n-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10]додец-11-ен-4-ил}-4-гидроксибензамид, противовирусный препарат, ингибирующий репликацию различных видов ортопоксвирусов

Формула изобретения

N-{3,5-Диoкco-4-aзaтeтpaциклo[5.3.2.0^2,6.0 ^8,10]дoдeц-11-eн-4-ил}-4-гидpoкcибeнзaмид формулы I:



проявляющий противовирусную активность по отношению к различным видам ортопоксвирусов, патогенных для человека и животных.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и касается нового биологически активного химического соединения формулы I:

обладающего высокой противовирусной активностью, что сделает возможным его использование в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами, в частности ортопоксвирусами.

Наиболее опасными для человеческой популяции из-за чрезвычайно высокой патогенности, многообразия и эпидемиологических показателей являются вирусы рода ортопоксвирусов (семейство Poxviridae, род Orthopoxvirus). В последние годы неожиданную остроту и актуальность приобрела проблема натуральной оспы: поскольку вакцинация населения с 1980 г. не проводится, появилась значительная прослойка населения без иммунитета или с ослабленным иммунитетом в отношении оспы. Отсутствуют гарантии полного исчезновения возбуждающих это заболевание вирусов, а также существует возможность несанкционированной утечки вирусного материала из мест его официального хранения и, возможно, неофициального хранения. Более того, в условиях постоянного роста категорий населения с иммунодефицитными состояниями сама идея вакцинации живым вирусом осповакцины становится проблематичной, и большое значение приобретает решение задачи купирования поствакцинальных осложнений, а также вспышек заболеваний, вызванных другими патогенными для человека ортопоксвирусами, с помощью высокоэффективных химиотерапевтических препаратов. Хорошо известна высокая патогенность вирусов оспы обезьян, оспы коров, относящихся к тому же роду Orthopoxvirus и способных вызывать заболевание со смертельным исходом у людей. Так, в последнее время в Африке, особенно в районах с высоким процентом ВИЧ-инфицированных, отмечаются вспышки оспы обезьян (летальность достигает 10-20%). Широкое распространение вируса оспы обезьян посредством луговых собачек на территории США в 2003 году также показывает совершенно необычный эпидемический потенциал ортопоксвирусов. Кроме того, существует реальная возможность селекции новых вариантов ортопоксвирусов в природных условиях, а также создания новых генетических вариантов ортопоксвирусов с необычными свойствами. Такая вероятность была продемонстрирована в лабораторных условиях для маловирулентного штамма вируса оспы мышей, который после генетических манипуляций стал патогенным для этих животных.

В настоящее время фактически отсутствуют эффективные средства специфической профилактики и лечения заболеваний, вызываемых вирусами рода ортопоксвирусов, поэтому поиск и создание высокоэффективных противовирусных препаратов, обладающих высокой активностью, низкой токсичностью и продолжительным действием в отношении ортопоксвирусов является важной задачей для обеспечения безопасности здоровья и жизни людей.

Достаточно хорошо известен препарат метисазон (выпускается также под названиями Кемовиран (Kemoviran); Марборан (Mar-Boran); Вирузон (Viruzon)) [Quenelle B.C., Keith K.A., Kern E.R. // Antiviral Res. 2006; 71(1): 24-30], который обладает невысокой профилактической активностью, в отношении вируса натуральной оспы. Также известен препарат цидофовир (Vistide^®), который проходит в настоящее время исследования как профилактический или лечебный препарат, но пока его исследования не закончены [Jesus D.M, Costa L.T, Goncalves D.L, Achete C.A, Attias M, Moussatché N, Damaso C.R. // J Virol. 2009; 83(22): 11477-11490].

На фармацевтическом рынке в настоящее время практически нет препаратов, активных в отношении вирусов группы оспы, в этой связи разработка таких веществ может стать важным шагом в обеспечении фармакологической безопасности жизни людей.

