявили взаимосвязь между частотой обнаружения ротавирусного антигена в материалах из ВДП и этиологией ЖК дисфункции, а также клинической картиной заболевания. Получены статистически значимые различия в частоте обнаружения ротавирусной инфекции в материалах из ВДП у пациентов с доказанной ротавирусной инфекцией в фекалиях как в группе с ОКИ, так и ОРЗ + ОКИ (соответственно в 5,5 раз и в 9,9 раз чаще, чем у детей с отрицательным исследованием фекалий на ротавирус) (табл.3).

Таблица 3
Частота обнаружения ротавирусной инфекции в материалах из ВДП с помощью ИФМ у пациентов сравниваемых групп
Группы наблюдения:	Число обследованных	Результат ИФМ на ротавирус (абс./%)
+	-
ОКИ	Всего:	129	18/14,0	111/86,0
ротавирус в фекалиях (+)	56	14/25,0*	42/75,0*
ротавирус в фекалиях (-)	73	4/5,5	69/94,5
ОРЗ+ОКИ	Всего:	109	18/16,5	91/83,5
ротавирус в фекалиях (+)	49	16/32,7*	33/67,3*
ротавирус в фекалиях (-)	60	2/3,3	58/96,7
ОРЗ	Всего:	159	2/1,3**	157/98,7
* - различия статистически значимы при сравнении с результатами в группе с отрицательным результатом исследования фекалий на ротавирус (р<0,01);
** - различия статистически значимы при сравнении с отрицательным результатом ИФМ в группе (р<0,001).

Кроме того, отмечено, что антиген ротавируса в материалах из ВДП определялся несколько чаще у пациентов с ротавирусным гастроэнтеритом, протекающим с катаральными явлениями в носоглотке, чем без них (в 32,7% и 25,0% случаев соответственно, р>0,05). Напротив, у детей обеих групп (ОКИ, ОРЗ + ОКИ) с отсутствием ротавируса в фекалиях ИФМ в большинстве случаев (в 94,5 и 96,7%) оказался отрицательным.

При обследовании детей контрольной группы (ОРЗ) антиген ротавируса определялся в единичных случаях (в 1,3%, р<0,001), что свидетельствует об отсутствии неспецифической активности у предлагаемого иммуноглобулина противоротавирусного сухого в ИФМ диагностики, а также возможность изолированного поражения ротавирусом респираторного тракта [Chin. Med. J. (Engl). - 1991. - Vol.104(10). - P.830-833; J. Med. Virol. - 1991. - Vol.34(1). - P.29-37; PLoS Medicine. - 2007. - Vol.4. - Issue 4. - e121. - P.0660-0668.].

Таким образом, оправданность применения предлагаемого нами способа диагностики ротавирусной инфекции в материалах из ВДП объясняется рядом причин:

1) метод прост в исполнении и доступен большинству диагностических лабораторий;

2) не требует больших материальных затрат;

3) позволяет одновременно проводить дифференциальную диагностику с большинством возбудителей респираторных инфекций (гриппом и парагриппом, адено- и респираторно-синцитиальными вирусами, микоплазмой, хламидией и др.);

4) уступая ПЦР в чувствительности, доказывает факт репродукции инфекции в ВДП и таким образом, снижает вероятность неправильной трактовки причин развития катаральных явлений в носоглотке;

5) обладает сравнимой с ПЦР специфичностью (94,0%);

6) доказывает ротавирусную этиологию катаральных явлений в носоглотке в 32,7% случаев ротавирусного гастроэнтерита у детей.

Примеры выполнения:

I. «Иммуноглобулин флуоресцирующий сухой для ранней диагностики ротавирусной инфекции» получен на основе штамма, выделенного из фекалий пациента Н., 6 лет, госпитализированного с симптомами острого гастроэнтерита в ФГУ «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2006 г.). Ротавирусная этиология заболевания у пациента была доказана методом просвечивающей микроскопии (фиг.1. Электронная микрофотография. 1. Скопление частиц ротавируса в осадке культуральной жидкости. Негативное контрастирование, масштабный отрезок 100 нм. Использовался электронный микроскоп JEM-100S (JEOL, Япония), затем вирус типирован как G1P6 по методике Fischer.

Биомассу ротавируса накапливали в клеточной культуре МА104 (почка обезьяны резус макаки). Заражение клеток проводили 10% суспензией фекалий пациента Н. с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и линкомицина) в расчете 200 ед. на 1 мл среды. Полученную вируссодержащую жидкость осветляли путем ультрацентрифугирования, затем проводили очистку в градиенте плотности сахарозы с последующим осаждением и определением концентрации белка. 800 мкг полученного концентрата белка соединяли в равных концентрациях с адъювантом и проводили двукратную иммунизацию кролика.

