Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, и средство, обладающее противоопухолевой активностью

Классы МПК:C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
A61K36/07 Basidiomycota, например Cryptococcus
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Краснопольская Лариса Михайловна (RU),
Автономова Анастасия Витальевна (RU),
Бухман Владимир Михайлович (RU),
Леонтьева Мария Ильинична (RU),
Соболева Наталия Юрьевна (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-12-25
публикация патента:

Группа изобретений относится к биотехнологии. Способ включает приготовление посевного мицелия базидиомицетов, приготовление производственной питательной среды и засев производственной питательной среды, содержащей источники углевода, азота, минеральные соли, приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим получением погружной культуры. Приготовление посевного мицелия осуществляют на стерильной питательной среде, содержащей глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия, сульфат магния и арахидоновую кислоту. Выращивание посевного мицелия осуществляют при температуре 22-29°С в течение 2-6 суток при аэрации с последующей его гомогенизацией. Полученное противоопухолевое средство из погруженной культуры базидиомицета является эффективным, а длительность процесса культивирования сокращается с 2-3 недель до одной, увеличивается выход мицелия за счет разработки состава производственной питательной среды, условий культивирования, а также за счет подбора состава среды для получения посевного мицелия. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 6 табл.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована для получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, путем культивирования базидиомицетов в погруженной культуре.

Известно, что метаболиты многих видов базидиомицетов обладают лечебными свойствами, в частности противоопухолевым действием, включающим прямое ингибирующее действие на пролиферацию и рост клеток опухоли, повышение противоопухолевого иммунитета, антиканцерогенное действие, а также антиоксидантным, противовирусным, гепатопротекторным и иммуномоделирующим действием. В последние годы в России, США, Китае, Японии, Корее ведутся работы по получению лекарственных средств на основе базидиомицетов. Создание новых лекарственных препаратов сдерживается сложной дорогостоящей технологией выращивания базидиомицетов и выделения из них веществ, обладающих стабильными биологическими свойствами, в частности противоопухолевыми.

Образование базидиомицетами ценных для фармакологии веществ зависит как от используемых видов базидиомицетов, так и от технологии их культивирования (приготовление посевного материала, условия культивирования), а также процессов выделения метаболитов.

Для лечения онкологических заболеваний используют химические вещества, такие как цитостатики, проявляющие высокую токсичность, что ограничивает их применение.

Токсичность противоопухолевых средств, полученных из съедобных или несъедобных (неядовитых) базидиомицетов, по литературным данным или отсутствует, или очень низкая (Chang & But, 1986, Su et al., 1987).

В настоящее время большое внимание уделяется разработке технологии культивирования базидиомицетов с целью получения максимального количества мицелия при культивировании в возможно короткий срок и методам выделения противоопухолевых средств.

Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, из мицелия гриба Ganoderma lucidum. Мицелий получают путем культивирования Ganoderma lucidum в погруженной культуре на питательной среде, содержащей 50 г глюкозы, 20 г пептона, 0,87 г дигидрофосфата калия, 0,5 г сульфата магния, 10 г хлорида железа (II), 7 г хлорида марганца, 10 г сульфата цинка, 4 мг хлорида цинка на 1 л воды, рН среды 5,5.

Предварительно готовят посевной мицелий. Для этого указанный гриб культивируют при 180 об/мин, 25°С в течение 10 суток. Полученную культуру пересевают в свежую питательную среду в количестве 5% и вновь культивируют в течение 10 суток. Мицелий отделяют от культуральной жидкости и из него выделяют протеогликан G009 - средство, обладающее противоопухолевой активностью, очищают его и определяют противоопухолевую активность в отношении саркомы 180, привитой самцам мышей (RU 2082755 С1, 19.08.1997).

Недостатком описанного способа является длительный процесс приготовления посевного мицелия (до 20 суток), продолжительный процесс культивирования гриба (7 суток) и сложный процесс выделения средства, обладающего противоопухолевой активностью.

Известен способ получения препарата, влияющего на тканевый обмен, в том числе обладающего противоопухолевой активностью, предусматривающий глубинное культивирование гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ-F 819) в колбах на среде, содержащей пивное сусло 0,65° Б, при 26-28°С на роторной качалке с 200 об/мин, длительность процесса до 24 суток, с последующим отделением мицелия от нативного раствора центрифугированием и выделением биологически активных веществ из мицелия экстракцией этанолом при нейтральном или кислом значениях рН. Экстракты упаривают в вакууме до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в водном растворе этанола. Полученные фракции используют для биологических испытаний. Противоопухолевую активность полученного средства исследуют на мышах с трансплантированным асцитным раком молочной железы при однократном введении химических противоопухолевых средств - цитостатиков. Препарат, полученный вышеописанным способом, вводят в дозе 100 мг/кг через 2 часа после трансплантации опухоли, а затем в той же дозе в течение 9 суток ежедневно. Средняя продолжительность жизни животных составила 30,8±0,8 суток, а в контроле - 18,0±0,8 суток, т.е. на 71% больше, чем в контроле (RU 2192873 С1, 20.11.2002).

