4-гетеро-16 , 17 -циклогексанопрегнаны
Классы МПК: | C07J53/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован конденсированием с карбоциклическими кольцами или получением дополнительного кольца за счет образования непосредственной связи между двумя атомами углерода кольца C07J73/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновое ядро модифицировано замещением одного или двух атомов углерода гетероатомами A61P35/00 Противоопухолевые средства |
Автор(ы): | Левина Инна Соломоновна (RU), Куликова Лидия Егоровна (RU), Смирнов Александр Николаевич (RU), Шимановский Николай Львович (RU), Семейкин Александр Владимирович (RU), Карева Елена Николаевна (RU), Федотчева Татьяна Александровна (RU), Болотова Елена Николаевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Учреждение Российской академии наук Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (ИОХ РАН) (RU), Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-12-17 публикация патента:
20.08.2011 |
Изобретение относится к новым 4-окса- и 4-аза-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегнанам (4-окса- и 4-аза-прегна-D , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426044/8242.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -пентаранам), которые могут найти применение в медицине для лечения злокачественных опухолей, общей формулы I
где Х=0 или NR, R=R1=R 2=R4=H, при этом R1+R3 образуют связь. Указанные соединения получают путем окисления кольца А 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрогестерона перманганатом калия и периодатом натрия в присутствии карбоната натрия в 5-оксо-А-нор-3,5-секокислоту с последующим замыканием кольца А в последней в 4-окса-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегн-5-ен-20-он при обработке дегидратирующим агентом ацетатом натрия в Ac2O и в 4-аза-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426014/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегн-5-ен-20-он действием ацетата аммония в уксусной кислоте. Полученные соединения являются эффективными ингибиторами эстроген-стимулированной пролиферации клеток HeLa. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.
Формула изобретения
1. 4-Гетеро-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426530/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426530/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегнаны общей формулы I
, 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426737/2426737-s.gif" BORDER="0">
где Х-О или NR, R=R1=R2 =R4=Н, при этом R1+R3 образуют связь.
2. Соединения по п.1, 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426530/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426530/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион и 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426530/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="/images/patents/34/2426530/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексано-4-азапрегн-5-ен-3,20-дион, обладающие сродством к рецептору прогестерона и антипролиферативной активностью.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области химии природных и физиологически активных веществ, а именно к области стероидных гормонов, содержащих гетероатом в стероидном ядре, конкретно к новым 4-окса- и 4-аза-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегнанам (4-окса- и 4-аза-прегна-D , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -пентаранам), которые могут найти применение в медицине для лечения злокачественных опухолей.
Известно, что стероиды, содержащие гетероатом(ы) в стероидном скелете, могут обладать различными видами биологической (гормональной и негормональной) активности в зависимости от особенностей структуры и типа стероида [М. Ibrahim-Quali. Recent advances in oxasteroid chemistry. Steroids, 2007, 72, 475; Recent advances in azasteroid chemistry. Steroids, 2008, 73, 375]. Современной терапии гормонозависимых опухолей нужны препараты, останавливающие неконтролируемую пролиферацию (рост) раковых клеток. Наряду с различными цитостатическими препаратами для этой цели широко используются прогестины и антипрогестины - модуляторы рецептора прогестерона (РП). Среди них перспективную группу представляют прегна-D , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -пентараны - производные прогестерона с дополнительным карбоциклом D , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -положениях стероидного скелета, обладающие прогестагенной и антипрогестагенной активностями in vivo и пригодные для перорального применения.
Наиболее близким по структуре и свойствам является 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрогестерон II, который является активным прогестином, но его антипролиферативное действие невелико [А.В. Камерницкий, И.С. Левина. Прегна-D , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -пентараны. Прогестины и антипрогестины. Биоорган. химия, 2005, т.31, c.115 и 227]. Но среди этих описанных стероидов неизвестны пентараны, содержащие гетероатом в кольце А.
Задачей настоящего изобретения является создание новых стероидов, содержащих гетероатом в положении 4 кольца А и шестичленное кольцо D , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -положениях стероидного скелета, обладающих сродством к рецептору прогестерона и проявляющих антипролиферативную (ингибирующую рост раковых клеток) активность.
Поставленная задача достигается новыми 4-окса- и 4-аза-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегнанами общей формулы I
, 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0">
где X=O или NR, R=H, низший алкил, R 1=R2=H или R1+R2 образуют связь, R1=R3=R4=H или R 1+R3 образуют связь, и при этом R4 =Н.
Предлагаемые соединения получают путем окисления кольца А 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрогестерона II перманганатом калия и периодатом натрия в присутствии карбоната натрия в 5-оксо-А-нор-3,5-секокислоту III с последующим замыканием кольца А в последней в 4-оксастероид Iа при обработке дегидратирующим агентом ацетатом натрия в Ac 2O и в 4-азастероид Ib действием ацетата аммония в уксусной кислоте по следующей схеме:
, 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0">
Строение полученных соединений подтверждено данными элементного анализа, масс- и ЯМР 1Н и 13С спектрами.
