комплексный биосорбент на основе штаммов бактерий и грибов для очистки водных сред от нефти и нефтепродуктов в присутствии микроводорослей

Формула изобретения

Биосорбент для очистки водоемов от нефти и нефтепродуктов, включающий в качестве носителя гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфа и нефтеокисляющие микроорганизмы, иммобилизованные на носителе в эффективном количестве, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов используют биомассу штаммов бактериальной культуры Rhodococcus eqvi Р-72-00, дрожжевой культуры Rhodotorula glutinis 2-4 М и мицелиального гриба Trichoderma lignorum F-98, иммобилизирование на носителе микроорганизмов осуществляют адсорбционным способом с получением индивидуальных сорбентов: бактериального с культурой Rhodococcus eqvi Р-72-00, дрожжевого с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 М и грибного с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98, при этом комплексный биосорбент для очистки содержит композицию индивидуальных сорбентов, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi Р-72-00	45-55
дрожжевой с культутрой Rhodotorula glutinis 2-4 М	45-55,

или

Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi Р-72-00	45-55
грибной с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98	45-55,

или

Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi Р-72-00	40-50
дрожжевой с культтурой Rhodotorula glutinis 2-4 М	20-35
грибной с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98	25-35,

и применяется совместно с концентрированной культурой микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer, при соотношении компонентов по сухому веществу, мас.%:

биосорбент	90-97
биомасса микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer	3-10

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к нефтяной промышленности и экологии и может быть использовано для очистки поверхности природных и искусственных водоемов, сточных вод и жидких отходов производств от загрязнений нефтью и нефтепродуктами с одновременной утилизацией загрязнения микроорганизмами.

Известен гидрофобный органоминеральный нефтяной биосорбент на сорбенте "СОРБОНАФТ" ( № 2318736). Биосорбент включает нефтеокисляющие микроорганизмы, а именно биомассу штамма бактерий Rhodococcus erythropolis HK-16 или Arthrobacter sp.HK-15 или дрожжевого гриба Candida lipolytica КБП-3308 или Candida guilliermondii КБП-3175, или Pichia guilliermondii КБП-3205, или их бактериально-дрожжевого консорциума, иммобилизованного в гидрофобный сорбент нефти на основе торфа путем обрастания сорбента бактериями и/или грибами.

Недостатком прототипа является то, что биосорбент недостаточно эффективен и с сорбированной нефтью недолго находится на поверхности, теряет гидрофобность;

за 27 дней при исходном нефтезагрязнении 46% снижение содержания сорбированной нефти на 30-41%.

Задачей изобретения является получение более эффективного по показателям биодеструкции нефти и нефтепродуктов биосорбента.

Технический результат состоит в том, что биосорбент с применением различных таксономических культур микроорганизмов имеет большую скорость и полноту биодеградации нефти и токсичных нефтепродуктов по сравнению с прототипом. Новый биосорбент может осуществлять одновременно сорбцию и утилизацию нефти и нефтепродуктов с водной поверхности с сохранением гидрофобных свойств при ликвидации загрязнения с концентрацией более 50%.

Получение биомассы микроорганизмов и их иммобилизация на сорбенте могут осуществляться в крупномасштабном производстве.

Технический результат достигается тем, что биосорбент для очистки водоемов от нефти и нефтепродуктов, включающий в качестве носителя гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфа и нефтеокисляющие микроорганизмы, иммобилизованные на носителе в эффективном количестве, согласно изобретению, в качестве микроорганизмов используют биомассу штаммов бактериальной культуры Rhodococcus eqvi P-72-00, дрожжевой культуры Rhodotorula glutinis 2-4 M и мицелиального гриба Trichoderma lignorum F-98, иммобилизирование на носителе микроорганизмов осуществляют адсорбционным способом с получением индивидуальных сорбентов: бактериального с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00, дрожжевого с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 M и грибного с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98, при этом комплексный биосорбент для очистки содержит композицию индивидуальных сорбентов, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00	45-55
Дрожжевой с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 M	45-55
или Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00	45-55
Грибной с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98	45-55
или Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00	40-50
Дрожжевой с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 M	20-35
Грибной с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98	25-35

и применяется совместно с концентрированной культурой микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer, при соотношении компонентов по сухому веществу, мас.%:

биосорбент	90-97
биомасса микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer	3-10

Штаммы используемых микроорганизмов депонированы: Rhodococcus eqvi P-72-00 (справка о депонировании № 2705 от 18.11.2005, выданная НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», регистрационный номер В-1117) и дрожжевая Rhodotorula glutinis 2-4 M (справка о депонировании № 2205 от 18.11.2005, выданная НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» регистрационный номер Y-1112). Штамм мицеллиального гриба Trichoderma lignorum F-98 (имеет паспорт ВКПМ (Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов)). Зеленые водоросли рода Chlorella хранятся в коллекции в Лаборатории Радиобиологии Института Биологии Коми научного центра УрО РАН.

