авирулентный штамм бактерий vibrio cholerae km 263 биовара эльтор серовара инаба - продуцент протективного о1 антигена

Формула изобретения

Авирулентный штамм бактерий Vibrio cholerae биовара эльтор серовара Инаба, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ263, - продуцент протективного O1 антигена.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению авирулентного штамма холерного вибриона биовара эльтор серовара Инаба, характеризующегося высокой продукцией основного протективного O1 антигена Инаба, предназначенного для производства химических вакцин против возбудителя холеры и получения очищенного препарата O1 антигена Инаба для приготовления диагностической сыворотки.

К основным факторам вирулентности Vibrio cholerae, которые являются и основными протективными антигенами, относят холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и O-антиген, отвечающие, соответственно, за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Кроме того, O-антиген обладает серологической специфичностью и используется для серодиагностики и идентификации возбудителя холеры. Ключевым фактором вирулентности холерных вибрионов является холерный экзотоксин - термолабильный белок, вызывающий развитие тяжелой диареи - основного клинического симптома при холере. Биосинтез холерного токсина кодируют структурные гены ctxA и ctxB, входящие в состав коровой области умеренного нитчатого фага СТХ , интегрированного в хромосому холерного вибриона. Коровая область профага СТХ помимо генов ctxAB включает гены zot и асе, кодирующие продукцию двух других холерных токсинов, и гены orfU и сер, продукты которых необходимы для формирования фаговых частиц. Все вирулентные штаммы V. cholerae эффективно секретируют in vitro и/или in vivo холерный токсин. Для вакцинопрофилактики при создании вакцин как химических, так и живых используют штаммы холерных вибрионов, продуцирующие основные протективные антигены.

В настоящее время при производстве лицензированной бивалентной химической таблетированной холерной вакцины в Российской Федерации используют вирулентные штаммы холерного вибриона О1 серогруппы классического биовара, вызвавшего шесть предыдущих пандемий азиатской холеры. Однако в данной вакцине отсутствуют биовароспецифические антигены возбудителя текущей, седьмой пандемии холеры (V. cholerae О1 биовара эльтор) и она не может обеспечить высокий уровень защиты от холеры эльтор.

Известен вирулентный штамм V. cholerae KM207 O1 серогруппы классического биовара серовара Инаба продуцент протективных антигенов - холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии (патент RU 2222595 C1). Однако продукция O1 антигена у данного штамма неизвестна.

Известен штамм классического биовара серовара Инаба - продуцент холерного токсина V.cholerae КМ76 (штамм ранее использовался в производстве таблетированной бивалентной химической вакцины) (патент RU 1460075). Однако данный штамм является высоковирулентным и требует повышенных мер безопасности при работе с ним.

Известен штамм V.cholerae 569 В классического биовара серовара Инаба - продуцент холерного токсина и O1 антигена серовара Инаба, используемый как в отечественной, так и зарубежной медицине в качестве производственного для получения химической вакцины (патент RU 2159128, 20.11.2000; Ketley J. et al. Infect. Immun., 1990, v.141, p.893-899). Однако указанный штамм является высоковирулентным и требует больших материальных затрат для обеспечения биологической безопасности производства химической вакцины.

Штаммы классического биовара стабильно наследуют внедренный в хромосому фаг СТХ . Для штаммов холерного вибриона биовара эльтор имеются литературные данные о потере в определенных условиях профага СТХ , что ведет к образованию стабильных авирулентных клонов (Кульшань Т.А. с соавторами, Пробл. особо опасных инф. 2006, № 91, с.44-48).

Задачей изобретения является получение авирулентного штамма V. cholerae O1 биовара эльтор серовара Инаба, эффективно продуцирующего O1 протективный антиген серовара Инаба, обеспечивающего формирование антибактериального иммунитета при холере.

Сущность изобретения состоит в получении авирулентного штамма V.cholerae биовара эльтор серовара Инаба, являющегося продуцентом основного протективного O1 антигена серовара Инаба.

Заявляемый штамм получен в модельном эксперименте из вирулентного природного штамма V.cholerae M569 Инаба, выделенного от больного на территории республики Мордовия (г.Саранск), в 1974 году, путем спонтанной потери профага СТХ при длительном пребывании возбудителя холеры в стерильной речной воде.

В результате получен авирулентный штамм холерного вибриона эльтор биовара серовара Инаба, эффективно продуцирующий протективный O1 антиген Инаба.

Штамм V. cholerae M569 (ПВ) депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ263

Основные свойства штамма V.cholerae KM263.

- высокий уровень продукции O1 антигена Инаба (титр агглютинации с сывороткой Инаба 1:3200);

- отсутствие в геноме генов коровой области профага СТХ (ctxA, ctxB, асе, zot, orfU, сер);

- отсутствие холерогенного эффекта на модели кроликов-сосунков;

- отсутствие продукции холерного токсина;

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение среды. Штамм растет на простых средах. Прототроф.

Патогенные свойства - авирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁵ , 10⁷ м.т./мл.

Физиологические свойства.