Эффект замещения атома углерода в положение 4 на гетероатом в молекуле пентарана на связывание был апробирован по способности полученных соединений Ia и Ib взаимодействовать с РП цитозоля матки крысы. Для оценки сродства применили конкурентный анализ (вытеснение из комплексов с белками [3H]прогестерона II. Средние величины относительной конкурентной активности (ОКА) с применением в качестве стандарта высокоэффективного прогестина ряда пентаранов 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрогестерона II, который можно рассматривать как базовую структуру для заявленных соединений, представлены в таблице.
№ № | Соединение | ОКА, % |
П | Прогестерон | 93±8 (8)* |
II | 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Циклогексанопрогестерон | 100 |
Iba | 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион | 0.72±0.21 (8) |
Ib | 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Циклогексано-4-азапрегн-5-ен-3,20-дион | 0.84±0.26 (8) |
* Среднее ± стандартное отклонение. В скобках - количество измерений. |
Влияние пентаранов Ia и Ib на жизнеспособность опухолевых клеток изучено на клеточной линии рака шейки матки HeLa. Для проведения эксперимента суспензию клеток помещали в 96-луночный планшет. Исследуемые вещества растворяли в диметилсульфоксиде до концентрации 10-2 М, затем на среде инкубации до конечных концентраций в культуре 10-6 и 10-5 М. Во все лунки (кроме «чистого» контроля) также вносили эстрадиол до конечной концентрации 10-8 М и инкубировали в течение 6 суток. Жизнеспособность клеток оценивали по цветной реакции живых клеток с тетразолиевым красителем МТТ. Оптическую плотность контрольных образцов принимали за 100%-ную выживаемость клеток. Величина эстроген-стимулированной пролиферации рассчитывалась как разница между жизнеспособностью клеток контроля с эстрогеном (10-8 М эстрадиол) и в его отсутствие. Оба соединения Ia и Ib в исследованных дозах оказались эффективными ингибиторами эстроген-стимулированной пролиферации клеток HeLa: они на 90-100% ингибируют жизнеспособность клеток.
Пример 1
К раствору 1.105 г (3 ммоля) 16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегн-4-ен-3,20-диона II в смеси 40 мл третбутанола и 3 мл 40% водного Na2CO3 прибавляют при 60°С раствор 5.6 г (26.18 ммоллей) NaJO4 и 0.18 г (1.13 ммолей) KMnO4 в 25 мл воды и выдерживают при этой температуре 3 ч. Затем реакционную смесь охлаждают до 30°С и через 15 мин твердый осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой и объединенные фильтраты упаривают. Водный остаток подкисляют (рН 2) 6 М HCl, экстрагируют CH2Cl2, органический экстракт промывают водой и сушат Na2SO4 . После удаления растворителя получают 1.04 г (90%) секокислоты в виде бесцветной пены, которую используют в следующей стадии без дополнительной очистки. Часть кислоты очищают хроматографически на колонке. Элюирование смесью петр.эфир-ацетон - CH2 Cl2 (85:10:5) дает кристаллическую секокислоту III с т.пл. 179-182°С (из смеси эфир-гексан). ИК-спектр (CHCl 3), , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> см-1: 3600-3000, 1692. Спектр ЯМР 1 H ( , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , м.д., J/Гц): 0.75 (с, 3Н, Ме (18)); 1.15 (с, 3Н, Ме (19)); 2.15 (с, 3Н, Ме (21)); 3.0 (с, 1Н, 16Н).
Смесь 0.39 г (1 ммоль) кетокислоты III и 0.82 г (10 ммолей) высушенного при 180°С AcONa в 10 мл Ас2О кипятят 4 ч. К остатку после удаления Ac2O добавляют EtOAc и Н2 О, органический слой промывают насыщенным раствором NaCl, сушат Na2SO4 и растворитель удаляют в вакууме. Остаток очищают хроматографически. При элюировании смесью петр.эфир-ацетон (93:7) получают 0.198 г (53%) кристаллического 4-оксастероида Ia с т.пл. 158-160°С (из смеси ацетон-гексан). Найдено (%): С, 77.94; Н, 8.99. С24Н34О3. Вычислено (%): С, 77.80; Н, 9.25. Спектр ЯМР 1Н ( , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , м.д., J/Гц): 0.72 (с, 3Н, Ме (18)); 1.12 (с, 3Н, Ме (19)); 2.14 (с, 3Н, Ме (21)); 2.97 (с, 1Н, 16Н); 5.25 (д, 1Н, Н (6)).
