штамм бактерий brevibacillus laterosporus, продуцирующий широкий спектр биологически активных соединений
Классы МПК: | C12N1/20 бактерии; питательные среды для них C12P1/04 бактерий |
Автор(ы): | Кузнецова Наталия Ивановна (RU), Азизбекян Рудольф Рубенович (RU), Кузин Анатолий Иванович (RU), Николаенко Марина Анатольевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2010-06-24 публикация патента:
27.06.2011 |
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 получен путем многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus 16-336. Штамм продуцирует широкий спектр биологически активных соединений для борьбы с микроскопическими водорослями, относящимися к различным таксономическим типам, фитопатогенными грибами и патогенными бактериями. Альгицидная активность штамма составляет 10,5-52,5% остаточной оптической плотности через 24 ч инкубации. Диаметр зоны задержки роста фитопатогенных грибов составляет 3-14 мм. Диаметр зоны задержки роста патогенных бактерий составляет 5-12 мм. 5 табл.
Формула изобретения
Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531, продуцирующий широкий спектр биологически активных соединений для борьбы с микроскопическими водорослями, фитопатогенными грибами и патогенными бактериями.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности производству и применению биологических средств борьбы с фитопатогенными грибами, патогенными бактериями и микроскопическими водорослями. В последние годы широко используются биологические пестициды, обеспечивающие экологически приемлемые условия ведения сельского хозяйства. Микроорганизмы продолжают оставаться наиболее востребованными продуцентами различных соединений, обладающих антибактериальным эффектом. Возрастает интерес к биологическим агентам, подавляющим развитие микроскопических водорослей. Среди микроорганизмов, продуцирующих биологически активные соединения различной направленности, в последние годы особое место занимают спорообразующие грамположительные бактерии Brevibacillus laterosporus. Интерес к этим бактериям обусловлен отсутствием у них токсичности для теплокровных животных.
Штаммы В. laterosporus обладают рядом биотехнологических преимуществ: легко культивируются на относительно дешевых питательных средах, не требуют специальных условий для культивирования, штаммы бацилл могут поддерживаться в лабораторных условиях в течение длительного времени. В настоящее время описаны штаммы В. laterosporus, которые синтезируют ряд биологически активных соединений, в том числе антибиотики, пестицидные факторы, ферменты, альгициды, нематоциды и т.д. Вышесказанное свидетельствует о высоком биотехнологическом потенциале штаммов Brevibacillus laterosporus как возможных продуцентов широкого спектра антибиотических факторов.
Ряд описанных штаммов В. laterosporus могут использоваться в медицине. Так, штаммы В. laterosporus продуцируют большое число антибиотиков различной химической структуры и механизмов действия. Водорастворимый антибиотик небелковой природы латероспорамин обладал слабой ингибирующей активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий [1]. Аналог антибиотика спергуалина, 15-дезоксиспергуалин, обладал противоопухолевой активностью и выраженным иммунодепрессивным действием на различные трансплантационные модели [2-3].
Группа циклических декапептидов тироцидинового семейства - лолоатины, обладающих высокой антибиотической активностью против патогенных грамположительных бактерий, была выделена из морского штамма В. laterosporus [4]. Циклический декапептид латероцидин был выделен в России [5]. Учитывая токсикологическую безопасность и способность к быстрой колонизации кишечника некоторые штаммы В. laterosporus могут быть использованы как эффективные пробиотики. Так, бактерии В. laterosporus BOD входит в состав препаратов-пробиотиков в гастроэнтерологии, использующихся для лечения заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника человека, что свидетельствует об их безопасности. Данный штамм оказывал антигрибной и антибактериальной эффекты [6]. Описаны штаммы В. laterosporus, обладающие инсектицидным эффектом против домашней мухи, личинок комаров, кукурузного корневого червя [7-9]. Инсектицид на основе штамма В. laterosporus вызывал 100%-ную гибель личинок и взрослых особей домашних мух [10].
Имеются данные об антагонистической активности В. laterosporus против возбудителей болезней растений. Штамм В. laterosporus использован при создании биологического фунгицида для защиты картофеля от фитопатогенных грибов [11]. Исходя из ряда данных, некоторые исследователи предлагают включать культуру В. laterosporus, наряду с другими почвенными бактериями, в состав бактериальных смесей, использующихся для потенцирования эффективности действия химических гербицидов [12].
Показано, что штаммы В. laterosporus могут подавлять развитие грибов, поражающих человека и животных. Введение животному культуры В. laterosporus снижало за 7 дней рост Candida albicans на 95-99% [13].
Пептидный антибиотик с мол. массой 1608 Да, продуцируемый штаммом, выделен из морского осадка. Антибиотик обладал наряду с фунгицидной активностью против Candida albicans и Aspergillus fumigatus, также антибактериальной активностью против ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [14].
Штамм В. laterosporus BOD, входящий в состав широко используемого пробиотика «Flora Balance», за 28 дней снижал долю Candida albicans в кишечном тракте человека со 100% до 19% [6]. Таким образом, бактерии В. laterosporus BOD проявляли себя как экологически безвредные транзитные организмы, обеспечивающие развитие здоровой или полезной микрофлоры пищеварительной системы.
Обработка почвы бактериями В. laterosporus увеличивала рост растений и повышала урожайность зерновых культур почти на 30% по сравнению с необработанной почвой [9]. Предварительная обработка почвы бактериями В. laterosporus снижала количество аэробных бактерий кишечной группы, что обеспечивало фиксацию щелочной среды почвы. Обработка целевых растений бактериями данного вида ингибировала развитие фитопатогенных бактерий и микроскопических грибов, что повышало урожайность растений [15].
К весьма интересным биологически активным соединениям следует отнести щелочную протеиназу с молекулярной массой около 30 кДа, являющуюся фактором патогенности для нематод [16]. О широком разнообразии биологически активных соединений, продуцируемых В. laterosporus, свидетельствует антагонистическая активность против белых червей [17]. В России описан циклический декапептид латероцидин, проявляющий антагонистическую активность против различных видов организмов, в том числе против простейших [5].
В настоящее время проводится интенсивный поиск новых штаммов бацилл, в том числе среди бактерий В. laterosporus, продуцентов липопептидов и циклопептидов, как потенциальных продуцентов антибиотиков широкого спектра действия. В этом плане, представляет интерес обнаруженная у некоторых штаммов В. laterosporus способность угнетать рост микроскопических водорослей - альгипидный эффект [18-19]. Проблема борьбы с микроводорослями в последние годы становится актуальной. Поступление промышленных, хозяйственно-бытовых и сельскохозяйственных сточных вод приводит к загрязнению водоемов, выражающемся в «цветении» воды за счет развития различных типов микроскопических водорослей, и, прежде всего, сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Рост микроводорослей приводит к «цветению» водоемов и, в дальнейшем, сопровождается отмиранием их избыточной биомассы, выделением токсинов, нарушением кислородного режима, органолептическими проявлениями гниения. «Цветение воды» приводит к ухудшению качества воды, нежелательному для бытового, рекреационного, рыбо-хозяйственного, энергетического использования, вызывает ряд серьезных социальных и экономических последствий, что предопределяет необходимость борьбы с сине-зелеными бактериями и продуктами их метаболизма. Учитывая, что микроводоросли развиваются также в рисовых чеках, представляется актуальным поиск штаммов, обладающих альгицидным действием.
Задача заявляемого изобретения:
получить штамм бактерий, обладающих широким спектром антагонистической активности и совмещающих альгицидную, фунгицидную и антибактериальную активности.
Задача решена путем получения штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531.
Заявляемый штамм получен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus 16-336, выделенного из природных источников, и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-10531.
В качестве ближайшего аналога заявляемого объекта рассмотрен штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405, обладающий альгицидным действием. Штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 отличается от ближайшего аналога Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405 широким спектром антагонистической активности - альгицидной, фунгицидной и антибактериальной.
1. Культивирование штамма.
В качестве питательных сред использовали NBY, ASC, SG, YM следующего состава (мас.%):
среда NBY:
питательный бульон «Difco» | - 0,8; |
дрожжевой экстракт « Difco» | - 0,3; |
вода | - остальное. |
среда ASC:
дрожжевой экстракт «Difco» | - 0,5; |
сахароза | - 2,0; |
лимонная кислота | - 1,17; |
Na 2SO4 | - 0,4; |
(NH 4)2HPO4 | - 0,42; |
KCl | - 0,076; |
MgCl2×6H 2O | - 0,042; |
вода | - остальное |
среда SG:
сукцинат натрия | - 0,5; |
глицерин | - 1,5; |
MgSO4 | - 0,02; |
(NH 4)2HPO4 | - 0,5; |
KCl | - 0,2; |
вода | - остальное. |
среда YM:
гидролизные дрожжи | - 4,5; |
вода | - остальное. |
Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляли агар-агар (2,0 мас.%).
2. Культурально-морфологические признаки.
Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×3,3-5,0 мкм, цепочек не образуют. Хорошо спорулирует в жидкой и на твердой питательной среде NBY.
При культивировании на агаризованной среде NBY через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-5 мм светлого кремового цвета с гладкой поверхностью и неровным краем. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры. В процессе споруляции образуется характерная каноэвидная структура, примыкающая к споре с одной из сторон. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,8-1,2×1,4-1,7 мкм.
3. Физиолого-биохимические свойства.
Культивирование штамма заявляемого штамма осуществляют в диапазоне температур 28-30°С при рН 6,8-7,2. Оптимальными являются температура для культивирования штамма В-10531 - 30°С и рН 7,0.
Штамм образует каталазу. Гидролизует казеин и желатину, не гидролизует крахмал. Мочевину не расщепляет. Не сбраживает сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу. Сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, фруктозу. Глюкозу сбраживает без газа. Не образует ацетона. Образует лецитиназу, твин-эстеразу. Растет в присутствии лизопима.
На основании морфологических (наличие каноэвидной структуры, прикрепленной к споре) и физиолого-биохимических признаков штамм ВКПМ В-10531 отнесен к Brevibacillus laterosporus [20].
4. Антагонистическая активность.
Штамм проявляет антагонистическую активность по отношению к микроводорослям.
Штамм характеризуется широким спектром альгицидной активности и подавляет развитие следующих микроскопических водорослей (таблица 1).
Таблица 1 | |
Таксономия использованных микроводорослей | |
Вид микроводорослей | Таксономический тип |
Anabaena sp. 5781 | Cyanophyta |
Nostoc sp. A-10 | Cyanophyta |
Microcystis aeroginosa 562 | Cyanophyta |
Microcystis aeroginosa 905 | Cyanophyta |
Cosmarium sp. | Chlorophyta |
Chlorella vulgaris | Chlorophyta |
Chlamydomonas reinhardi | Chlorophyta |
Thalassiosira weissflogii | Dinoflagellata |
Prorocentrum micans | Dinoflagellata |
Amphidinium carterae | Dinophyta |
Штамм проявляет также антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам: Fusarium solani, Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phomopsis helianthi, Phoma solanicola, Alternaria tenuis, Botrytis cinerea;
грамположительным бактериям: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis;
грамотрицательным бактериям: Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 в средах ASC и SG.
Среды ASC и SG готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0, разливали в пробирки по 5-10 мл и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С в течение 30 мин. Стерильность и рН контролировали путем отбора соответствующих проб. Затем в пробирки со средой ASC или SG вносили по 1 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильной питательной среды NBY помещали бактериальную культуру, собранную петлей с твердой агаризованной среды NBY, и инкубировали в течение 16 часов при температуре 30°С со встряхиванием 250 об/мин. Содержимое пробирки, после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры, использовали как посевной материал.
Заявляемый штамм культивировали в стандартных пробирках в 5 мл в жидких питательных средах ASC или SG в течение 72-96 часов при 28-30°С со встряхиванием при 250 об/мин. Методом световой микроскопии и высевом на питательный агар оценивали наличие бактериальных клеток и спор и отсутствие посторонней микрофлоры. К 96 часам культивирования наблюдали незначительное спорообразование - 5-10% спор, преимущественно - 90-95% вегетативных клеток. Микробиологическим методом оценивали титр колоний образующих единиц (КОЕ) штамма ВКПМ В-10531, который составлял ~1-2×10 9/мл.
Пример 2.
Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 в среде NBY.
Для культивирования заявляемого штамма В-10531 используют среду NBY [21]. Среду готовят на дистиллированной воде, доводят значение рН до 7,0; разливают в стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см3 по 50 мл и стерилизуют при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы, с содержащейся в них средой, охлаждают до +20 С. Стерильность и рН среды контролируют путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала используют 5 мл культуры ВКПМ В-10531, полученной при культивировании в среде NBY 16 часов при 30°С при встряхивании 250 об/мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. Продуктивность штамма определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду. Наблюдается равномерный рост культуры по всему объему среды. К 96 часам культивирования наблюдается преимущественно 90-95% спор и 5-10% вегетативных клеток.
Микробиологическим методом оценивали титр КОЕ штамма ВКПМ В-10531, который составлял ~1×109 /мл.
Поддержание штамма ВКПМ В-10531 проводили на косяках в стандартных пробирках с агаризованной средой NBY.
Хранение штамма осуществляли после его лиофилизации. Вегетативную культуру клеток выращивали на агаризованной среде NBY до образования спор. Споры и оставшиеся клетки смывали защитной средой, содержащей стерилизованное обезжиренное молоко. Ампулы с суспензией клеток и спор выдерживали 15 мин при -70°С, а затем быстро переносили в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Время сушки составляло 4 часа. Лиофилизированные образцы хранили в холодильнике при температуре +4°С.
Пример 3.
Культивирование микроскопических водорослей, используемых для выявления альгицидных свойств штамма.
Использовали штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - получен с кафедры микробиологии ЛГУ; Nostoc sp. A-10 - получен из коллекции IMET, Йена, ГДР; штаммы азот не фиксирующих цианобактерий Microcystis aeroginosa 905 и 562 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г.Ухань); штаммы зеленых (Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas) и морских водорослей (Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira) получены с кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ.
Штаммы цианобактерий Аnаbаеnа, Nostoc и зеленых водорослей Cosmarium выращивали в модифицированной среде BG-11[22]. Штамм Chlorella vulgaris выращивали в среде Тамийя [23]. Штамм Chlamydomonas reinhardy выращивали в среде TAPs [24]. Штаммы Microcystis aeruginosa выращивали в среде В-12 [25]. Культуральные среды для морских водорослей: диатомовых - Thalassiosira - weissflogii и динофициевых - Amphidinium carterae и Prorocentrum micans готовили на искусственной морской воде соленостью 30 °/oo, которую перед внесением добавок трехкратно пастеризовали. Затем в эту воду вносили добавки согласно прописи среды f/2 [26].
Штаммы микроводорослей выращивали в соответствующих каждому виду средах в 50-100 мл в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл при 25-30°С без аэрации при комнатной температуре и круглосуточном освещении. Использовали люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивали освещенность 40 мкмоль квантов м-2 c-1 в области ФАР. Культуры морских водорослей: диатомовых - Thalassiosira weissflogii и динофициевых - Amphidinium carterae и Prorocentrum micans выращивали в помещенных на шейкер 1 л колбах (объем клеточной суспензии 0,5 л) при температуре 20°С и освещенности 30 мкмоль квантов·м-2·с -1 в области ФАР, создаваемой люминесцентными лампами дневного света. Продолжительность светового периода составляла 14 часов в сутки.
Пример 4.
Определение альгицидной активности штамма ВКПМ В-10531.
Альгицидную активность штамма выявляли при совместном культивировании. Для количественной оценки альгицидного эффекта к жидкой культуре сине-зеленых (Nostoc, Anabaena, Microcystis) и зеленых водорослей (Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas) добавляли 96-часовую культуру бацилл в соотношении 5:1 и определяли остаточную оптическую плотность по формуле: (ОПО), как (ОПт/ОПн )×100, где ОПН - начальная ОП, ОПТ - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно.
Измеряли оптическую плотность (при длине волны 590 нм) смеси в нулевой момент времени и после совместной инкубации.
Альгицидную активность заявляемого штамма оценивали по снижению оптической плотности через 24 часа инкубации. Снижение оптической плотности смеси с Nostoc и Anabaena составляло 10 раз, a Microcystis, Cosmarium, Chlorella в полтора - два раза, что свидетельствовало о его литическом действии на микроводоросли (таблица 2). Лизис клеток микроводорослей выявляли также при оптической микроскопии.
Таблица 2 | ||||||
Альгицидная активность штамма ВКПМ В-9844, выращенного в среде ASC | ||||||
Остаточная оптическая плотность через 24 часа инкубации, % | ||||||
Nostoc | Anabaena | Microcystis | Cosmarium | Chlorella | Chlamydomonas | |
Без обработки | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 |
Обработка штаммом В-10531 | 10,5 | 12,5 | 45,0 | 50,5 | 52,5 | 65,5 |
Обработка штаммом В-9405 | 20,1 | 22,2 | 63,1 | 65,5 | 66,8 | Не определяли |
Следует отметить значительную мутность инкубационных смесей Microcystis, Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas со штаммом ВКПМ В-10531. Однако при этом происходит обесцвечивание полученной смеси. Следует отметить, что цианобактерии Anabaena и Nostoc более чувствительны к воздействию культуральной жидкости изучаемого штамма и обесцвечивание клеток водорослей наступает уже к 1-2 часам совместного инкубирования. Микроскопически выявляли лизис вегетативных клеток всех видов микроводорослей.
Пример 5.
Определение спектра действия альгицидного фактора штамма ВКПМ В-10531.
Для оценки антагонистического (альгицидного) эффекта определяли изменение окраски инкубационных смесей планктонных форм микроводорослей и штамма ВКПМ В-10531. Микроводоросли синтезируют различные пигменты (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), которые и определяют их цвет. Во всех опытах наблюдали обесцвечивание инкубационных смесей микроводорослей со штаммом ВКПМ В-10531. Измерение оптической плотности смеси морских водорослей Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira со штаммом ВКПМ В-10531 не представлялось возможным из-за физико-химических свойств - высокой мутности полученных суспензий.
Таблица 3 | ||||
Спектр альгицидного действия культуральной жидкости штамма ВКПМ В-10531 | ||||
Таксономический тип водорослей | Предпочтительная среда обитания | Первоначальная окраска смеси | Уровень измерения окраски через | |
24 часа | 96 часов* | |||
Anabaena 5781 | пресная вода | сине-зеленый | +++ | +++ |
Nostoc A-10 | пресная вода | сине-зеленый | +++ | +++ |
Microcystis aeruginosa 562 | пресная вода | желто-зеленый | ++ | +++ |
Microcystis aeruginosa 905 | пресная вода | желто-зеленый | ++ | +++ |
Cosmarium sp. | пресная вода | зеленый | + | +++ |
Chlorella vulgaris | пресная вода | зеленый | + | ++ |
Chlamydomonas reinhardy | пресная вода | зеленый | + | ++ |
Prorocentrum micans | морская вода | светло-зеленый | + | ++ |
Prorocentrum micans | морская вода | светло-зеленый | + | ++ |
Amphidinium carterae | морская вода | коричневый | + | ++ |
* (+) - изменение цвета смеси до светло-зеленого (или желтого), (++) - осветление смеси до желтого цвета, (+++) - полное обесцвечивание смеси микроводорослей и штамма В-10531 |
Как следует из таблицы 3, все штаммы микроводорослей чувствительны к альгицидному действию штамма В-10531, но уровень их чувствительности различен в зависимости от времени воздействия. При оптической микроскопии выявляли лизис вегетативных клеток микроводорослей изученных таксономических типов.
Пример 6.
Определение фунгицидной активности штамма Brevibacitlus laterosporus ВКПМ В-10531.
Для выявления фунгицидной активности использовали культуральную жидкость штамма В-10531. Тестирование фунгицидной активности проводили методом лунок. Для этого тестируемые фитопатогенные грибы высевали в центр чашки Петри с картофельным агаром (мас.%: бакто-агар - 2,0; глюкоза - 1,5; картофельный отвар -до 1 л, рН - при 25°С - 7,2). В вырезанные в агаре лунки диаметром 10 мм вносили по 200 мкл 72-часовой культуральной жидкости штамма. Чашки инкубировали в темноте при комнатной температуре. Через 48 часов оценивали наличие или отсутствие зон подавления роста грибов. Эффективность фунгицидного действия определяли по диаметру зоны отсутствия роста фитопатогенных грибов.
Таблица 4 | |||
Фитопатогенные грибы | Зоны подавления роста фитопатогенных грибов культуральной жидкостью штамма В-10531, выращенного на средах (мм) | ||
YM | SG | NBY | |
Fusarium solani | 14* | 12 | 10 |
Fusarium graminearum | 5 | 3 | 3 |
Rhizoctonia solani | 11 | 12 | - |
Sclerotinia sclerotiorum | 14 | 13 | 13 |
Phoma solanicola | 10 | 10 | 12 |
Alternaria tenuis | 13 | 10 | 4 |
Botrytis cinerea | 12 | 10 | 12 |
(*) - диаметр зоны задержки роста; (-) - отсутствие зоны задержки роста. |
Как следует из таблицы 4, заявляемый штамм подавлял рост мицелия исследованных фитопатогенных грибов.
Пример 7.
Определение спектра антибактериального действия штамма ВКПМ В-10531.
Антибактериальное действие культуры штамма В-10531 выявляли на грамположительных и грамотрицательных тест-бактериях. Тест-микроорганизмы культивировали при 37°С и 220 об/мин в течение 24 часов в бульоне Мюллера-Хинтона (Mueller Hinton Broth, HIMEDIA, India), мас.%: кислотный гидролизат казеина - 30,0; вытяжка из говядины - 1,75; растворимый крахмал - 0,15; рН - (при 25°С) - 7,4±0,2. Тестирование антибактериальной активности проводили методом лунок на плотной агаризованной среде. Для этого бактериальные тест-культуры с оптической плотностью 0,5 высевали на чашки Петри с 20 мл агаризованной среды Мюллера-Хинтона. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30 мин, после чего в агаре вырезали лунки диаметром 4 мм, в которые вносили по 25 мкл образца культуральной жидкости (КЖ) штамма В-10531, культивируемого на средах NBY и ASC в течение 72 часов, а также фракций осадка и надосадка. Осадок отделяли центрифугированием на высокоскоростной центрифуге Eppendorf со скоростью 10000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°С. Осадок ресуспендировали в равном объеме стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри с образцами фракций КЖ, осадка и надосадка инкубировали при 37°С. Антагонистическое действие штамма оценивали по наличию зоны задержки роста тест-бактерий через 24-48 часов и измерению зон ингибирования роста тест-микроорганизмов.
Таблица 5 | |||||
Спектр антибактериальной активности фракций штамма В-10531, культивируемого на средах NBY и ASC, на грамположительных и грамотрицательных тест-бактериях | |||||
Фракции культуральной жидкости штамма В-10531 | Зоны подавления роста тест-бактерий (мм) | ||||
Staphylococcus aureus | Enterococcus faecalis | Salmonella enteritidis | Escherichia coli | Pseudomonas aeruginosa | |
36/NBY/кж | 10* | 10 | 9 | 10 | 10 |
36/NBY/но | 8 | 7 | - | - | - |
36/NBY/oc | 10 | 9 | 7 | 6 | 8 |
36/ASC/кж | 11 | 12 | 10 | 7 | 10 |
36/ASC/но | 10 | 10 | 6 | 7 | - |
36/ASC/oc | 9 | 9 | 5 | 6 | - |
(*) - диаметр зоны задержки роста; (-) - отсутствие зоны задержки роста. |
Как следует из таблицы 6, антибактериальная активность фракций штамма В-10531 различается в зависимости от среды культивирования как по спектру, так и по диаметру зоны задержки роста исследуемых тест-бактерий.
Список литературы
1. Shoji, J., Sakazaki, R., Wakisaka, Y., Koizumi, K., Mayama, M., Matsuura, S. and K.Matsumoto. J. Antibiotics. 1976, V.29, No.4, p.390-393.
2. Fudaba, Y., Fukuda, Y., Yamamoto, H., Ohdan, H., Shintaku, S., Shibata, S., Miyata, Y., Marubayashi, S, Asahara, Т., and Dohi, K. 1998 - Transplant. Proc., 1998, V.30, No.7, p.3582-3583.
3. Tanabe, K., Takahashi, K., Nemoto, K., Okada, M., Yasuo, M., Hayasaka, Y., Toma, H., and Ota, K.J.Urol. Vol., 1994, V.152, No.2, part 1, p.562-566.
4. Gerard J., Haden P., Kelly M., Andersen R. J. Nat. Prod., 1999, V.62 (1), p.80-85.
5. Патент РФ № 2229520.
6. Huynh H., Le Hong Due, Cutting S. FEMS Microbiology Rev., 2005, V.29, p.813-835.
7. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Ганушкина Л.А., Азизбекян P.P. Биотехнология, 1995, т.3-4, с.11-16.
8. Орлова М.В.. Smirnova Т.А., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y., Азизбекян P.P. Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, N.7, p.2723-2728.
9. Aronson A., Dunn P. U.S. Patent No.5055293, 1993.
10. Ruiu L., Satta A., Floris I. Environ Entomol., 2008, V.37 (2), p.505-509.
11. Патент РФ 2242125.
12. Branly K., Atkins R. U.S. Patent No.6232270. 2001.
13. O Donnell В. Patent U.S. No.5455028, 1995.
14. Ren Z.Z., Zheng Y., Sun M., Liu J.Z., Wang Y.J. Wei Sheng Wu Xue Bao., 2007, V.47 (6), p.997-1001.
15. O'Donnell В. Patent U.S. No.5702701. 1997.
16. Qiuhong N.. Xiaowei H., Baoyu Т., Jinkui Y., Jiang L., Lm Z., Keqin Z.. Appl Microbiol Biotechnol., 2007, V.74(2), p.372-380.
17. Chang S.F., Wan Y.L., Cui J.Y., Wang B.S. Acta Entomol. Sin., 1984, V.26, p.419-425.
18. Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. Доклады Академии наук, 2007, т.241, № 2, с.262-266.
19. Патент РФ 2323968.
20. Shida O., Takagi H., Kadowaki K., Komagata K. 1996. Proposal for new genera, Brevibaciillus gen.nov. and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Sysyt.Bacteriol., 45: 939-946.
21. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, T.35 (2), 171-205.
22. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, T.35 (2), 171-205.
23. Воншак А. Микроводоросли: технология лабораторного культивирования биомассы в установках на открытом воздухе. В кн. Фотосинтез и биопродуктивностъ: методы определения. М., Агропромиздат. 1989. С.310-328.
24. Harris E.H. 1989. The Chlamydomonas Sourcebook: A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. Academic Press, San Diego, p.780.
25. Nakagawa, M., Y. Takamura, and 0. Yagi. 1987. Isolation of the slime from a cyano-bacterium, Microcystis aeruginosa K-3A. Agric. Biol. Chem. 51:329-337.
26. Guillard R.R.L., Ryther J.H. // Can. J. Microbiol. 1962. V.8. 923-931.
Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них