Авторами разработки используемым для иммобилизирования сорбента штаммам бактерий и грибов присвоены следующие обозначения:

Rhodococcus eqvi P-72-00 (бактериальный сорбент - Сб)

Rhodotorula glutinis 2-4 M (дрожжевой сорбент - Сд)

Trichoderma lignorum F-98 (грибной сорбент - Сг)

Микроорганизмы и их консорциумы, как и биосорбенты в целом, характеризуются, как экологически нетоксичные.

Используемый термофильный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer отличается очень высокой экологической пластичностью к антропогенным факторам разнообразным ядохимикатам, тяжелым металлам, а также к нефти и нефтепродуктам (Мельников С.С., Мананкина Е.Е. Хлорелла: физиологически-активные вещества и их использование. Минск: Наука и техника, 1991. 79 с.; Дубовик И.Е. Влияние углеводородов нефти на одноклеточные водоросли // Физиол. и биохим. Клетки при действии экстремальных факторов: Сб. науч.тр. Уфа: БашГУ, 1988. С.95-100; Кузьахметов Г.Г. Способ оценки загрязнения почв по морфологическим показателям популяций водорослей // Почвоведение. 1993. № 8. C.114-117).

Грибы играют заметную роль в деградации нефти в почве и способны утилизировать полиароматические углеводороды (ПАУ) (Bossert, I., Bartha R. The fate of petroleum in soil ecosystems // Petroleum microbiology. - New York: Macmillan Publishing Co., 1984. - P.435-473; Козлов, 2002, Александрова А.В. Род Trichoderma Pers.: Fr. Новое в систематике и номенклатуре грибов, 2003 г.). Используемый штамм Trichoderma lignorum F-98 относится к целлюлозолитическим грибам.

Используемые штаммы бактерий Rhodococcus eqvi и дрожжей Rhodotorula glutinis входят в состав нефтеокисляющего препарата «Универсал» и избирательны в отношении биодеградации углеводородов разных классов (Маганов, Маркарова, Муляк и др., 2006: Природоохранные работы на предприятиях нефтегазового комплекса. Часть 1. Рекультивация загрязненных нефтью земель в Усинском районе Республики Коми. - Сыктывкар, 2006. - 208 с.).

Способ получения индивидуальных биосорбентов предусматривает технологию получения активной формы биопрепарата с последующей иммобилизацией микроорганизмов на носителе, экономически прост, пригоден для промышленного изготовления. Биосорбенты бактериальный, дрожжевой и грибной получают способом адсорбции на сорбенте «Сорбонафт». Адсорбция клеток обеспечивает как высокую клеточную нагрузку (порядка 1 г влажной биомассы на 1 г носителя), так и необратимое связывание больших количеств биомассы. Активность и стабильность получаемых индивидуальных сорбентов не ниже соответствующих параметров аналогов, полученных с применением других методов. Данный способ дешев, прост, универсален и не оказывает стрессовых воздействий на клетки.

Для использования применяют «смешанный» биосорбент или композицию индивидуальных биосорбентов.

Комплексный биосорбент для очистки содержит композицию индивидуальных биосорбентов, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00	45-55
Дрожжевой с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 M	45-55
или Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00	45-55
Грибной с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98	45-55
или Бактериальный с культурой Rhodococcus eqvi P-72-00	40-50
Дрожжевой с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 M	20-35
Грибной с мицелиальным грибом Trichoderma lignorum F-98	25-35

Способ получения биосорбента и его свойства показаны на примерах в модельных опытах. В качестве гидрофобного нефтяного сорбента на основе торфа использовали сорбент с торговым названием «СОРБОНАФТ».

В опытах предусмотрено иммобилизование микроорганизмов в нефтяной сорбент, получение индивидуальных сорбентов, их комбинирование и затем, после нанесения сорбента в загрязненную водную поверхность внесение накопительной культуры микроводорослей (MB) рода Chlorella, а так же последующее в ходе опытов (в начале и конце) определение степени деструкции ими адсорбированной сорбентом нефти и нефтепродуктов (НП) в воде и в сорбенте.

Полученный биосорбент применяется совместно с концентрированной культурой микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer, при соотношении компонентов по сухому веществу, мас.%:

биосорбент	90-97
биомасса микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer	3-10

В условиях лаборатории проведены испытания биосорбентов с целью оптимизации процесса деградации нефти на загрязненных водных поверхностях. В соответствии с этим в первом опыте изготавливали биосорбенты, а именно готовили биомассу микроорганизмов и вносили их в сорбент, во втором опыте полученные биосорбенты, обогащенные индивидуальными микроорганизмами и биомассу MB распыляли на водную поверхность, загрязненную определенным количеством нефти и дизельного топлива, или в загрязненную нефтепродуктами воду шламонакопителя аэропорта г.Сыктывкар.

Опыт 1. Получение биосорбента на основе сорбента «Сорбонафт» включает глубинное культивирование микроорганизмов (м/о) с последующим концентрированием и иммобилизацией накопительной культуры на носителе. Для получения биомассы клеток м/о (бактериального, дрожжевого и мицелиального грибов) чистые культуры выращивали в условиях глубинной ферментации на комбинированной (углеводно-углеродной) питательной среде, включающей минеральные соли азота, фосфора, калия. Питательная среда индивидуальна по минеральному составу и pH для бактериальной, дрожжевой и грибной культур м/о. Культивирование индивидуальных культур проводили при 22-25°C в условиях интенсивной аэрации на качалке при 220 об/мин в течение 2-3 суток. По достижении плотности культур не менее 3,0-5,0 г/л по сухой биомассе, культуральную жидкость центрифугировали, в полученном осадке концентрация сухой биомассы достигала 15-20 г/л. В лабораторных условиях по 1 мл концентрированной биомассы каждой из индивидуальных культур перемешивали с 1 г сорбента «Сорбонафт», высушивали полученные таким образом биосорбенты при температуре не более 35°C и получали индивидуальные биосорбенты, готовые к дальнейшему применению.

В сорбентах был определен клеточный титр (Тк), под которым понимается количество жизнеспособных клеток микроорганизмов, иммобилизованных на 1 г адсорбента-носителя. Тк определялся по разности концентраций клеточной суспензии до и после контакта с адсорбентом, а также методом предельных разведений посевом сорбента. Число клеток в суспензии определялось методом Коха по стандартной методике. Время контакта клеток для бактериальной, дрожжевой и грибной культур м/о с сорбентом 3-20 часов (оптимальный срок 6 часов). Также была определена дегидрогеназная активность (Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 2005. - 252 с.) сорбентов после высушивания, характеризующая углеводородокисляющую активность биосорбентов. Все клетки находились в экспоненциальной фазе роста. Результаты представлены в таблице 1. Считается, что пригодными для создания биопрепаратов на носителях (сорбентах), т.е. обеспечивающими достаточно высокую клеточную нагрузку на 1 г носителя, являются те материалы, на которых клеточный титр равен 10⁷ клеток/г носителя, для представленных сорбентов клеточный титр соответствует требованиям и сохраняется в течение 8-12 месяцев.

Накопительную культуру зеленых водорослей рода Chlorella - вид Chlorella vulgaris Beijer получали культивированием на среде Майерса при дневном освещении или по методике (Григорьев Ю.С., Андреев А.А. «Устройство для выращивания микроводорослей», патент № 2165973), с последующим концентрированием центрифугированием (2000 об/мин), с показателями по биомассе 3,5-30 г/л. Определение интенсивности развития водорослей в водной среде Ca, Cb по концентрации соответствующих хлорофиллов а и b y зеленых микроводорослей по методике (Методы физиолого-биохимического исследования водорослей. Отв. редактор Топачевский А.В. - Наукова думка, 1975, стр.48-50). Культивирование водорослей - простой и малозатратный способ.

Опыт 2. Испытание полученных адсорбционным способом биосорбентов для очистки загрязненной нефтью и дизельным топливом воды.

Для живых объектов опасны в определенных концентрациях и нерастворимая составляющая нефти, и растворимые соединения, которые также входят в состав дизельного топлива и неосвинцованного бензина (Ратушняк А.А., Андреева М.Г., Латыпова В.З., Гарипова Л.Г. Токсическое действие нефти и продуктов ее переработки на Daphnia magna Straus // Гидробиол. Журнал. - 2000. - 25 с.). За счет обогащения сорбента м/о общая площадь поверхности контакта сорбента с поллютантом и поглотительная способность снижены, поэтому в опытах соотношение нефти и биосорбента было 2:3, а дизельного топлива и биосорбента (ДТ) 1:2.