В первый раз вводили 1 мл внутрикожно, через 14 дней - 1-2 мл внутримышечно. На 21 день брали пробную сыворотку и проверяли титр соответствующих противовирусных антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) с помощью антивидовой (против глобулинов кролика) люминесцирующей сыворотки. Сыворотки с титром антител 1:160 и выше использовали для получения противовирусного иммуноглобулина (забор крови осуществлялся еженедельно в течение 1-1,5 месяцев).

Осаждение противоротавирусного иммуноглобулина из кроличьей сыворотки крови проводили неспецифическим высаливанием сернокислым аммонием 75% насыщения. К иммунной сыворотке кролика (50 мл) добавляли равный объем дистиллированной воды, затем в холодной комнате при температуре (3±1)°С по каплям из делительной воронки при постоянном перемешивании на магнитной мешалке добавляли 115 мл охлажденного до (4±0,5)°С насыщенного раствора сернокислого аммония. Смесь оставляли на 16-20 ч при температуре (3±1)°С для формирования осадка.

Осадок отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 2000 g при температуре (20±5)°С, надосадочную жидкость сливали. Осадок растворяли в 0,01 моль/л фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) в объеме, равном 1/3 исходного объема сыворотки.

Операцию осаждения иммуноглобулинов сернокислым аммонием повторяли. Осадок растворяли в 20-30 мл 0,01 моль/л ФСБ. Затем проводили очистку раствора иммуноглобулина от солей на сефадексе G-25. Для этого раствор иммуноглобулина (20-30 мл) центрифугировали в течение 20 мин при 2000 g при температуре (20±5)°С. Прозрачный раствор иммуноглобулина осторожно наслаивали на колонку с сефадексом G-25. Размер колонки - 3×30 см. Колонку соединяли с ультрафиолетовым абсорбциометром типа «Увикорд» и регистрирующим прибором. Открывали кран колонки. Скорость вытекания заполняющего раствора (0,1 моль/л фосфатный раствор pH 8,6) устанавливали равной 1-2 мл/мин.

После того, как весь белковый раствор поступал в колонку, последнюю присоединяли к бутыли с сифоном, заполненной фосфатным буферным раствором (ФБР) (0,1 М, pH 8,6). Вначале из колонки вытесняли раствор глобулина, что регистрировали по большому пику на самописце, фракцию, соответствующую большому пику, собирали. Материал второго, небольшого пика, соответствующего раствору соли, сбрасывали. Окончание этапа выхода глобулиновой фракции из колонки определяли по регистрации на самописце прямой линии после небольшого пика. Отсутствие солей аммония сернокислого определяли по отсутствию подъема прямой на самописце при прохождении выходящего раствора через ультрафиолетовый абсорбциометр, подсоединенный к колонке.

Иммуноглобулиновая фракция имела вид слегка опалесцирующей жидкости. Содержание белка определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Процентное содержание белка (2,5±0,5)% определяли по формуле:

Б=Е^ИГ ₂₈₀×50/ Е^ИГ ₂₈₀,

где Е^ИГ ₂₈₀ - средняя величина экстинции 1%-раствора глобулиновой фракции нормальной сыворотки кролика при длине волны 280 нм, составляющая 9±1.

Для дальнейшей конъюгации полученного противоротавирусного иммуноглобулина использовали флуоресциинизотиоцианат - ФИТЦ (марка Sigma) из расчета 2 мг ФИТЦ на 100 мг белка с последующей очисткой от несвязавшегося флуорохрома.

К раствору иммуноглобулина при температуре (18±2)°С по каплям добавляли раствор флуорохрома при перемешивании на магнитной мешалке. Перемешивание смеси продолжали 2 ч. Полученную опалесцирующую жидкость неочищенного конъюгата с зеленой флуоресценцией подвергали очистке. Для этого после удаления из колонки с сефадексом верхнего слоя ФБР осторожно наслаивали конъюгат, снимали зажим с резиновой трубки, надетой на нижний конец колонки. Гель пропитывался конъюгатом, после чего в колонку вносили 0,01 моль/л ФБР (pH 7,4-0,1), который вытеснял конъюгат (что заметно по изменению цвета колонки). С появлением зеленых капель очищенного конъюгата на выходе начинали его сбор, который заканчивали, когда начинался выход ФБР (слабо-желтые капли).