Известно, что производные адамантана являются потенциальными источниками веществ с противовирусными свойствами. В частности, ингибиторы вируса осповакцины выявлены в ряду адамантоил-1-гидразинов [Гужова С.В., Даниленко Г.И., Коробченко Л.В., Денисова Л.В., Андреева О.Т., Бореко Е.И., Даниленко В.Ф., Баклан В.Ф. Ингибиторы вируса вакцины в ряду адамантоил-1-гидразинов // Физиол. активн. в-ва. Киев: Наукова думка. 1986. вып.18. С.24]. Изомерные 1-(аминобензоил)аминоадамантаны наряду с действием на различные типы вирусов проявляют умеренную активность в отношении вируса осповакцины [Вотяков В.И., Андреева О.Т., Кицара М.С. и др. // В сб.: Физиологически активные вещества. Киев. 1978. Вып.10. С.88]. Опубликованы данные о выраженном ингибирующем действии на размножение вирусов осповакцины замещенных аминоацетиладамантиламинов, аминоалкоксиацетиладамантиламинов и тромантадина [May G., Peteri D. // Arzneimitt. -Forsch. 1973. Bd. 23. No. 5. S.718]. Широкий ряд гидрокси-, азотсодержащих и серосодержащих функциональных производных адамантанового ряда проявил слабую и умеренную степень активности против вируса осповакцины [Климочкин Ю.Н., Леонова М.В., Коржев И.Р., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И., Николаева С.Н. // Хим.-фарм. журнал. 1992. No.7-8. С.58; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. журнал. 1991. Т.25. No. 7. С.46; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Абрамов О.В., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. ж. 1991. Т.25. No. 7. С.49].

Недостатком вышеперечисленных аналогов является невысокая активность соединений в отношении вируса осповакцины.

Среди производных адамантана известно биологически активное соединение 1-адамантаноилгидразон -азидометил(1-адамантил)кетона, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса осповакцины [SU 1568481, МПК C07D 253/06, опубл. 2006]. Указанное соединение не изучалось на предмет противовирусной активности в отношении вируса оспы коров, вируса оспы обезьян и других. К недостаткам этого соединения следует отнести недостаточно высокую эффективность в отношении вируса осповакцины.

Известны 3-фенил-6-R₁-7-R ₂-1,2,4-бензотриазины (соединение СК-29 и его производные), обладающие противовирусной активностью, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека [RU 2252218, МПК C07D 253/10, А61К 31/53, опубл. 20.05.2005]. Эти химические соединения обладают недостаточной противовирусной активностью и невысоким индексом селективности в отношении ортопоксвирусов. Невысокая противовирусная активность этих соединений стимулировала поиск новых лекарственных средств.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является химическое соединение - 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциклопроп

[f]изоиндол-2(1Н)-ил)бензамид (ST-246), обладающее противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов с высоким индексом селективности [US 20060235051, МПК А61К 31/4439, C07D 403/02, опубликовано 19.10.2006 г.; Bailey T.R, Rippin S.R., Opsitnick E., et al, // J. Med Chem. 2007; 50(7): 1442-1444; Yang G., Pevear D.C., Davies M.H, et al, J. Virol. 2005; 79(20): 13139-13149].

Исследование прототипа показало, что лекарственно устойчивые к ST-246 ортопоксвирусы возникают чрезвычайно легко. Это является одним из существенных недостатков прототипа. Другим важным обстоятельством является то, что опыт использования различных противовирусных средств показывает: (а) необходимость использования комбинации нескольких препаратов для повышения эффективности лечения вирусной инфекции; (б) легкость появления новых вариантов вирусов, устойчивых к действию монопрепарата. Это привело к тому, что для лечения ряда вирусных заболеваний, например ВИЧ инфекции, используются одновременно 3-5 различных препаратов. Причем рекомендуется последовательное использование нескольких таких смесей для достижения максимального терапевтического эффекта и для предупреждения появления новых лекарственно устойчивых вариантов патогенных вирусов. Преодолеть этот недостаток возможно только путем создания новых высокоэффективных антивирусных препаратов - аналогов для комплексной терапии ортопоксвирусных инфекций несколькими противовирусными препаратами.

Задачей изобретения является создание нового химического соединения, имеющего простую технологию получения, обладающего высоким индексом селективности и противовирусным действием в отношении различных видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, домашних и лабораторных животных.

Задача решается новым биологически активным органическим соединением - N-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло [5.3.2.0 ^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}-гидроксибензамидом, формулы I:

проявляющим противовирусную активность в отношении различных видов ортопоксвирусов, которое может найти применение в медицинской практике в качестве препарата для лечения ортопоксвирусных инфекций человека, лабораторных и домашних животных.

