Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде путем ферментативной деполимеризации

Классы МПК:C08B37/08 хитин; хондроитинсульфат; гиалуроновая кислота; их производные
C12P19/04 полисахариды, те соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора (RU),
Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-08-17
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой от 2 до 20 кДа. Растворяют исходный высокомолекулярный хитозан в растворе кислоты. Затем осаждают растворенный в кислоте хитозан добавлением раствора щелочи. Отмывают переосажденный высокомолекулярный хитозан от образовавшейся соли и избытка щелочи с помощью крупнопористого фильтра. Растворяют переосажденный хитозан в растворе кислоты до значения рН 5,5. Добавляют ферментный препарат и проводят процесс гидролиза. Останавливают реакцию после образования низкомолекулярного хитозана. Способ характеризуется отсутствием необходимости удаления солей в ферментативной смеси и целевом продукте, а также низким уровнем потерь вещества. 7 табл.,2 ил. способ получения низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде   путем ферментативной деполимеризации, патент № 2425844

Рисунки к патенту РФ 2425844

способ получения низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде   путем ферментативной деполимеризации, патент № 2425844 способ получения низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде   путем ферментативной деполимеризации, патент № 2425844

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в производстве биологически активных веществ с антибактериальными, антигрибными, антивирусными и иммуномодулирующими свойствами, а также в создании доставщиков ДНК и лекарственных средств на основе низкомолекулярного хитозана.

Хитозан - природный высокомолекулярный гетерополимер D-глюкозоамина и N-ацетил-D-глюкозоамина, соединенных 1,4-способ получения низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде   путем ферментативной деполимеризации, патент № 2425844 -гликозидной связью. Хитозан обладает антибактериальными, антигрибными, антивирусными и иммуномодулирующими свойствами, может быть использован как адъювант, радиопротектор, компонент гелевых и мазевых композиций, как доставщик ДНК, лекарственных и других веществ, в качестве элиситора повышает устойчивость растений к бактериальным, грибным и вирусным заболеваниям [1, 2].

Исходный хитозан является биополимером с молекулярной массой 1000 кДа (и выше), что соответствует степени полимеризации, равной 5000, практическое использование которого затруднено из-за высокой вязкости его водных растворов даже при низкой концентрации (менее 0,01%), а также недостаточной растворимости при нейтральных значениях рН и, как следствие, низкой биологической активности. Для снижения вязкости, улучшения растворимости и усиления биологической активности высокомолекулярный хитозан подвергают химической или ферментативной деполимеризации. Полученный в процессе деполимеризации низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой от 2 до 20 кДа обладает высокой биологической активностью и способен растворяться в растворах со значениями рН, близкими к нейтральным (рН 6,5-7,0) [3,4]. Ферментативную деполимеризацию высокомолекулярного хитозана обычно проводят в 0,2-0,3 М натрий-ацетатных или натрий-лактатных буферных системах при рН 4,5-6,5 [5, 6]. Наличие солевого буфера объясняется хорошей растворимостью хитозана только в присутствии избытка кислоты, что сопровождается необходимостью после полного растворения хитозана доводить сильнокислый раствор растворенного таким способом полимера (<4,0) до значений рН, оптимальных (4,5-6,5) для ферментов, использующихся для деполимеризации хитозана. Это приводит к наличию в конечном продукте значительных количеств солей, удаление которых в масштабах промышленного производства требует длительного диализа и сопровождается существенными потерями наиболее низкомолекулярных фракций хитозана.

Целью заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего получить низкомолекулярный водорастворимый при рН 6,5-7,0 хитозан путем ферментативной деполимеризации в бессолевых условиях.

Поставленная задача достигается путем разработки способа получения низкомолекулярного хитозана, который предусматривает предварительное переосаждение исходного высокомолекулярного хитозана (в результате чего он приобретает способность растворяться при добавлении минимального количесва кислоты), для чего его растворяют в растворе кислоты, а после полного растворения осаждают добавлением раствора щелочи; отмывку переосажденного высокомолекулярного хитозана от образовавшейся соли и избытка щелочи с помощью крупнопористого фильтра (на этой стадии отмывка солей не сопровождается потерей целевого вещества за счет высокой молекулярной массы хитозана); растворение переосажденного хитозана в расчетном количестве кислоты (уксусной, молочной, соляной) до оптимального для ферментативной деполимеризации значения рН (4,5-6,5); добавление ферментного препарата; проведение процесса гидролиза при оптимальной температуре; остановку реакции после определенного промежутка времени.