Жидкий препарат (конъюгат) консервировали мертиолатом, добавляя 1 мл 1%-ного раствора мертиолата на 100 мл конъюгата (конечная концентрация мертиолата в препарате 1:10000).

Красящий титр (специфическую активность) полученного конъюгата, который составил 1/16, определяли путем визуального наблюдения флуоресценции окрашенных им (иммуноглобулином диагностическим флуоресцирующим противоротавирусным) тест-препаратов (клеточные культуры, зараженные и не зараженные ротавирусом). Для этого готовили последовательные возрастающие разведения конъюгата 1:8, 1:16, 1:32 на ФСБ. В качестве тест-препаратов использовались препараты. В работе использовали разведение 1/8.

В полученном жидком конъюгате (слегка опалесцирующей жидкости зеленовато-желтого цвета) определяли концентрацию белка (1,5±0,5%) и соотношение ФИТЦ/белок (до 3,5). Свободного ФИТЦ препарат не содержал.

Жидкий препарат разливали по 1 мл в ампулы ШПВ-6, которые ставили в кассеты, закрывали марлевой салфеткой и загружали в камеры низкотемпературного прилавка, где выдерживали при температуре минус (50±4)°С не менее 24 ч.

Для лиофильного высушивания ампулы с препаратом помещали в аппарат для сублимационной сушки и включали вакуумный насос. Через 2 ч после загрузки при наличии в аппарате остаточного давления не более 13 кПа включали прогрев, постепенно повышая температуру до 25°С к концу первых суток. Сразу после сушки ампулы запаивали под вакуумом.

Полученный сухой препарат имел вид аморфной массы от желто-оранжевого до оранжевого цвета. Остаточная влажность составляла не более 2,5%. При добавлении в ампулу 1,0 мл дистиллированной воды при непрерывном встряхивании содержимое полностью растворялось в течение 3 минут. Растворенный препарат при визуальном определении в проходящем свете представлял собой слегка опалесцирующую жидкость зеленовато-желтого цвета без осадка и посторонних включений.

II. Пациенты:

1. Пациент К., 11 мес, поступил в первые сутки заболевания с жалобами на повторную рвоту, водянистый стул, лихорадку до 39,2°С, сухое подкашливание, слизистые выделения из носа, отсутствие аппетита.

При осмотре состояние средней степени тяжести, температура 39,0°С вялый, капризный, обезвоживание I ст. Отмечаются умеренные катаральные явления в носоглотке. Зев гиперемирован без налетов. Живот безболезненный, подвздут, урчание по ходу кишечника.

В результате обследования в первые сутки стационарного лечения антиген ротавируса выявлен в соскобе из носа с помощью ИФМ и в кале методом ИФА. В клиническом анализе крови без выраженных воспалительных изменений.

Проведена симптоматическая терапия: инфузионная глюкозо-солевыми растворами, ферменты, сорбенты. В качестве этиотропной терапии назначен индуктор интерферона. Антимикробная терапия не назначалась. Соблюдалась безмолочная диета.

На фоне проведенной терапии через 2 дня купированы симптомы обезвоживания, стихли катаральные явления в носоглотке. На пятые сутки пациент выписан в периоде ранней реконвалесценции.

Результаты бактериологического исследования получены на 4-е сутки стационарного лечения: в посевах кала на ОКИ и мазках из зева и носа без высева патогенной и условно-патогенной флоры.

2. Пациент Б., 2 года 1 мес., поступил в первые сутки заболевания с жалобами на многократную рвоту (до 20 раз), разжижение стула, лихорадку до 38,0°С, слизистые выделения из носа, отсутствие аппетита, вялость, недомогание.

При осмотре состояние средней степени тяжести, температура 38,9°С вялый, сонливый, обезвоживание I-II ст. Отмечаются умеренные катаральные явления в носоглотке. Зев гиперемирован без налетов. Живот безболезненный, подвздут, урчание по ходу кишечника.

В результате обследования в первые сутки стационарного лечения антиген ротавируса выявлен в соскобе из носа с помощью ИФМ и в кале методом ИФА. В клиническом анализе крови без выраженных воспалительных изменений.

Проведена симптоматическая терапия: инфузионная глюкозо-солевыми растворами, ферменты. Антимикробная терапия не назначалась. Соблюдалась безмолочная диета.