Биосорбенты с ассоциацией м/о и жидкий концентрированный биопрепарат микроводорослей наносят на загрязненную водную поверхность, при этом осуществляется одновременная сорбция и биодеструкция нефти и нефтяных углеводородов (дизельное топливо) в присутствии микроорганизмов и зеленых водорослей.

Опыт 2.1. Готовили минеральный раствор дистиллированной воды с азофоской (0,35% раствор), разливали по 100 мл в стеклянные колбы емкостью 250 мл, вносили в колбы нефть в количестве 2 мл (2% или 15 г/л загрязнения) и сорбента по 3 г. ДТ вносили в соответствующие варианты опыта по 1 мл (1% или 7 г/л загрязнения) и сорбента по 2 г.В варианты 4,5,6 (таблица 2) добавляли биосорбенты при соотношении, мас.%: 50:50 и 45:25:30, и микроводоросли к массе комплексного биосорбента в соотношении 1:2 и 1:3 (1 мл водорослей биомассой 3,5 г/л.). Результаты опытов приведены в таблице 2.

Опыт 2.2. Два образца загрязненной воды из шламонакопителя Аэропорта «Сыктывкар» размещали по 100 мл в стеклянные колбы емкостью 250 мл, в которые затем в варианты 3 и 4 (таблица 3) добавляли биосорбенты при соотношении мас.%:

50:50 и 50:50 и микроводоросли к массе комплексного биосорбента в соотношении 1:1. Образец 1 - исходное содержание нефтепродуктов (НП) 2,1 мг/л; образец 2 - исходное содержание НП 1,6 мг/л. Результаты опытов приведены в таблице 3.

Химические и микробиологические анализы проводили по окончании опыта, который длился 60 дней (2-3 месяца вегетационный период положительных температур на Севере). Перед анализом проводили разделение отработанного сорбента и воды фильтрованием. Концентрацию НП в воде и в сорбенте определяли флюориметрически на анализаторе «Флюорат - 02» (Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости «Флюорат - 02» ПНД Ф16.1.21-98. - М., 1998. - 15 с.). По окончании опытов 2.1. и 2.2. рассматривали комплекс показателей, отражающих механизм и взаимосвязь процессов биологической очистки загрязненной водной среды, которые позволяют судить об эффективности биологического метода очистки водных сред УОМ, иммобилизованными на сорбентах в присутствии микроводорослей.

Наиболее интенсивно очистка от нефти в массе всех бисорбентов произошла в вариантах с внесением культуры водорослей. В вариантах 5,6 (таблица 2) с дрожжевым и бактериально-грибным биосорбентами, процент очистки составил соответственно 72,5% и 88,6%. Несколько менее интенсивно прошел процесс очистки в варианте 4 (таблица 2) с внесением композиции биосорбентов бактериального, дрожжевого и грибного 62,7%.

По окончании опыта 2.2, для очистки загрязненной нефтью воды шламонакопителя особенно эффективно было применение бактериально-грибного и бактериально-дрожжевого биосорбентов (варианты 3,4 - таблица 3).

Во всех вариантах опыта численность м/о в водной среде была на 1-2 порядка ниже, чем в массе биосорбентов. Полученные микробиологические показатели говорят об отсутствии прямой связи между численностью в водной среде культивируемых, внесенных форм м/о и их потенциальной нефтеокисляющей активностью. Так, гриб Trichoderma самостоятельно не активно разлагает нефтепродукты, но его мицелий служит матрицей для адгезии других УОМ, конкретно культуры Rhodococcus eqvi P-72-00 с культурой Rhodotorula glutinis 2-4 М, а по показателям суммарной концентрации пигментов хлорофилла a и b, Ca, Cb, можно судить о концентрации клеток MB.

Сорбент-носитель стимулирует микробный метаболизм за счет локализации иммобилизованных и свободных клеток в приповерхностном слое воды, тем самым ускоряя процесс биоремедиации, а водорастворимые микробные метаболиты создают условия для симбиотических отношений микробного сообщества в целом MB - УОМ биосорбентов, за счет этого повышается эффективность применяемых биосорбентов.