Недостатком описанного способа является длительность процесса культивирования гриба, а также проведение исследования противоопухолевой активности на фоне цитостатиков - токсичных веществ, в связи с чем невозможно судить о самостоятельной противоопухолевой эффективности полученных средств.

Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, из мицелия базидиомицетов, выбранных из группы Ganoderma lucidum, Hypsizygus ulmarius, Kuhneromyces mutabilis, Omphalotus olearis, Panus conchatus, Piptoporus betulinus, Pleurotus eryngii, Trametes zonata.

Базидиомицеты вначале выращивают на агаровой среде при 27°С, а затем пересевают на жидкую среду и культивируют в погруженной культуре при 27°С, 180 об/мин в течение 2-3 недель. Среда содержит 2% глюкозы, 0,1% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,1% дигидрофосфата калия, 0,1% сульфата магния и микроэлементы (сульфат железа (II), сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат меди). Из погруженной культуры выделяют мицелий, высушивают и из сухого мицелия экстрагируют средство, обладающее противоопухолевой активностью. В качестве экстрагента используют метанол, этанол, ацетонитрил, этилацетат, хлороформ, дихлорметан или их смеси (US 20060057157, 16.03.2006).

Недостатком описанного способа получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, является длительное культивирование базидиомицетов (2-3 недели), использование для получения противоопухолевого средства только отделенного от культуральной жидкости и высушенного мицелия и низкая эффективность полученного средства в системе in vitro. В системе in vivo полученное средство испытано не было.

Задачей, на решение которой направлена группа изобретений, является сокращение длительности процесса культивирования базидиомицетов, повышение выхода мицелия и получение более эффективного противоопухолевого средства.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, включающем приготовление посевного мицелия базидиомицета, приготовление стерильной производственной питательной среды, засев производственной питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим получением погруженной культуры, согласно изобретению, приготовление посевного мицелия осуществляют на стерильной жидкой питательной среде, содержащей (г/л воды): глюкозу - 18,0-22,0, соевую муку - 8,0-12,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,4 и арахидоновую кислоту - 1,0-5,0×10-5, выращивание посевного материала проводят при температуре 22-29° С в течение 2-6 суток при аэрации, при этом готовый посевной мицелий гомогенизируют.

Соевая мука может быть использована как генетически модифицированных, так и не модифицированных сортов сои.

Гомогенизацию готового посевного материала можно осуществлять как перед засевом производственной питательной среды в гомогенизаторе в течение 2-5 минут, так и в процессе засева непосредственно в биореакторе при включенной мешалке на 300-500 об/мин в течение 0,5-6 минут.

Для культивирования следует использовать базидиомицет, выбранный из группы Armillaria mellea (Fr.) Karst., Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Singer, Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers., Hypsizygus marmareus (Peck) H.E.Bigelow, Hypsizygus tessulatus (Bulliard:Fr.) Singer, Lentinus edodes (Berk.) Singer, Lyophyllum shimeji (Kawam.) Hongo, Pleurotus djamor (Rumphius ex Fries) Boedjin, Pleurotus ostreatus (Jacg.:Fr.) Kumm.

При культивировании базидиомицета Armillaria mellea в производственную питательную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 15,0-18,0, соевую муку - 18,0-20,0, дигидрофосфат калия - 0.5-2,5, сульфат магния - 0,05-0,26, культивирование осуществлять при температуре 24-28° С в течение 4,5-5,5 суток.

При культивировании базидиомицета Flammulina velutipes в производственную питательную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 19.0-27,0, соевую муку в количестве 19,0-27,0, дигидрофосфат калия - 1,4-3,0, сульфат магния - 0,14-0,30, культивирование осуществлять при температуре 20-28° С в течение 5,5-6,5 суток.

При культивировании базидиомицета Hericium erinaceus в производственную питательную среду рекомендуется вводить (г/л воды): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 10.0-27,0 и 20,0-25,0, дигидрофосфат калия вводить в количестве 2.0-3,3, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-32° С в течение 5,5-6,5 суток. В указанную производственную среду для культивирования Hericium erinaceus можно дополнительно вводить мелассу в количестве 1-40 г/л среды.

При культивировании базидиомицета Hypsizygus marmareus в производственную питательную среду целесообразно вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 20,0-24,0, соевую муку в количестве 16,0-22,0, дигидрофосфат калия - 1,5-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-31°С в течение 5,5-6,5 суток.

При культивировании базидиомицета Hypsizygus tessulatus в производственную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 18.0-25,0, соевую муку - 20,0-28,0, дигидрофосфат калия - 1,6-2,6, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-33° С в течение 6,5-7,5 суток.