В указанном выше диапазоне значений рН система хитозан-кислота представляет собой буферную систему, что подтверждается образованием плато на графике титрования растворенного в кислоте хитозана раствором щелочи (фиг.1), и, таким образом, не нуждается в использовании солевой буферной системы для поддержания необходимой кислотности среды. В процессе деполимеризации наблюдается небольшое повышение значения рН за счет улучшения доступности аминогрупп низкомолекулярного хитозана, которое происходит в ходе гидролиза (фиг.2). Таким образом, предлагаемая нами схема деполимеризации позволяет не использовать солевую буферную систему во время гидролиза, а следовательно избежать необходимости удалять соли из конечного продукта, и получать хитозан с заданным противоионом: ацетат, лактат, хлорид и другие.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного и предотвращающего потери целевого вещества способа получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана с молекулярной массой в диапазоне от 2 до 20 кДа с помощью ферментативной деполимеризации в бессолевых условиях, характеризующегося наличием в реакционной среде только целевого вещества (хитозана) и фермента (ферментного препарата), отсутствием в реакционной среде солей (хлорид натрия, ацетат натрия и т.п.), отсутствием необходимости удаления солей по причине отсутствия таковых в ферментной системе и целевом продукте методами, которые сопровождаются потерями целевого продукта.

Пример 1. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде с помощью ферментативного препарата Целловиридин Г20х. Взвешивают 1 г высокомолекулярного крабового хитозана. Растворяют его в 100 мл 0,3%-ного раствора уксусной кислоты. Осаждают растворенный хитозан добавлением 2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Отмывают осажденный хитозан с помощью крупнопористого фильтра дистиллированной водой до тех пор, пока значение рН промывных вод не достигнет 5,5. К полученному осадку хитозана добавляют дистиллированную воду, доводя объем смеси до 100 мл. Затем, при постоянном перемешивании, добавляют в смесь 5%-ную уксусную кислоту, доводя рН раствора до 5,5. При таком значении рН переосажденный хитозан полностью растворяется. После установления заданного значения рН к раствору добавляют ферментный препарат Целловиридин Г20х, полученный из гриба Trichoderma viride, в количестве 0,0025 г, достигая фермент-субстратного соотношения 1:400 (фермент:субстрат). Реакцию гидролиза ведут при +55°С в течение 4 часов при перемешивании. Реакцию останавливают нагреванием гидролизата до +100°С в течение 10 минут. Результаты реакции оценивают по падению динамической вязкости раствора гидролизуемого хитозана и средневязкостной молекулярной массы хитозана. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 2. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но в качестве кислоты для растворения используют не уксусную кислоту, а молочную, соляную или другие. Полученные результаты приведены в таблицах 2 и 3.

Пример 3. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза проводят при значениях рН в интервале от 4,5 до 6,5. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Пример 4. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза проводят при значениях температуры в интервале от +45°С до +65°С. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Пример 5. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза ведут различные промежутки времени - от 30 до 360 минут. Полученные результаты приведены в таблице 6.

Пример 6. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза ведут при различных фермент-субстратных соотношениях - от 1:10 до 1:1000. Полученные результаты приведены в таблице 7.

Таблица 1
Изменения динамической вязкости (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостной молекулярной массы (кДа) хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с ацетат-ионом
ПараметрыИсходный хитозанГидролизованный хитозан
динамическая вязкость >10004,9
средневязкостная молекулярная масса 7502,0

Таблица 2
Изменение динамической вязкости (сП) 1%-ного раствора хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с различными противоионами
КислотаИсходный хитозанГидролизованный хитозан
уксусная>1000 4,9
молочная>1000 5,9
HCl>1000 7,5

Таблица 3
Изменение средневязкостной молекулярной массы (кДа) хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с различными противоионами
КислотаИсходный хитозанГидролизованный хитозан
уксусная750 2
молочная750 4
HCl750 6

Таблица 4
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различных значениях рН
Параметры Значения рН
4,55,0 5,56,0 6,5
динамическая вязкость7,0 5,5 4,97,0 10,0
средневязкостная молекулярная масса 53 25 8