Таким образом, биосорбенты способны эффективно осуществлять одновременно сорбцию и разложение нефти в водной толще и в массе сорбента, а именно при загрязнении нефтью водного субстрата до 15 г/л и более 50% массы сорбента при исходном весовом соотношении 1:1 нефти и биосорбента, а также деструкцию токсичных нефтепродуктов ДТ при концентрации около 40% или 7 г/л, бензиновых и керосиновых фракций в массе загрязненной воды шламонакопителя при исходном весовом соотношении нефтепродуктов и биосорбента 1:2. Эффективность очистки субстратов от нефти достигается за счет применения иммобилизованных на гидрофобном сорбенте штаммов бактериального, дрожжевого и грибного консорциума в присутствии зеленых микроводорослей рода Chlorella и состоит в снижении содержания нефтепродуктов в сорбенте за 60 суток на 70-89%.

Таблица 1
Биологические показатели иммобилизованных культур микроорганизмов на сорбенте опыта 1.
Наименование биосорбента	Иммобилизованная культура	Регистрационный № ККМ	Рабочее наименование	Тк, Титр Кл/г сорбента	АД, мг ТФФ/час 1 г сорбента
Сорбент без м/о	-		С без м/о	0	0
Бактериальный	Rhodococcus egvi	B-1117	Сб	2,5×10 7	0,054
Дрожжевой	Rhodotorula Glutinis	Y-1112	Сд	1×10 7	0,076
Грибной	Tiichoderma lignorum	F-98	Сг	5×10 7	0,081

Таблица 2
Результаты анализов по окончании опыта 2.1.
№ , наименование варианта	Загрязнитель-нефть 2%	Загрязнитель - ДТ 1%.
Содержание НП в сорбенте мг/г	Убыль НП в сорбенте %	Mг ТФФ/ час 1 г сорб.	Сумм-е содержание каротиноидов Ca,Cb мг/л	КОЕ УОМ/lг сорбента.	Содержание НП в сорбенте мг/г	Убыль НП в сорбенте %	ТФФ/ час 1 г сорб	Сумм-е содержан ие каротиноидов Са,СЬ мг/л	КОЕ УОМ /1 г сорбента
1. Сорбент без м/о	510	6				109	9
2. Сорбент без м/о и микроводоросли	400±130	21,5	0,009	11,1	1,3* 106	96±24	11,9	0,004	5,77	6,2* 106
3. Сорбент бактериальный и микроводоросли	54±13	89,4	0,285	22,3	1,6* 108	19±5	82,5	0,047	2,29	6,4* 106
4. Сорбент бактер-й (45%)+ Сорбент дрожжевой (25%)+ сорбент грибной (30%) и микроводоросли (3,5%) к массе комплексного биосорбента	190±50	62,7	0,055	6,1	2,4* 108	26±6	76,1	0,052	0,59	2,1* 107
5. Сорбент бактер-й (50 %)+ сорбент дрожжевой (50%) и микроводоросли (3,5%) к массе комплексного биосорбента	140±50	72,5	0,055	4,2	1,3* 10 8	20±5	81,6	0,049	4,50	1,2* 106
6. Сорбент бактер-й (50 %)+ сорбент грибной (50%) и микроводоросли (3,5%) к массе комплексного биосор-та	58±18	88,6	0,140	3,1	1,9* 10 8	28±7	74,3	0,062	2,62	3,6* 106

Таблица 3
Результаты анализов по окончании опыта 2.2.
№ , наименование варианта	Загрязненная вода объекта 1 шламонакопителя с исходным СНП 2,1 мг/л, 1,5 г биосорбент	Загрязненная вода объекта 2 шламонакопителя с исходным СНП 1,6 мг/л, 1,5 г биосорбент
Содержание НП в воде мг/л	Содержание НП в сорбенте мг/г	Убыль НП в сорбенте/ в воде %	Mг ТФФ/ час 1г сорбента	Суммарное содержание каротиноидов Ca,Cb мг/л	Содержание НП в воде мг/л	Содержание НП в сорбенте мг/г	Убыль НП в сорбенте/ в воде %	Mг ТФФ/ час 1г сорбента	Суммарное содержание каротиноидов Ca,Cb мг/л
1. Вода+МВ + Сорбент без м/о, 3г	0,25±0,09	0,75±0,19		0,013	2,67	0,25±0,09	0,8±0,2		0,012	2,24
2. Вода+МВ+ б/с(Сб)	0,18±0,06	1,0±0,3		0,009	1,59	0,26±0,09	0,50±0,12		0,010	2,24
3. Вода+МВ+(Сб+Сд) (1:1)	0,15±0,05	0,53±0,13		0,013	1,80	0,16±0,05	0,85±0,21		0,014	1,28
4. Вода+ МВ+ б/с (Сб+Сг) (1:1)	0,15±0,05	0,63±0,16		0,022	2,66	0,12±0,04	0,63±0,16		0,017	1,83