При культивировании базидиомицета Lentinus edodes в производственную питательную среду целесообразно вводить (г/л воды): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 12,0-16,0 и 18,0-24,0, дополнительно вводить источник углерода в виде глюкозы в количестве 8-12, вводить дигидрофосфат калия в количестве 1,3-2,6, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-30°С в течение 5,5-6,5 суток.

При культивировании базидиомицета Lyophyllum shimeji в производственную питательную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 16,0-22,0, соевую муку - 18,0-25,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-34°С в течение 3,5-4,5 суток.

При культивировании базидиомицета Pleurotus djamor в производственную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 15,0-20,0, соевую муку - 15,0-21,0, дигидрофосфат калия - 2.0-3,3, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 26-35°С в течение 2,5-3,5 суток.

При культивировании базидиомицета Pleurotus ostreatus в производственную питательную среду целесообразно вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 14,0-20,0, соевую муку - 11,0-19,0, дигидрофосфат калия - 2.0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-28°С в течение 2,5-3,5 суток.

В качестве растительного масла в производственных питательных средах для культивирования Armillaria mellea, Flammulina velutipes, Hericium erinaceus, Hypsizygus marmareus, Hypsizygus tessulatus, Lentinus edodes, Lyophyllum shimeji, Pleurotus djamor, Pleurotus ostreatus могут быть использованы подсолнечное, оливковое, соевое, льняное, арахисовое масла или их смеси.

Введение в состав производственных питательных сред растительного масла в заявленном количестве способствует не только сокращению длительности процесса культивирования и повышению выхода мицелия, но и снижает процесс пенообразования в процессе культивирования.

После культивирования базидиомицета полученную погруженную культуру следует подвергать сублимационной сушке, затем сухой мицелий измельчать и использовать в качестве противоопухолевого средства.

После культивирования базидиомицета полученную погруженную культуру можно автоклавировать при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-3 часов, отделять жидкую фазу фильтрованием и использовать в качестве противоопухолевого средства.

Для получения противоопухолевого средства после культивирования базидиомицета можно отделять мицелий из погруженной культуры фильтрованием, экстрагировать его дистиллированной водой в соотношении 90-360 г/л воды в процессе автоклавирования при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, отделенный водный экстракт использовать в качестве целевого средства.

После культивирования из погруженной культуры целесообразно отделять мицелий базидиомицета и проводить экстракцию этанолом в соотношении 90-360 г/100 мл экстрагента в течение 0,5-1,5 часов при перемешивании, полученный этанольный экстракт отделять от остатков мицелия, упаривать до сухого остатка на испарителе, а остаток мицелия заливать дистиллированной водой в соотношении 90-360 г/л, автоклавировать при 1, 2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, полученный водный экстракт отделять и объединять с сухим остатком этанольного экстракта и полученную смесь использовать в качестве противоопухолевого средства.

После культивирования можно отделять из погруженной культуры мицелий базидиомицета, высушивать его при температуре 35-80°С, измельчать и использовать в качестве противоопухолевого средства.

Сухой измельченный мицелий базидиомицета следует подвергать экстрагированию кипящей дистиллированной водой в соотношении 18-72 г/л при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, затем водный экстракт отделять от остатков мицелия и использовать в качестве противоопухолевого средства.

Для увеличения срока хранения без снижения биологической активности водный экстракт мицелия базидиомицета может быть заморожен при температуре -18-70° С. Перед использованием в качестве противоопухолевого средства водный экстракт следует разморозить.

С той же целью водный экстракт мицелия базидиомицета может быть высушен на распылительной сушилке. Возможно использование как непосредственно сухого экстракта, так и его раствора в дистиллированной воде.

В водный экстракт мицелия базидиомицета можно добавлять 2-6 объемов этанола, выпавший осадок отделять, высушивать и использовать в качестве противоопухолевого средства.

Как следует из вышесказанного, противоопухолевое средство может быть использовано как в сухом порошкообразном виде, так и в жидком. К полученному противоопухолевому средству могут быть добавлены различные фармацевтические добавки, такие как витамины, микроэлементы, антиоксиданты, совместимые противоопухолевые средства.

Противоопухолевое средство может быть изготовлено в виде таблеток, капсул, напитка и может быть использовано как перорально, так и в виде микроклизм.

Дозировка противоопухолевого средства зависит от заболевания, возраста пациента, его веса, состава средства. В пересчете на содержание полисахаридов предпочтительная дозировка для лабораторных животных может быть 1-3 мг полисахаридов на кг массы, для человека - 0,08-0,25 мг/кг.