На фоне проведенной терапии через 2 дня купированы симптомы обезвоживания и интоксикации, стихли катаральные явления в носоглотке. На шестые сутки пациент выписан на амбулаторный режим с выздоровлением.

Результаты бактериологического исследования получены на 4-е сутки стационарного лечения: в посевах кала на ОКИ и мазках из зева и носа без высева патогенной и условно-патогенной флоры.

3. Пациентка Д., 3 года 4 мес, поступила на вторые сутки заболевания с жалобами на боли в животе, повторную рвоту, водянистый стул до 4 раз, лихорадку до 38,4°С, сухое подкашливание, вялость, недомогание.

При осмотре состояние средней степени тяжести, температура 37,6°С вялая, обезвоживание I ст. Отмечается сухое подкашливание, гиперемия зева без налетов. Живот безболезненный, подвздут, урчание по ходу кишечника.

В результате обследования в первые сутки стационарного лечения антиген ротавируса выявлен в соскобе из носа с помощью ИФМ и в кале методом ИФА. В клиническом анализе крови относительный нейтрофилез, лимфопения, СОЭ не ускорена.

Проведена симптоматическая терапия: инфузионная глюкозо-солевыми растворами, ферменты, сорбенты. Антимикробная терапия не назначалась. Соблюдалась безмолочная диета.

На фоне проведенной терапии через 2 дня купированы симптомы обезвоживания, стихли катаральные явления в носоглотке. На пятые сутки пациентка выписана на амбулаторный режим с выздоровлением.

Результаты бактериологического исследования получены на 4-е сутки стационарного лечения: в посевах кала на ОКИ и мазках из зева и носа без высева патогенной и условно-патогенной флоры.

4. Пациент З., 8 лет, поступил на вторые сутки заболевания с жалобами на боли в животе, повторную рвоту, водянистый стул до 5 раз, лихорадку до 38,2°С, недомогание, снижение аппетита, заложенность носа и слизистые выделения из него, кашель.

При осмотре состояние средней степени тяжести, температура 38,2°С вялый. Отмечается малопродуктивный кашель, гиперемия зева без налетов, умеренная заложенность носа, слизистые выделения. Живот безболезненный, не вздут, урчание по ходу кишечника.

В результате обследования в первые сутки стационарного лечения антиген ротавируса выявлен в соскобе из носа с помощью ИФМ и в кале методом ИФА. В клиническом анализе крови без воспалительных изменений.

Проведена симптоматическая терапия: инфузионная глюкозо-солевыми растворами, ферменты, сорбенты. Сосудосуживающие препараты в нос, отхаркивающие средства. Антимикробная терапия не назначалась. Соблюдалась безмолочная диета.

На фоне проведенной терапии через 3 дня купированы симптомы обезвоживания и интоксикации, на пятые - катаральные явления в носоглотке. На седьмые сутки пациент выписан на амбулаторный режим с выздоровлением.

Результаты бактериологического исследования получены на 4-е сутки стационарного лечения: в посевах кала на ОКИ и мазках из зева и носа без высева патогенной и условно-патогенной флоры.

5. Пациентка А., 15 лет, поступила в первые сутки заболевания с жалобами на боли в животе, рвоту до 10 раз, водянистый стул до 8 раз, лихорадку до 40,0°С, недомогание, вялость, отсутствие аппетита, умеренную заложенность носа и слизистые выделения из него.

При осмотре состояние средней степени тяжести, температура 39,2°С вялая, сонливая, обезвоживание I-II ст. Отмечаются умеренные катаральные явления в носоглотке: заложенность носа, слизистые выделения, гиперемия зева без налетов. Живот безболезненный, не вздут, урчание по ходу кишечника.

В результате обследования в первые сутки стационарного лечения антиген ротавируса выявлен в соскобе из носа с помощью ИФМ и в кале методом ИФА. В клиническом анализе крови умеренный нейтрофильный лейкоцитоз, СОЭ не ускорена.

Проведена симптоматическая терапия: инфузионная глюкозо-солевыми растворами, ферменты, сорбенты. Сосудосуживающие препараты в нос. Антимикробная терапия не назначалась. Соблюдалась безмолочная диета.

На фоне проведенной терапии через 2 дня купированы симптомы обезвоживания и интоксикации, на третьи - катаральные явления в носоглотке. На пятые сутки пациентка выписана на амбулаторный режим с выздоровлением.

Результаты бактериологического исследования получены на 4-е сутки стационарного лечения: в посевах кала на ОКИ и мазках из зева и носа без высева патогенной и условно-патогенной флоры.