Соединение I получают взаимодействием гидразида n-гидроксибензойной кислоты с 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3аH)-дионом в уксусной кислоте при кипячении в течение 10 часов по следующей схеме:

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение N-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0 ^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}-4-гидроксибензамида. Раствор 1.9 г (10 ммолей) 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензо-фуран-1,3(3аH)-диона и 1.52 г (10 ммолей) гидразида пара-гидроксибензойной кислоты кипятят в 30 мл уксусной кислоты в течение 10 час. Растворитель отгоняют в вакууме водоструйного насоса. К остатку добавляют 50 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой (3 раза по 15 мл), сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 2.91 г (85%) вещества в виде белых кристаллов; т.пл. 219°С. Спектр ЯМР ¹H (400 Мгц, J/Гц, СDСl ₃), , м.д.: 0.05 (уш. с, 1Н); 0.26 (дд, J=5.8, 7.0, 1Н); 1.17 (м, 2Н); 3.20 (уш. с, 2Н); 3.28 (м, 2Н); 5.75 (дд, J=3.9, 5.1, 2Н); 6.85 (д, J=8.7, 2Н); 7.75 (д, J=8.7, 2Н); 10.28 (с, 1Н); 10.54 (с, 1Н); 10.80 (с, 1Н). Спектр ЯМР ¹³С (400 МГц, СDСl₃), , м.д.: 5.14, 10.23, 33.72, 34.03, 43.91, 44.36, 116.16, 122.48, 128.25, 128.55, 130.80, 130.90, 162.14. 162.30, 164.64, 165.30, 176.16. ИК-спектр (КВr), см^-1: 597, 736, 849, 1174, 1194, 1218, 1236, 1283, 1497, 1593, 1610, 1668, 1715, 1781, 2961, 3013, 3353, 3536. Вычислено, %: С, 63.15; Н, 5.30; N, 8.18. C₁₈H₁₆N₂O·H₂ O. Найдено, %: С, 63.79, 63.50; Н, 5.35, 5.32; N, 8.38, 8.27.

Предлагаемое соединение I отличается от описанных в прототипе [US 20060235051, МПК А61К 31/4439, C07D 403/02, опубликовано 19.10.2006 г.; Bailey T.R, Rippin S.R., Opsitnick E., et al, // J. Med Chem. 2007; 50(7): 1442-1444; Yang G., Pevear D.C., Davies M.H., et al, J. Virol. 2005; 79(20): 13139-13149] тем, что, являясь полициклическим, содержит в молекуле трижды ацилированную молекулу гидразина, один из атомов азота которого входит в состав гетероциклической - изоиндольной структуры, а другой связан с n-гидроксизамещенным бензоильным остатком.

Способ получения заявляемого вещества прост в исполнении, исходные вещества доступны, выход составляет 85% от теоретически рассчитанного. Предлагаемое соединение устойчиво на воздухе, легко растворимо в хлороформе, диметилформамиде и диметилсульфоксиде, мало растворимо в алифатических спиртах, воде, практически нерастворимо в эфире, гексане.

Пример 2. Исследование противовирусной активности заявляемого соединения.

Для оценки противовирусной активности соединений использовали следующую методику. Культуру клеток Vero выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений и соответствующий вирус. После инкубирования в течение 3-5 суток, монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, после удаления красителя и отмывки избытка красителя вносили лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые вирус не вносили (контроль токсичности соединений), в который вносили вирус без соединений (контроль вируса), и лунки, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространения от клетки к клетке, в связи с чем клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный. Результаты анализировали с помощью программы SoftMax (версия 4.0, Molecular Devices, Memo Park, USA).

В качестве исследуемых вирусов использовали патогенный для человека вирус оспы коров (штамм Гришак) и вирус осповакцины, штамм ЛИВП, используемый для вакцинации населения. Помимо ортопоксвирусов, патогенных для человека, для оценки противовирусной активности использовали вирус эктромелии (оспы мышей), штамм К-1.

Анализ полученных данных наглядно показывает, что заявляемое соединение (I) и соединение-прототип (ST-246) обладают высоким противовирусным действием, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.