Технический результат заявленной группы изобретений заключается в увеличении выхода мицелия за счет разработки состава производственной среды, условий культивирования, подбора состава среды для получения посевного материала, в сокращении длительности процесса культивирования базидиомицета с 2-3 недель до 7,5 суток. Включение в состав производственной среды растительного масла не только повышает выход биомассы базидиомицета, но и препятствует пенообразованию среды в процессе культивирования базидиомицета. В совокупности разработанные способ культивирования базидиомицета и способ выделения противоопухолевого средства позволили получить эффективное средство, тормозящее рост опухоли в опытах in vivo до 94%.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.

Пример 1. Приготовление посевного мицелия базидиомицетов.

Готовили стерильные жидкие питательные среды, состав которых представлен в таблице 1, и засевали мицелием базидиомицетов, выращенных на агаровой питательной среде.

Выращивание посевного мицелия осуществляли на ротационной качалке при температуре 22-29°С, скорости вращения качалки 180-220 об/мин в течение 2-6 суток. Условия культивирования базидиомицетов приведены в таблице 2.

Приготовленный посевной мицелий Hericium erinaceus штамм He-4, Lentinus edodes штамм Le-14, Pleurotus ostreatus штамм 447 гомогенизировали в процессе засева производственной среды в биореакторе при включенной мешалке на 500 об/мин в течение 0,5 минут.

Таблица 1.
Составы сред для получения посевного мицелия базидиомицетов.
Вид базидиомицета Источники питания, г/л воды
ГлюкозаСоевая мука КН2РO 4MgSO 4Арахидоновая кислота
A.mellea18 12 2,40,20 1,0×10-5
F.velutipes22 8 2,50,24 3,0×10-5
Н.erinaceus19 10 3,00,4 5,0×10-5
Н.marmareus21 9 2,40,25 2,0×10-5
Н.tessulatus22 8,5 2,00,4 4,5×10-5
L.edodes20 9 3,00,3 4,0×10-5
L.shimeji21 9,5 2,50,24 3,5×10-5
P.djamor19 10 2,00,3 2,0×10-5
P.ostreatus22 9 2,50,4 1,0×10-5

Таблица 2.
Условия выращивания посевного мицелия базидиомицетов.
Вид базидиомицета Параметры культивирования
Скорость вращения мешалки, об/мин Температура, °С Длительность процесса, сут
A.mellea220 25 4
F.velutipes 180 226
H.erinaceus 20028 6
Н.marmareus 220 253
Н.tessulatus 22025 3
L.edodes 220 256
L.shimeji 20028 3
P.djamor 200 292
P.ostreatus 22025 2

Пример 2. Погруженное культивирование базидиомицетов.

Для погруженного культивирования базидиомицетов готовили производственные среды, состав которых представлен в таблице 3. Производственные среды стерилизовали при 1,2 атм в течение 30 мин, охлаждали и засевали посевным мицелием базидиомицетов, полученным по примеру 1.

Приготовленный посевной мицелий Armillaria mellea штамм Am-4, Flammulina velutipes штамм Fv-7, Hypsizygus marmareus штамм Hm-1, Hypsizygus tessulatus штамм Ht-1, Lyophyllum shimeji штамм Ls-2, Pleurotus djamor штамм Pd-3 гомогенизировали в гомогенизаторе в течение 4 минут перед засевом производственной среды, посевной мицелий Hericium erinaceus, Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus гомогенизировали в процессе засева производственной среды в биореакторе при включенной мешалке на 500 об/мин в течение 0,5 минут.

Таблица 3.
Составы сред для погруженного культивирования базидиомицетов.
Вид Источники питания, г/л воды
Источники углерода Источники азота Минеральные соли
масло раст.глюкоза меласса соевая мукаКН 2РO4 MgSO4
A.mellea17 - -20 0,50,05
F.velutipes 27 -- 272,4 0,24
H.erinaceus 10 -30 222,8 0,28
H.erinaceus 27 -- 253,3 0,30
H.marmareus 22 -- 192,0 0,2
H.tessulatus 24 -- 281,6 0,24
L.edodes 15 8- 211,5 0,24
L.edodes 12 11- 242,6 0,3
L.shimeji 20 -- 232,6 0,26
P.djamor 18 -- 182,6 0,26
P.ostreatus 15 -- 112,4 0,24

Культивирование базидиомицетов Armillaria mellea, Flammulina velutipes, Hypsizygus marmareus, Hypsizygus tessulatus, Lyophyllum shimeji, Pleurotus djamor осуществляли в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин. Базидиомицеты Hericium erinaceus, Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus выращивали в биореакторах с постоянно работающей мешалкой (200 об/мин) и подачей воздуха 1,5 об./об. в минуту.

Температурный режим и длительность процессов погруженного культивирования, а также выход воздушно-сухой биомассы (влажность 5-6%) представлены в таблице 4. Контроль чистоты культур осуществляли с помощью световой микроскопии. Фиксировали наличие на мицелии грибов пряжек, являющихся специфической морфологической структурой базидиомицетов, и отсутствие посторонней мико- и микробиоты.

Таблица 4.
Температурный режим, длительность процессов погруженного культивирования и выход воздушно-сухой биомассы базидиомицетов.
Вид Температура культивирования, 0 С Длительность процесса культивирования, сутки Выход воздушно-сухой биомассы, г/л
A.mellea24-26 4,5 20-22
F.velutipes20-22 6,0 36-40
H.erinaceus25-27 6,5 24-25
Н.marmareus24-26 5,5 27-29
Н.tessulatus24-26 7,5 18-21
L.edodes24-26 6,0 20-21
L.shimeji28-30 4,0 26-28
P.djamor29-31 3,0 23-24
P.ostreatus25-27 3,0 26-27

Пример 3. Получение средства, обладающего противоопухолевыми свойствами.

Получали погруженную культуру Hericium erinaceus штамм He-4 по примеру 2 в биореакторе объемом 15 л (объем культуральной среды - 8 л). По окончании процесса культивирования погруженную культуру базидиомицета подвергали сублимационной сушке при профильном изменении температуры, включая многократное снижение температуры до минус 30°С, измельчали и использовали полученный сухой порошок в качестве противоопухолевого средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средства представлены в таблице 5.

Пример 4. Получение средства, обладающего противоопухолевыми свойствами.

Получали погруженную культуру Hypsizygus marmareus штамм Hm-1 по примеру 2. По окончании процесса погруженную культуру базидиомицета подвергали автоклавированию при 1,2-1,5 атм в течение 2 часов, отделяли жидкую фазу и использовали ее в качестве противоопухолевого средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средства представлены в таблице 5.

Пример 5. Получение средства, обладающего противоопухолевыми свойствами.

Получали погруженную культуру Lentinus edodes штамм Le-14 no примеру 2, выращивая базидиомицет в биореакторе объемом 15 л с загрузкой 8 л производственной среды. По окончании погруженного культивирования мицелий отделяли фильтрованием. Сырой мицелий заливали дистиллированной водой в соотношении 100 г/л, автоклавировали при 1,5 атм в течение 2 часов. Полученный водный экстракт отделяли фильтрованием и использовали в качестве противоопухолевого средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средства представлены в таблице 6.

Пример 6. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.

Получали погруженные культуры Hericium erinaceus штамм He-4 и Lentinus edodes штамм Le-14 по примеру 2, выращивая базидиомицеты в биореакторах объемом 15 л, содержащих по 9 л производственной среды. По окончании процессов выращивания мицелий отделяли фильтрованием. Навески сырой биомассы Hericium erinaceus и Lentinus edodes в количестве 150 и 300 г, соответственно, заливали 100 мл этанола, экстракцию проводили в течение 1 часа при перемешивании. Этанольные экстракты отделяли фильтрованием и упаривали до сухого остатка на вакуумном испарителе. Оставшиеся после экстракции этанолом порции мицелия Hericium erinaceus и Lentinus edodes заливали по 1 л дистиллированной воды и автоклавировали при 1,2 атм в течение 2,5 часов. Водные экстракты отделяли от мицелия фильтрованием, водный экстракт мицелия Hericium erinaceus объединяли с сухим остатком этанольного экстракта мицелия Hericium erinaceus. Водный экстракт мицелия Lentinus edodes - с этанольным экстрактом мицелия Lentinus edodes. Таким образом было получено 2 противоопухолевых средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средств представлены в таблице 6.

Пример 7. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.

Получали погруженные культуры Flammulina velutipes штамм Fv-7 и Pleurotus ostreatus штамм 447 по примеру 2, выращивая первый базидиомицет в колбах на качалке, а второй - в биореакторе общим объемом 15 л с 9 л производственной среды. По окончании процессов погруженного культивирования мицелий базидиомицетов отделяли фильтрованием, сушили при 60°С, измельчали и использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты оценки противоопухолевого действия средств представлены в таблице 5.

Пример 8. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.

Выращивали погруженные культуры Armillaria mellea штамм Am-4, Flammulina velutipes штамм Fv-7, Hypsizygus tessulatus штамм Ht-1, Lyophyllum shimeji штамм Ls-2, Pleurotus djamor штамм Pd-3 и Pleurotus ostreatus штамм 447 согласно примеру 2, культивирование проводили в колбах на качалке. После окончания процессов погруженного культивирования мицелий базидиомицетов отделяли фильтрованием, сушили при 65°С и измельчали. Делали навески сухого измельченного мицелия базидиомицетов: Armillaria mellea - 6 г, Flammulina velutipes - 6 г, Hypsizygus tessulatus - 5 г, Lyophyllum shimeji - 10 г, Pleurotus djamor - 1,8 г, Pleurotus ostreatus - 3,6 г. Навески заливали 100 мл дистиллированной воды и экстрагировали в автоклаве при 1,2 атм в течение 2 часов. Водные экстракты отделяли фильтрованием и использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты оценки противоопухолевого действия полученных средств представлены в таблице 5.

Пример 9. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.

Водный экстракт сухого измельченного мицелия Armillaria mellea штамм Am-4, полученный по примеру 8, замораживали при температуре -18°С, водный экстракт сухого измельченного мицелия Pleurotus djamor штамм Pd-3, полученный по примеру 8, замораживали при температуре -70°С. Экстракты хранили при температуре заморозки в течение 4 месяцев, после чего размораживали при комнатной температуре и использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты изучения противоопухолевой активности средств представлены в таблице 5.

Пример 10. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.

Экстракт погруженного мицелия Hericium erinaceus штамм He-4, полученный по примеру 6, и водный экстракт сухого измельченного погруженного мицелия Hypsizygus tessulatus Ht-1, полученный по примеру 8, сушили с помощью распылительной сушилки. Полученные средства растворяли в дистиллированной воде таким образом, чтобы концентрации полученных растворов соответствовали концентрации растворов, подвергнутых сушке, и использовали для оценки их противоопухолевых свойств. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Пример 11. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.

В работе использовали водный экстракт сырого мицелия Lentinus edodes штамм Le-14, полученный по примеру 5, и водные экстракты сухого измельченного мицелия Flammulina velutipes штамм Fv-7 и Pleurotus ostreatus штамм 447, полученные по примеру 8. В экстракты добавляли 96% этанол. Соотношение объемов этанола и экстракта мицелия Lentinus edodes было 4:1, соотношение объемов этанола и экстракта Flammulina velutipes было 2:1, соотношение объемов этанола и экстракта Pleurotus ostreatus было 6:1. Выпавшие осадки, представляющие собой суммарные фракции водорастворимых полисахаридов мицелия, отделяли цетрифугированием и подвергали лиофильной сушке. Сухие осадки использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты изучения их активности представлены в таблице 5.

Пример 12. Оценка противоопухолевого действия полученных противоопухолевых средств.

Изучение противоопухолевого действия препаратов из погруженной культуры изучаемых видов грибов проводили in vivo на двух перевиваемых штаммах опухолей: Т-лимфоме EL-4 и Т-клеточном лимфолейкозе Р388. Опухоли прививали гибридным мышам (С57В1/6×DBA/2)F1 (далее B6D2F1), Т-лимфому EL-4 прививали самцам, Т-клеточный лимфолейкоз Р388 - самкам. Мышей получали из питомника РАМН «Крюково». После поступления мышей выдерживали в карантине 21 день. Штаммы опухолей хранили в азотном банке при температуре -196°С. После размораживания штаммы опухолей поддерживали в сингенных условиях в асцитной форме серийными внутрибрюшинными пассажами на мышах линии DBA/2. В опыте в день 0 Т-лимфому EL-4 прививали под кожу правого бока по 105 клеток. Т-клеточный лимфолейкоз Р388 - по 106 клеток. Лечение начинали через 10 суток после прививки Т-лимфомы EL-4 и через 2 суток после прививки Т-клеточного лимфолейкоза Р388. Действие изучаемых препаратов оценивали при пероральном введении. Препараты вводили с помощью зонда внутригастрально ежедневно 1 раз в сутки в течение 10 суток. Сухую измельченную биомассу грибов и сублимированные погруженные культуры грибов испытывали в дозе 50 мг/кг/сут, препараты готовили, добавляя измельченный грибной материал в крахмальный клейстер таким образом, чтобы суточная доза для каждого животного содержалась в 0,3 мл клейстера. Полисахаридные фракции применяли в дозе 2 мг/кг/сут в виде водных растворов, суточная доза раствора составляла 0,3 мл/мышь. Доза водных экстрактов мицелия базидиомицетов составляла 0,25-0,3 мл/кг/сут, содержание сухих веществ в водных экстрактах варьировало в диапазоне 13-19 мг/мл. Высушенные с помощью распылительной сушки водные экстракты мицелия грибов испытывали в дозе 4,8 мг/кг/сут, навески сухих экстрактов растворяли в воде, объем вводимого раствора составлял 0,3 мл/мышь. Количество мышей в контрольных и экспериментальных группах составляло 8-10 животных. В течение опытов следили за общим состоянием мышей, изменением массы тела, прививаемостью опухоли, динамикой роста опухоли. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО(%)=(Мко)/(М к)×100, где Мк и Mо - средняя расчетная масса опухоли в контроле и опыте, соответственно. Массу опухоли рассчитывали по формуле М (мг)=(а×b×с)/2, где М - расчетная масса опухоли, а, b, с - 3 наибольших взаимоперпедикулярных диаметра опухолевого узла в мм. Достоверность различий средних значений массы опухоли определяли по t-критерию Стьюдента. За достоверные принимали различия при Рспособ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 0,05. Противоопухолевая эффективность полученных средств представлена в таблицах 5 и 6.

Таблица 5.
Противоопухолевое действие полученных средств.
Модель: Т-клеточный лимфолейкоз Р388, учет на 14 сутки опыта.
№ примераПрепарат ТРО, %
1 23
3 Hericium erinaceus, сублимированная погруженная культура 75
4Hypsizygus marmareus, жидкий экстракт, полученный из погруженной культуры 56
7Flammulina velutipes, сухой измельченный погруженный мицелий 52
Pleurotus ostreatus, сухой измельченный погруженный мицелий 56
8Armillaria mellea, водный экстракт сухого погруженного мицелия 69
Flammulina velutipes, водный экстракт сухого погруженного мицелия 87
Hypsizygus tessulatus, водный экстракт сухого погруженного мицелия 59
Lyophyllum shimeji, водный экстракт сухого погруженного мицелия 72
Pleurotus djamor, водный экстракт сухого погруженного мицелия 44
Pleurotus ostreatus, водный экстракт сухого погруженного мицелия 75
9Armillaria mellea, водный экстракт сухого погруженного мицелия, хранившийся при -18°С66
Pleurotus djamor, водный экстракт сухого погруженного мицелия, хранившийся при -70°С45

12 3
10Hericium erinaceus, сухой экстракт сухого погруженного мицелия (после распылительной сушки)65
Hypsizygus tessulatus, сухой экстракт сухого погруженного мицелия (после распылительной сушки)63
11 Lentinus edodes, полисахаридная фракция погруженного мицелия 81
Flammulina velutipes, полисахаридная фракция погруженного мицелия 94
Pleurotus ostreatus, полисахаридная фракция погруженного мицелия 74

Таблица 6.
Противоопухолевое действие полученных средств.
Модель: Т-лимфома EL-4 учет на 18 сутки опыта.
Препарат ТРО,
примераспособ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 %
5 Lentinus edodes, водный экстракт сырого погруженного 62
способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 мицелия способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062
6Hericium erinaceus, объединенный водный и 58
способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 этанольный экстракт сырого погруженного мицелия способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062
способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 Lentinus edodes, объединенный водный и этанольный 59
способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 экстракт сырого погруженного мицелия способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062

Таким образом, поставленная задача решена. Длительность процесса культивирования сокращена до 2-6 дней при сохранении эффективности полученных средств, обладающих противоопухолевой активностью.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, включающий приготовление посевного мицелия базидиомицета, приготовление производственной питательной среды, засев производственной питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим получением погруженной культуры, отличающийся тем, что приготовление посевного мицелия осуществляют на стерильной жидкой питательной среде, содержащей, г/л воды: глюкозу - 18,0-22,0, соевую муку - 8,0-12,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,4 и арахидоновую кислоту - 1,0-5,0×10-5, выращивание посевного мицелия проводят при температуре 22-29°С в течение 2-6 суток при аэрации, при этом готовый посевной мицелий гомогенизируют.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенизацию готового посевного мицелия перед засевом производственной питательной среды осуществляют в гомогенизаторе в течение 2-5 мин, а в процессе засева - в биореакторе при включенной мешалке на 300-500 об/мин в течение 0,5-6 мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивируют базидиомицеты, выбранные из группы Armillaria mellea (Fr.) Karst., Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Singer, Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers., Hypsizygus marmareus 1611 (Peck) H.E.Bigelow, Hypsizygus tessulatus (Bulliard:Fr.) Singer, Lentinus edodes (Berk.) Singer, Lyophyllum shimeji (Kawam.) Hongo, Pleurotus djamor (Rumphius ex Fries) Boedjin, Pleurotus ostreatus (Jacg.:Fr.) Kumm.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Armillaria mellea ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 15,0-18,0, соевую муку -18,0-20,0, дигидрофосфат калия - 0,5-2,5, сульфат магния - 0,05-0,26, при температуре 24-28°С в течение 4,5-5,5 суток.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Flammulina velutipes ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 19,0-27,0, соевую муку 19,0-27,0, дигидрофосфат калия - 1,4-3,0, сульфат магния - 0,14-0,30, при температуре 20-28°С в течение 5,5-6,5 суток.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Hericium erinaceus ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 10,0-27,0, соевую муку - 20,0-25,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,3, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 24-30°С в течение 5,5-6,5 суток.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в производственную среду дополнительно вводят мелассу в количестве 1-40 г/л среды.

8. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Hypsizygus marmareus ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды:растительное масло- 20,0-24,0, соевую муку - 16,0-22,0, дигидрофосфат калия - 1,5-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 24-31°С в течение 5,5-6,5 суток.

9. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Hypsizygus tessulatus ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 18,0-25,0, соевую муку - 20,0-28,0, дигидрофосфат калия - 1,6-2,6, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 24-33°С в течение 6,5-7,5 суток.

10. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Lentinus edodes ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 12,0-16,0, соевую муку - 18,0-24,0, глюкозу - 8-12, дигидрофосфат калия - 1,3-2,6, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 24-30°С в течение 5,5-6,5 суток.

11. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Lyophyllum shimeji ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 16,0-22,0, соевую муку - 18,0-25,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 24-34°С в течение 3,5-4,5 суток.

12. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Pleurotus djamor ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 15,0-20,0, соевую муку - 15,0-21,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,3, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 26-35°С в течение 2,5-3,5 суток.

13. Способ по п.3, отличающийся тем, что культивирование базидиомицета Pleurotus ostreatus ведут в производственной питательной среде, содержащей, г/л воды: растительное масло - 14,0-20,0, соевую муку - 11,0-19,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, при температуре 24-28°С в течение 2,5-3,5 суток.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что после культивирования базидиомицета полученную погруженную культуру подвергают сублимационной сушке, затем высушенную культуру измельчают и полученный сухой порошок используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что после культивирования базидиомицета полученную погруженную культуру автоклавируют при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-3 ч, отделяют жидкую фазу и используют ее в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что после культивирования из погруженной культуры отделяют мицелий базидиомицета, заливают его дистиллированной водой в количестве 90-360 г/л, автоклавируют при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 ч, полученный водный экстракт отделяют и используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что после культивирования из погруженной культуры отделяют мицелий базидиомицета и проводят экстракцию этанолом в количестве 90-360 г/100 мл экстрагента в течение 0,5-1,5 ч при перемешивании, полученный этанольный экстракт отделяют от остатков мицелия, упаривают до сухого остатка на испарителе, а остаток мицелия заливают дистиллированной водой в количестве 90-360 г/л, автоклавируют при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 ч, полученный водный экстракт отделяют от остатка мицелия и объединяют с сухим остатком этанольного экстракта, и полученную смесь используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что после культивирования из погруженной культуры отделяют мицелий базидиомицета, высушивают его при температуре 35-80°С, измельчают и сухой порошок мицелия используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что сухой измельченный мицелий базидиомицета подвергают экстрагированию дистиллированной водой в количестве 18-72 г/л при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 ч, затем водный экстракт отделяют от остатков мицелия и полученный водный экстракт мицелия используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что полученное противоопухолевое средство замораживают при температуре -18способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью,   и средство, обладающее противоопухолевой активностью, патент № 2418062 -70°С и используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что полученное жидкое противоопухолевое средство сушат и используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

22. Способ по п.19, отличающийся тем, что в водный экстракт мицелия базидиомицета добавляют 2-6 объемов этанола, выпавший осадок отделяют и используют в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.

23. Средство, обладающее противоопухолевой активностью, отличающееся тем, что оно получено по любому из пп.1-22.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2418062

patent-2418062.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/14:
ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai -  патент 2528065 (10.09.2014)
ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля -  патент 2527899 (10.09.2014)
питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала -  патент 2527074 (27.08.2014)
способ восстановления чувствительного слоя биосенсора -  патент 2524438 (27.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной альфа-амилазы -  патент 2514224 (27.04.2014)
штамм fusarium sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы -  патент 2511427 (10.04.2014)
способ получения грибной белковой биомассы -  патент 2511041 (10.04.2014)
мутантный штамм glarea lozoyensis и его применение -  патент 2507252 (20.02.2014)
способ обнаружения микроскопических грибов рода coccidioides poasadasii 36 s и coccidioides immitis c-5 -  патент 2503715 (10.01.2014)

Класс A61K36/07 Basidiomycota, например Cryptococcus

Патенты РФ в классе A61K36/07:
способ получения меланина из чаги -  патент 2523414 (20.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
лечебно-косметическое средство -  патент 2500409 (10.12.2013)
способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью -  патент 2499040 (20.11.2013)
способ получения селенсодержащего препарата биомассы laetiporus sulphureus mz-22 -  патент 2473679 (27.01.2013)
препарат для лечения желудочно-кишечных болезней телят и способ его применения -  патент 2429871 (27.09.2011)
способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, и средство, полученное этим способом (варианты) -  патент 2416418 (20.04.2011)
композиция по уходу за кожей головы и волосами -  патент 2404736 (27.11.2010)
способ немедикаментозного снижения гиперлипидемии -  патент 2348422 (10.03.2009)
противоопухолевая и гипогликемическая композиция на основе активных ингредиентов из basidiomycotina и araliaceae -  патент 2274465 (20.04.2006)

Наверх