Пример 2
Полученную аналогично примеру 1 кетокислоту III (0.34 г, 0.87 ммоля) и 0.40 г (5.2 ммоля) AcONH 4 в 10 мл лед.АсОН кипятят 6 ч. К остатку после удаления АсОН добавляют воду, выпавший коричневый порошок отфильтровывают, промывают водой и сушат на воздухе. После хроматографической очистки на колонке (элюирование смесью петр.эфир-ацетон 90:10 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 88:12) выделяют 0.21 г (65%) кристаллического 4-азастероида Ib с т.пл. 305-308°С (из смеси ацетон-гексан). Спектр ЯМР 1Н ( , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , м.д., J/Гц): 0.72 (с, 3Н, Ме (18)); 1.10 (с, 3Н, Ме (19)); 2.14 (с, 3Н, Ме (21)); 2.97 (с, 1Н, 16Н); 4.85 (м, 1Н, Н (6)); 7.85 (шир. с, 1Н, NH).
Пример 3. Метод определения связывания соединений Ia и Ib с РП цитозоля матки крысы
В работе используют половозрелых девственных самок крыс смешанной популяции массой 200-250 г. Животным вводят внутримышечно эстрадиол по 10 мкг в 200 мкл пропиленгликоля ежедневно на протяжении 4-х дней и их забивают декапитацией на 5-й день. Матки измельчают и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе при 0-4°С в течение 5 мин в буферном растворе, содержащем 10 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 10 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0.5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 1 мМ дитиотреит, 10% глицерин, при весовом соотношении ткань/буфер 1:6. Гомогенат центрифугируют при 4°С в течение 1 ч при 50000g. Надосадочную фракцию (цитозоль) с концентрацией белка 4-6 мг/мл используют немедленно. Используют [1,2,6,7- 3H]прогестерон с удельной радиоактивностью 86 Ки/ммоль (Санкт-Петербург).
Измерение относительной конкурентной активности (ОКА) стероидов для РП проводят с применением [ 3H]прогестерона в присутствии 3 мкМ гидрокортизона. Цитозоль матки (100 мкл) инкубируют при 0-4°С в течение 20 ч со 100 мкл смеси стероидов в буфере, включающей (60-80)·10 3 имп./мин (конечная концентрация 3-6 нМ) [3 H]лиганда и немеченый конкурент (конечные концентрации от 0 до 10 мкМ). Связанный белком и свободный лиганд разделяют инкубацией со 100 мкл 2% суспензии активированного угля Norit A (Serva, Германия), покрытого декстраном-70 (Fluka, Швейцария) в течение 5 мин при 0-4°С. После центрифугирования в течение 5 мин при 3000g отбирают аликвоты (250 мкл) надосадочной фракции для измерения радиоактивности. Инкубацию проводят в кварцевых пробирках, покрытых BSA. Радиоактивность измеряют с использованием диоксанового сцинтиллятора при эффективности счета 20%. Содержание белка определяют с помощью красителя Кумасси синего. Все измерения проводят в двух параллельных образцах. Каждый эксперимент воспроизводят 3-4 раза. Безразмерные величины ОКА рассчитывают по соотношению Kd для прогестерона и сравниваемого лиганда, полученных в отдельных экспериментах, и рассчитанные величины ОКА усредняют.
Пример 4. Оценка влияния заявляемых соединений на жизнеспособность клеточной линии рака шейки матки HeLa
Культивирование клеток HeLa осуществляют в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). Клетки инкубируют при 37°С в условиях 5% CO2. При культивировании клеток используют стандартную среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика гентамицина сульфата в концентрации 40 мкг/мл. Клетки выращивают при 37°С в присутствии 10-8 М эстрадиола на среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для проведения эксперимента суспензию клеток помещают в 96-луночный плоскодонный планшет. Исследуемые вещества растворяют в диметилсульфоксиде до концентрации 10-2 М, затем в среде инкубации до конечных концентраций в культуре 10-6-10-5 М. Концентрация диметилсульфоксида в культуре клеток составляет 10-3-10-6 М. Во все лунки также вносят эстрадиол до конечной концентрации 10-8 М, кроме чистого контроля. Инкубируют в течение 6 суток, после чего результаты учитывают методом МТТ. Оптическую плотность образцов регистрируют при длине волны 530 нм на анализаторе "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов в присутствии только эстрадиола принимают за 100%-ную выживаемость клеток.
Таким образом, как видно из вышеописанных примеров, получены новые 4-окса- и 4-аза-16 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 , 17 -циклогексанопрегнаны, патент № 2426737" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклогексанопрегнаны Ia и Ib, которые связываются с рецептором прогестерона матки крысы и являются высокоэффективными ингибиторами роста раковых клеток, т.е. проявляют высокую антипролиферативную активность. Заявленные соединения могут представить интерес в медицине в качестве противоопухолевых средств, например, при лечении гормонозависимых раковых заболеваний.
Класс C07J53/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован конденсированием с карбоциклическими кольцами или получением дополнительного кольца за счет образования непосредственной связи между двумя атомами углерода кольца
Класс C07J73/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновое ядро модифицировано замещением одного или двух атомов углерода гетероатомами
Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства