способ выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ выявления специфических антител к инфекционному ринотрахеиту, парагриппу-3, вирусной диарее - болезни слизистых, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций крупного рогатого скота, включающий сенсибилизацию ячеек микропанели соответствующими антигенами, параллельное внесение в них проб с тест-сывороткой и исследуемых сывороток, инкубацию, добавление эталонного антивидового конъюгата, измерение оптической плотности раствора и определение титра антител по зависимости показателя оптической плотности от титра антител, отличающийся тем, что специфические антитела к антигенам вирусов диагностируются одномоментно в одном разведении, для чего определяют оптимальное разведение сывороток, позитивно-негативный порог реакции путем тестирования заведомо отрицательных в базовых реакциях сывороток ко всем пяти инфекциям и прибавления к полученным значениям оптических плотностей трех значений стандартного отклонения для расчета верхней границы позитивно-негативного порога и прибавления двух значений стандартного отклонения для расчета нижней границы позитивно-негативного порога, допустимые величины оптических плотностей отрицательных и положительных сывороток, диагностическую чувствительность по отношению количества положительных сывороток крови к сумме истинно положительных сывороток и ложно отрицательных сывороток, специфичность реакции по отношению количества отрицательных сывороток крови к сумме истинно отрицательных сывороток и ложно-положительных сывороток; результаты анализа следует учитывать, если значения оптической плотности отрицательных сывороток не превышают 0,150 оптических единиц, а значения положительного контроля - не менее 0,439 оптических единиц, а среднее значение оптических плотностей, суммированное с утроенным и удвоенным значениями стандартного отклонения, составляет 0,261 и 0,216 оптических единиц соответственно, а диагностическая чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа составляет 89% и 93% соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано как для широкомасштабных, так и для выборочных исследований сывороток крови, молока, молозива животных на наличие специфических антител к возбудителям вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота.

В основу комплексной тест-системы ИФА для одновременного обнаружения специфических антител в сыворотках крови к антигенам респираторных вирусов заложены результаты изготовления тест-панелей для выявления антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиального (PC), аденовирусной инфекции (АВИ) и вирусной диареи-болезни слизистой (ВД-БС) крупного рогатого скота (КРС) в отдельности.

С помощью разработанной тест-системы испытано 126 сывороток крови КРС разных возрастных групп, полученных из различных хозяйств и регионов РФ, а также пробы молока и молозива. Полученные данные показали, что при комплексном анализе сывороток крови вакцинированных животных высокие показатели оптической плотности отмечались в гомологичной системе антиген-антитело.

Клинико-эпизоотологические исследования в хозяйствах, неблагополучных по массовым респираторным болезням крупного рогатого скота, показали, что во всех случаях, характер течения и симптоматика болезней телят не позволяют достоверно дифференцировать их этиологическую принадлежность. Поэтому очень важна лабораторная диагностика. Лабораторная диагностика в этих случаях осуществлялась путем изоляции штаммов в культуре клеток, исследовании парных проб сывороток в реакции нейтрализации (РН), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и ИФА.

Вирусологическими исследованиями диагностировались ИРТ, ВД-БС, PC, АВИ или смешанное вирусное заболевание с участием ПГ-3, респираторно-синцитиального вируса.

Исследования показали широкое распространение ИРТ и ВД-БС. В 80% хозяйств выявлены антитела в диагностических титрах к одному или обоим возбудителям. Титр специфических антител в РН колебался от 1:4 до 1:12.8.

Анализ полученных данных свидетельствовал о значительном количестве серопозитивных животных. Следует отметить, что в 80% случаев были выявлены антитела к вирусу ВД-БС КРС в исследуемом материале с одновременным обнаружением антител к другим вирусным антигенам в различных сочетаниях. Так, в 27% пробах сывороток выявлялись антитела только к вирусу ВД-БС КРС. Вируснейтрализующие антитела к антигенам ИРТ и ВД-БС были найдены у 33% обследованных животных. Только 7% проб содержали антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3 и ВД-БС одновременно, в 10% - только к вирусу ИРТ, 7% - только к вирусу PC, 14% -к ПГ-3.

Противовирусные антитела выявлялись как у клинически здоровых животных, так и у животных с различной патологией. Наличие противовирусных антител в сыворотках крови, молоке и молозиве у невакцинированного ранее крупного рогатого скота свидетельствовал о контакте особей с вирусными антигенами и формировании постинфекционного иммунитета, а после вакцинации - о напряженности поствакцинального иммунитета у привитых животных.

В тех случаях, когда в одном стаде циркулируют несколько возбудителей, применение моновакцин, как правило, не обеспечивало положительной динамики заболеваний.

Специфическая профилактика указанных выше заболеваний осложняется тем, что восприимчивые к ним в раннем возрасте телята имеют недостаточно сформированную иммунную систему. Иммунитет у них в этот период обеспечивается антителами, полученными с молозивом матерей. Использование вакцин для активной иммунизации телят в раннем возрасте, вероятно, неоправданно, так как в крови циркулируют защитные материнские антитела. Более того, Fremont G. (17) при проведении такой вакцинации отмечал увеличение заболеваемости и даже смертности телят за счет торможения синтеза собственных секреторных антител, пассивно приобретенных с молозивом материнскими антителами, по принципу обратной связи. Установлено, если у матерей титр антител в РНГА превышает 1:256, то у детенышей концентрация колостральных антител будет не меньше 1:40 и воспрепятствует нормальному формированию поствакцинального иммунитета. С другой стороны, материнские антитела, защищая от вирулентного вируса, также могут инактивировать и вакцинный вирус и поэтому воспрепятствовать созданию напряженного поствакцинального иммунитета. Следовательно, телят от таких матерей нельзя прививать в такой период. Наиболее оптимальной в данной ситуации была бы более поздняя вакцинация, когда антитела у них полностью исчезнут. Наилучшим способом решения данной проблемы является определение уровня антител с помощью ИФА, по результатам которого можно скорректировать сроки вакцинации.

Но проблема не исчерпывается блокирующим влиянием колостральных антител.

В стратегии профилактики болезней телят, как правило, отдают предпочтение формированию у них колострального иммунитета за счет получения молозива иммунизированных матерей. Следует отметить, чтобы избежать возможности гипериммунизации взрослых коров в случае занесения на ферму вируса, необходима еще одна корректировка специфических мероприятий - внедрить в практику выборочную проверку наличия противовирусных антител перед вакцинацией и после вакцинации путем определения напряженности поствакцинального иммунитета (по РНГА или ИФА). Формирование поствакцинального иммунитета может быть также нарушено из-за угнетения иммунокомпетентной системы при значительном распространении на ферме инфекций, свойственных ИРТ и особенно ВД-БС, обладающих выраженной иммуносупрессией (7, 8, 9, 12, 13, 15, 22).

В условиях, когда необходимо обеспечить уровень защиты, телят раннего возраста часто прививают целым рядом вакцин, в состав которых входят порой антигены возбудителей, имеющих второстепенное значение (9).

Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод, что разработанная нами тест-система позволяет делать предварительные прогнозы об инфицированности стада. Для подтверждения прогноза, конечно, потребуются дополнительные методы исследования (изоляция вируса в культуре клеток, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления генома вируса и т.д.). В результате таких исследований можно научно обосновывать выбор мер по оздоровлению хозяйств (5, 6, 7, 11, 12, 13, 17, 18).

Итак, использование в практической деятельности серологических исследований сыворотки крови животных методом ИФА позволит более рационально и надежно организовывать работу по профилактике и оздоровлению стад от инфекционных заболеваний.

Для исследования сывороток крови по одному разведению необходимо устанавливать оптимальное рабочее разведение сывороток, позитивно-негативный порог реакции, допустимые величины оптических плотностей отрицательных и положительных сывороток, а также определить чувствительность и специфичность метода ИФА по отношению к базовым реакциям.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Установление оптимального рабочего разведения сывороток с помощью отношения значений оптической плотности испытуемой сыворотки к значению оптической плотности положительного контроля (S/P).

С целью определения оптимального рабочего разведения сывороток вычисляли зависимость титра антител lg(T), определенного методом последовательных разведений сывороток, от значений lg(S/P), подсчитанных на 100 сыворотках для разведений 1:100, 1:200, 1:400 и 1:800. Для каждого разведения была построена отдельная линия регрессии. Результаты регрессионного анализа по всему массиву данных представлены в таблице 1.

Таблица 1
Коэффициенты корреляции и стандартное отклонение для отдельных разведений сывороток.
Разведения	Коэффициент	Стандартная
сывороток	корреляции	ошибка
1:100	0,9026	0,064092
1:200	0,9045	0,067234
1:400	0,9224	0,062685
1:800	0,9139	0,068133

Данные статистической обработки показывают, что все представленные разведения имеют сильную корреляционную связь, однако оптимальное значение коэффициента корреляции (R=0,9224) и стандартной ошибки имеет разведение 1:400. Это разведение было принято в качестве рабочего.

Используя математически выраженную линейную зависимость для lg Т и lg S/P, имеющую вид lg Т=A+B×lg S/P, (А и В - коэффициенты реакции, установленные опытным путем) было выведено уравнение линейной регрессии для выбранного разведения сыворотки 1:400.

Коэффициенты уравнения, соответствующие рабочему разведению, использовали для расчета титра антител к респираторным вирусам при тестировании сывороток в одном разведении. Уравнение для расчета регрессии имело следующий вид:

lg T=3,649+1,5237×lgS/P, где S/P=(OП-NC_x)/(PCx-NC _x), где ОП - это измеренная оптическая плотность образца, а РСх и NC_х- оптические плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток.

В случае перехода к другим сериям контрольных сывороток параметры регрессионного уравнения должны быть определены заново.

Полученное уравнение линейной регрессии достоверно для определенных значений отрицательного и положительного контролей. Для определения допустимых величин оптической плотности для контрольных и отрицательных сывороток были проанализированы соответствующие значения оптической плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток (n=20), исследованных в разведении 1:400. Для получения достоверных результатов реакции значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки не должно превышать 0,150 оптических единиц (о.п.), а значение положительного контроля должно быть не меньше 0,439 о.п. Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться недостоверными и пробы должны быть исследованы повторно.

Пример 2. Определение позитивно-негативного контроля значений величины титра (Т) для качественной характеристики результатов ИФА.

При определении качественной характеристики исследуемых сывороток крови по рассчитанному титру антител в ИФА за основу были взяты результаты базовых реакций.

Для объективной оценки иммунного ответа необходимо было установить позитивно-негативный порог (ПНП) реакции.

Тестировали по 119 заведомо отрицательных в реакции нейтрализации, в РИГА ко всем пяти респираторным вирусным инфекциям. ПНП определяли, рассчитывая средние значения оптической плотности отрицательных сывороток для разведения 1:400, прибавляя три значения стандартного отклонения (для расчета верхней границы ПНП) и два значения стандартного отклонения (для расчета нижней границы ПНП).

Среднее значение оптической плотности отрицательных сывороток (0,126 о.е.), суммированное с утроенным и удвоенным значениями стандартного отклонения, составило 0,261 о.е. и 0,216 о.е.

Для данных значений вычисляли S/P - отношение, которое приняли в качестве критерия для разграничения различных типов реакции. Было установлено, что сыворотки следует считать отрицательными, если отношение S/P<0,2, или положительные, если S/P>0,3. Существующий между ними интервал значений соответствовал сомнительным результатам.

Пример 3. Определение допустимых величин оптической плотности (ОП) контрольных сывороток.

Для получения достоверных результатов при тестировании сывороток по одному разведению необходимо было определить допустимые величины оптической плотности контрольных сывороток. Для исследования брали 17 повторностей положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении 1:400. Получили, что значения оптической плотности контрольных сывороток в диапазоне от 0,949 до 1,309 для положительного контроля и от 0,102 до 0,142 для отрицательного контроля являются оптимальными. (Табл.2).

Таблица 2 Допустимые значения ОП контрольных сывороток
показатели	Положительный контроль (Р)	Отрицательный Контроль (N)	Разница между контролями (P-N)
Среднее значение стандартного отклонения±&	1,129±0,18	0,122±0,02	1,006±0,135
Доверительный интервал	0,949-1,309	0,102-0,142	0,871-1,141

Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными, и пробы должны быть исследованы заново.

Пример 4. Оценка воспроизводимости результатов серологической реакции.

Для оценки воспроизводимости результатов методом одного разведения в ИФА определяли значение S/P отношения по формуле: (ОП _пробы- ОПК^-)/(ОПК⁺-ОПК^- ), где ОП_пробы - оптическая плотность исследуемой сыворотки;

ОПК⁺ - оптическая плотность контрольной положительной сыворотки;

ОПК^- - оптическая плотность контрольной отрицательной сыворотки.

Для определения воспроизводимости результатов ИФА контрольную положительную сыворотку в разведении 1:400 вносили в лунки планшет и после проведения реакции сравнивали оптическую плотность в лунках. Коэффициент вариации (с) вычисляли по формулам:

с=&/х_ср и &=[x_max-x _min]/k, где & - стандартное отклонение ОП, х_ср - среднее арифметическое ОП, к- количество определений, и он составил 3,5%, что говорит о малом рассеивании вариант и указывает на хорошую воспроизводимость результатов.

Пример 5. Диагностическую чувствительность и специфичность вычисляли по формулам, рекомендованным Международным Эпизоотическим Бюро.

Диагностическую чувствительность и специфичность метода определяли по отношению к реакциям нейтрализации и РНГА. Диагностическую чувствительность метода (ДЧ) определяли по отношению количества положительных сывороток крови (П) к сумме истинно положительных сывороток (ИП) и ложно-отрицательных сывороток (ЛО), полученных от исследуемых иммунных животных (ИП+ЛО):

ДЧ=[П/(ИП+ЛО)] 100%.

Диагностическую специфичность метода (ДС) определяли по отношению количества отрицательных сывороток крови (О) к сумме истинно отрицательных сывороток (ИО) и ложно-положительных сывороток (ЛП), полученных от исследуемых иммунных животных (ИО+ЛП):

ДС=[О/(ИО+ЛП)] 100%.

Коэффициент вариации (с) вычисляли по формулам: с=&/х_ср и &=[х_mах-х_min ]/к, где & - стандартное отклонение ОП, х_ср - среднее арифметическое ОП, к - количество определений.

Таблица 3 Результаты ИФА, РН и РНГА для вычисления диагностической чувствительности и специфичности
Результаты ИФА	Результаты РН, РНГА
Качественная характеристика	Количество проб	положительные	отрицательные
положительные	156	151	5
отрицательные	90	19	71
Всего:	246	170	76

Диагностическая чувствительность метода составила 89%, а диагностическая специфичность 93%.

Аналитическую специфичность тест-системы ИФА устанавливали по перекрестной реакции с гетерологичными сыворотками. Полученные данные свидетельствуют, что тест-система ИФА для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота является специфичной, так как дифференцирует антитела, специфичные к антигенам ИРТ; ВД-БС, АВИ, PC и ПГ-3.

Источники информации

1. Ашмарин И.П., Воробьев В.В.// Статистические методы в микробиологических исследованиях, 1962, Медгиз, Л.

2. Амиров А.Х. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи крупного рогатого скота. Автореф. Дис. Канд. вет. наук, Смоленск, 2004. - С.

3. Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Гараева М.М., Алипер Т.И. Структурные и функциональные особенности иммуноглобулинов птиц//Ветеринария. - 2007. - № 11. - С.18-22

4. Кочиш Т.Ю. Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе. Автореф. дис канд. биол. наук. - Щ., 2004.

5. Мищенко В.А. Проблема респираторных смешанных инфекций молодняка КРС // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Мат. Междунар. научно-практ. конф., 30-31 октября 2003 г. - Владимир. - С.72-77.

6. Мищенко В.А., Бабкин В.Ф., Базаров М.А. Иммуномониторинг вирусных инфекций. Современные аспекты ветеринарной патологии животных: Материалы конференции. Владимир, 23-25 ноября 1998. - С.31-33.

7. Слугин И.С. Совершенствование профилактики инфекционных болезней пушных зверей // Ветеринария 2003. - № 7. - С.3-6.

8. RU 2306567 G01N 33/535. Способ дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

9. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. //Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП. - 1998. - С.285.

10. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Справочник Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. - М.:Агропромиздат, 1986. 351 С.

11. Технические условия 19.10.97 - 89 «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89.

12. Федоров Ю.Н. Стратегия и принципы иммунопрофилактики болезней новорожденных телят // Материалы научно-практической конф. «Состояние и перспективы внедрения достижений ветеринарной науки и практики в сельскохозяйственное производство». 3-4 июля 2002. Вологда. - С.41-43.

13. Усов С.М. Иммунологические аспекты терапии и профилактики инфекций ринотрахеита и вирусной диареи молодняка крупного рогатого скота. Автореф. Дис. канд. вет. наук, Минск, 1998.

14. Юров К.П., Шуляк А.Ф., Алексеенкова С.В., Юров Г.К., Ткачев И.К., Осмаев А.И. Этиология, диагностика и профилактика массовых респираторных болезней телят//Мат. междунар. научно-практ. Конф «Акт. пробл. инфекц. пат. и иммунологии животных». - 2006, Москва 16-17 мая - С.128-132.