Лизирует эритроциты барана, агглютинирует куриные эритроциты, растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Инаба. Чувствителен к холерному диагностическому фагу эльтор. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года. Пример 1, показывающий отсутствие генов коровой области профага СТХ . Культуру штамма V.cholerae KM263 рассевают на LB-агар для тестирования генов профага СТХ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами. Препараты тотальной ДНК получают методом кипячения бактериальной взвеси (10⁷ м.к./мл) в дистиллированной воде в течение 30 минут на водяной бане с последующим центрифугированием при 10000 об/мин ПЦР проводят в микропробирках объемом 600 мкл на программируемом термостате «Терцик». Выявление фрагментов генов коровой области профага СТХф в хромосоме изучаемого штамма осуществляют с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров:

ctxA1(5'-CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG-3')

ctxA2(5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3')

zot1(5'-TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT-3')

zor2(5'-AACCCCGTTTCACTTCTACCCA-3')

ace1(5'-TAAGGATGTGCTTATGATGGACACCC-3')

ace2(5'-CGTGATGAATAAAGATACTCATAGG-3')

cep1(5'-CAGAACAATTGCCCCCACCAC-3')

cep2(5'-AAGCACGCTTTCACTCGGGG-3')

orfU1(5'-CAAAATGAGCATGGCGGC-3')

orfU2(5'-CCCATTGTGCAATCGGTGT-3')

синтезированных в НПФ «Литех» (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК «ACM102U». Продукты ПЦР фракционируют в 2% агарозном геле (BioRad) и регистрируют в ультрафиолетовом свете. При ПЦР-анализе штамма КМ263 гены ctxA, ctxB, асе, zot, orfU, сер отсутствуют, что указывает на отсутствие профага СТХ .

Пример 2, подтверждающий отсутствие продукции холерного токсина штаммом V.cholerae KM263 иммуноферментным методом.

Продукцию холерного токсина определяют с помощью иммуноферментного метода GM1 ELISA (Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol, 1983, v.17, p.596-601). Выращивание клеток холерного вибриона проводят в AKI бульоне при 37°C в течение 4 ч без аэрации и последующих 16 ч в условиях интенсивной аэрации (Iwanaga M, Yamamoto К, Higa et al., J Microbiol. Immunol, 1986, v.30, p.1075-1083). По истечении времени культивирования пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость инкубируют в течение двух часов при 37°С в лунках микроплат, затем блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Проводят инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, в течение 1 ч при 37°C. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных коньюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере pH 4,0 с 0,1% ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)]. В качестве положительного контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина, полученный из эталонного высокотоксигенного штамма V.cholerae 569B. Чувствительность метода GM1 ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Результаты, полученные при определении продукции холерного токсина штаммом V.cholerae KM263, были отрицательные, что свидетельствует об отсутствии продукции данного белка.

Пример 3, подтверждающий отсутствие вирулентности на модели кроликов-сосунков.

Вирулентность штамма V.cholerae KM263 определяют путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков по N.K.Dutta и M.K.Habbu (Brit. J. Pharmacol., 1955, v.256 (23), p.12252-12256). Для заражения используют 4-х часовую агаровую культуру, выращенную при 37°C. В опытах используют 8-10 дневных кроликов-сосунков, которым вводят внутрикишечно две заражающие дозы - 1×10 ⁵ и 1×10⁷ м.к. Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч. В кишечнике экспериментальных животных, зараженных штаммом V.cholerae KM263, не наблюдают никаких видимых изменений, что подтверждает отсутствие вирулентности у заявляемого штамма.

Пример 4. Определение продукции протективного O1 антигена Инаба.

Высушенную ампульную культуру штамма V.cholerae KM263 засевают на агар Хоттингера pH 7.6 и инкубируют 18 ч при 37°C. Выросшую культуру рассевают на агар Хоттингера pH 7.6 и используют для изучения антигенных свойств с помощью развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками O1, Инаба, Огава и RO. Готовят взвесь штамма холерного вибриона, соответствующего 5 единицам отраслевого стандартного образца мутности (ОСО 42-28-86П), эквивалентную 1×10⁹ м.к./мл. Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-м раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра и добавляют 0,5 мл взвеси изучаемого штамма KM263. Пробирки тщательно встряхивают, инкубируют при температуре 37°C в течение 2 ч, и еще 18-20 ч при температуре 20-22°C. Изучаемый штамм KM263 агглютинируется сывороткой к O1-антигену в титре 1:3200 и серовароспецифической сывороткой к антигену Инаба в титре 1:3200. Агглютинация с серовароспецифической сывороткой Огава и RO отсутствует.

Пример 5. Использование штамма в производстве экспериментальных серий химической противохолерной вакцины.

Для подтверждения способности заявляемого штамма V. cholerae KM263 вырабатывать протективный биовароспецифический антиген Инаба проводят глубинное культивирование штамма в течение 7-10 ч на ферментере с автоматическими системами поддержания параметров культивирования с подкормкой (глюкоза 40%) и коррекцией pH (аммиак). Объем питательной среды составляет 14 л, температура культивирования 37°C. Питательной средой служит казеиновый бульон с 1% пептоном (pH 7,6-8,0). Для получения препаратов O-антигена используют формалинизированный центрифугат бульонной культуры. Содержание антигенов O1 и Инаба определяют в реакции диффузной преципитации в агарозном геле по Оухтерлони (РДП) со специфическими агглютинирующими сыворотками O1 и Инаба. Сыворотки против антигенов O1 и Инаба образовывают линию преципитации в РДП с формалинизированным центрифугатом в трех экспериментальных сериях препарата в разведениях 1:16 и 1:32, соответственно, что сопоставимо с данными при выращивании вирулентных штаммов холерных вибрионов, используемых в настоящее время при производстве химической таблетированной вакцины.

Таким образом, заявляемый штамм Vibrio cholerae KM263 является авирулентным штаммом, продуцирующим протективный антиген Инаба. Штамм может быть использован в производстве для получения химической холерной вакцины, производство которой основано на выращивании авирулентных штаммов, а также для получения очищенных препаратов антигена Инаба, используемого для приготовления диагностической сыворотки.