Таблица 5
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различных значениях температуры
Параметры Значения температуры, °С
4550 5560 65
динамическая вязкость10,0 6,2 4,95,5 7,0
средневязкостная молекулярная масса 84 23 5

Таблица 6
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различной продолжительности
Параметры Продолжительность гидролиза, мин
030 60120 240300 360
динамическая вязкость>1000 21,6 11,26,3 4,94,9 4,9
средневязкостная молекулярная масса 75020 125 22 2

Таблица 7
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различных фермент-субстратных соотношениях
Параметры ферментхубстрат, масса:масса
1:101:100 1:2001:300 1:400 1:5001:1000
динамическая вязкость4,9 4,9 4,94,9 4,96,5 22,0
средневязкостная молекулярная масса 22 22 25 20

ЛИТЕРАТУРА

1. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А, Варламов В.П. Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях. Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. № 2. С.224-228.

2. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П. Варламова. Москва: Наука, 2002. 368 с.

3. RU 2188829 С1, 10.09.2002.

4. RU 2073016 С1, 10.02.1997.

5. Il'ina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii. Process Biochemistry. 1999. V.34. P.875-878.

6. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г20х. Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. № 1. С.5-13.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой от 2 до 20 кДа, включающий следующие стадии:

переосаждение исходного высокомолекулярного хитозана;

отмывка переосажденного хитозана с помощью крупнопористого фильтра;

растворение переосажденного хитозана в растворе кислоты до оптимального для ферментативной деполимеризации значения рН 5,5;

ферментативная деполимеризация хитозана с использованием ферментного препарата Целловиридин Г20х.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2425844

patent-2425844.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C08B37/08 хитин; хондроитинсульфат; гиалуроновая кислота; их производные

Патенты РФ в классе C08B37/08:
стабилизатор липосомальных суспензий и способ его получения -  патент 2529179 (27.09.2014)
способ получения нерастворимого в воде серосодержащего биополимера на основе хитозана -  патент 2520493 (27.06.2014)
способ комплексной переработки рыбного сырья для получения гиалуроновой кислоты и коллагена -  патент 2501812 (20.12.2013)
способ получения глюкан-хитозанового комплекса из дрожжевой биомассы отходов пивоваренного производства -  патент 2499836 (27.11.2013)
противоопухолевые средства с бензофенантридиновой структурой и содержащие их препараты -  патент 2492862 (20.09.2013)
имидированный биополимерный адгезив и гидрогель -  патент 2486907 (10.07.2013)
способ получения хитозан-нуклеинового гидролизата -  патент 2483110 (27.05.2013)
способ получения водорастворимых олигомерных гомологов хитозана в гетерогенной системе -  патент 2479590 (20.04.2013)
электрохимический способ очистки хондроитина сульфата -  патент 2478652 (10.04.2013)
способ получения n,s-содержащего полимера на основе хитозана -  патент 2478651 (10.04.2013)

Класс C12P19/04 полисахариды, те соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями

Патенты РФ в классе C12P19/04:
способ получения целлюлозосодержащего продукта, продукт полученный данным способом -  патент 2525142 (10.08.2014)
способ получения жидкой фракции, содержащей изолированные высокомолекулярные капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae, и жидкая фракция, полученная таким способом -  патент 2524436 (27.07.2014)
штамм gluconacetobacter sucrofermentans -продуцент бактериальной целлюлозы -  патент 2523606 (20.07.2014)
ускоренный способ очистки для получения капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae -  патент 2516340 (20.05.2014)
способ получения раствора, содержащего высокомолекулярные изолированные капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae серотипа 19а (варианты) -  патент 2511404 (10.04.2014)
способ получения глюкан-хитозанового комплекса из дрожжевой биомассы отходов пивоваренного производства -  патент 2499836 (27.11.2013)
способ получения липополисахарида возбудителя чумы -  патент 2483112 (27.05.2013)
способ разделения липополисахаридов грамотрицательных бактерий -  патент 2478712 (10.04.2013)
способ подготовки лигноцеллюлозного сырья для получения сахаров и установка для его осуществления -  патент 2475540 (20.02.2013)
способ получения биологического связующего -  патент 2473692 (27.01.2013)

Наверх