Как видно из данных таблицы 1, исследованные соединения (заявляемое соединение I и прототип ST-246) эффективно подавляют размножение ортопоксвирусов в культуре клеток: ингибируют размножение трех видов ортопоксвирусов в концентрациях 0,005-0,224 и 0,002-0.003 мкг/мл соответственно, значения которых по величине существенно превосходят препарат-аналог [RU 2252218, МПК C07D 253/10, А61К 31/53, опубл. 20.05.2005] на основе производных бензотриазинов, активная концентрация которого составляет 0.49-2.23 мкг/мл.

Таблица 1.
Сравнение активности заявляемого соединения (I), ST-246 (прототип) и СК-29 (аналог)
Препарат	Токсичность для культуры клеток Vero(IC50, мкг/мл)	Ингибирующая активность (IC50, мкг/мл) в отношении вирусов	Индекс селективности для вируса осповакцины
Осповакцины	Оспы коров	Оспы мышей
Заявляемое соединение (I)	>100	0,005	0,224	0,144	>20000
ST-246, прототип	>100	0,003	0,002	0,003	>30000
СК-29 аналог	>300	0,5	2,23	0,49	От 134 до 600

Таким образом, заявляемое соединение N-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0 ^2,6.0^8,10]додец-11-ен-4-ил}-4-гидроксибензамид формулы I проявляет высокую противовирусную активность по отношению к различным видам ортопоксвирусов.

Пример 3. Оценка противовирусной активности заявляемого соединения (I) по отношению к вирусам: аденовирус человека 5-го серотипа, эховирус 12-го типа, вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2-го типа.

Оценку противовирусной активности исследуемых соединений проводили на культурах клеток АД293 (аденовирус человека 5-го серотипа и эховирус 12-го типа) и Vero (вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2-го типа) в 96-луночных планшетах. IC₅₀ соединений в отношении вышеуказанных вирусов определяли посредством регистрации ингибирования вирусиндуцированного цитопатического эффекта в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов (конечные концентрации в лунках микропланшет с клеточным монослоем 80, 40, 20, 10 и 5 мкг/мл). После добавления к клеткам исследуемых соединений в вышеуказанных концентрациях проводили инфицирование клеток различными вирусами. Для этого использовали инфицирующие дозы каждого вируса, вызывающие 90% цитопатический эффект через трое суток после инфицирования. После инкубации клеток в планшетах в течение 72 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂, клетки фиксировали 5% раствором глутарового альдегида. Цитопатический эффект визуализировали окрашиванием клеток 0.1% раствором кристаллического фиолетового и регистрировали спектрофотометрически при 570 нм. IC₅₀ рассчитывали согласно G. Yang et al., 2005.

Результаты, представленные в таблице 2, показали, что соединение (I) фактически не ингибирует репликацию эховируса 12-го типа, аденовируса человека 5-го серотипа, вируса Западного Нила и вируса простого герпеса 2-го типа. Соединение (I) использовалось в субтоксических концентрациях для этого типа клеток, что также дополнительно подтверждает его нетоксичность для клеток АД293. Отсутствие активности соединения (I) в отношении двух типов ДНК-содержащих вирусов и двух типов РНК-содержащих вирусов говорит о том, что механизм действия соединения (I) не связан с типом нуклеиновой кислоты.

Таблица 2.
Противовирусная активность соединения (I) in vitro
Препарат	Ингибирующая активность (IC50, мкг/мл) в отношении вирусов
Аденовирус человека 5-го серотипа	Эховирус 12-го типа{шт.Lev4)	Вирус Западного Нила (шт.Eg101)	Вирус простого герпеса 2-го типа (шт.MS)
Соединение (I)	>80.0	>80.0	>80.0	>80.0
ST-246, прототип	>40.0	>40.0	>80.0	>80.0

Для заявляемого соединения (I) IC₅₀ в отношении вируса осповакцины составляет 0.005 мкг/мл (Таблица 1), что показывает высокую специфичность действия соединения (I) в отношении ортопоксвирусов и свидетельствует о высокой степени селективности заявляемого соединения в отношении этого рода вирусов. Индекс селективности составил не менее 20000 для вируса осповакцины (пример 3).

Таким образом, заявляемое соединение (I) при низкой токсичности для клеток млекопитающих еще обладает выраженной селективностью по отношению к трем видам ортопоксвирусов и не ингибирует репликацию других РНК- и ДНК-содержащих вирусов.