способ выращивания продуцирующей лизин грамположительной бактерии для доставки биологически активных соединений жвачным животным, кормовая добавка (варианты) и способ кормления жвачных животных

Формула изобретения

1. Способ выращивания продуцирующей лизин грамположительной бактерии для доставки биологически активных соединений жвачным животным, включающий стадии:

выращивания бактерии посредством, по меньшей мере, одного пассажа в среде для выращивания, содержащей количество лизоцима, эффективное для индукции роста клеточных стенок бактерий, устойчивых к протозойному потреблению; и выделения бактерии из среды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанной бактерией является Corynebacterium glutamicum.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют штамм Corynebacterium glutamicum, выбранный из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum ATCC 13058, Corynebacterium glutamicum ATCC 13825, Corynebacterium glutamicum ATCC 14066, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum ATCC 14068, Corynebacterium glutamicum ATCC 21127 и Corynebacterium glutamicum ATCC 700239.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация лизоцима в среде выращивания составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мкг/мл.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что концентрация лизоцима в среде выращивания составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/мл.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выращивания бактерий используют множество пассажей в содержащей лизоцим среде.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что используют от 2 до 10 пассажей.

8. Кормовая добавка для жвачных животных, содержащая продуцирующую лизин бактерию, полученную способом по п.1.

9. Кормовая добавка по п.8, отличающаяся тем, что указанной бактерией является Corynebacterium glutamicum.

10. Кормовая добавка по п.8, отличающаяся тем, что содержит продуцирующую лизин бактерию, имеющую скорость деградации в рубце меньшую, чем приблизительно 8% в час, как измерено по высвобождению ¹⁴С-меченого лейцина в соответствии со способом Уоллеса.

11. Кормовая добавка по п.10, отличающаяся тем, что указанная скорость деградации является меньшей, чем 6% в час.

12. Кормовая добавка для жвачных животных, содержащая продуцирующую лизин бактерию, имеющую скорость деградации в рубце меньшую, чем приблизительно 8% в час, как измерено по высвобождению ¹⁴С-меченого лейцина в соответствии со способом Уоллеса.

13. Кормовая добавка по п.10 или 12, отличающаяся тем, что скорость деградации в рубце является таковой, что более чем 20% дозы бактерий, скармливаемой жвачному животному в день, доставляется через ретикуло-рубец в интактном виде.

14. Кормовая добавка по п.8 или 12, отличающаяся тем, что содержит штамм Corynebacterium glutamicum, выбранный из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum ATCC 13058, Corynebacterium glutamicum ATCC 13825, Corynebacterium glutamicum ATCC 14066, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum ATCC 14068, Corynebacterium glutamicum ATCC 21127 и Corynebacterium glutamicum ATCC 700239.

15. Способ кормления жвачных животных, включающий добавление в кормовой рацион эффективного количества кормовой добавки по п.8 или 12.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что кормовую добавку добавляют в количестве, эффективном для обеспечения от приблизительно 5 мг до приблизительно 150 мг метаболически доступного лизина на кг массы тела жвачного животного.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что жвачным животным является молочная корова.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Данное изобретение заявляет приоритет согласно параграфу 119(е) Раздела 35 Кодекса законов США (U.S.C.) предварительной заявки с регистрационным номером 60/633611, поданной 6 декабря 2004 года, описание которой включено здесь в виде ссылки.

Область техники

Данное изобретение относится к способу идентификации микроорганизмов, применимых для желудочно-кишечной доставки жвачным животным биологически активных соединений, которые по своей природе устойчивы к инактивации в рубце, а также к способу выращивания менее устойчивых к инактивации полезных микроорганизмов таким образом, что они становятся более устойчивыми к инактивации в рубце. Эти микроорганизмы при пероральном введении жвачным животным способны доставлять через желудочно-кишечный тракт целые клетки и питательные вещества и биологически активные соединения, содержащиеся в этих клетках, жвачным животным. Данное изобретение включает в себя также микроорганизмы, более устойчивые к инактивации в рубце, которые применимы для желудочно-кишечной доставки биологически активных соединений жвачным животным, и способы дополнения ими рационов жвачных животных.

Уровень техники

Пробиотические культуры на основе Bifidobacterium, Propionibacterium и Lactobacillus все чаще используются для поддержания кишечной функции у моногастрических сельскохозяйственных животных и людей. Заявленные преимущества включают в себя увеличенную усвояемость, улучшенную иммунную функцию и уменьшение желудочно-кишечных нарушений. Хотя пробиотики, основными примерами которых являются дрожжевые и грибковые пробиотики, используют для жвачных животных, трудность гарантирования того, что пробиотики проходят через рубец и поступают в тонкую кишку и толстую кишку, ограничивала интерес в кишечных функциональных пробиотиках в случае жвачных животных.

Рубец действует как главный барьер прохождения бактерий у жвачных животных, и эксперименты позволили предположить, что менее чем 10% бактериальной культуры, добавленной к рациону, может быть извлечено после выхода из рубца. Поглощение и переваривание бактерий протозойными организмами (простейшими) является ответственным за большую часть бактериального разрушения в рубце. Первой и лимитирующей стадией в разрушении бактерий простейшими рубца является деградация стенки бактериальной клетки. Ранее проведенные исследования показали, что на это разрушение сильно влияют состав и строение стенки бактериальной клетки и что, действительно, выращиванием бактерий в присутствии непрерывного стресса, возникающего вследствие деградации стенки клетки ферментом лизоцимом, можно «закалить» стенку бактериальной клетки, сделав ее более устойчивой к протозойному потреблению.

У жвачных животных проглатываемый корм поступает в ретикуло-рубец, первый из множественных компартментов желудка, которые имеются у жвачных животных. В ретикуло-рубце проглоченный корм предварительно переваривается или расщепляется за счет микробной ферментации. Значительные количества проглоченного белка расщепляются в ретикуло-рубце с растворением пептидов и аминокислот. Часть этих пептидов и аминокислот превращается в аммиак в качестве отходов и в дальнейшем не используется жвачным животным. Остальная часть используется микроорганизмами рубца и включается в их собственную биомассу. При прохождении содержимого рубца в сычуг и кишечник часть микробной биомассы рубца выходит из ретикуло-рубца с остальной частью содержимого рубца. Затем эта микробная биомасса переваривается в тонкой кишке, снабжая это жвачное животное питательными веществами (нутриентами). Однако значительная доля бактерий, присутствующих в ретикуло-рубце, потребляется и переваривается протозойной популяцией, постоянно обитающей в ретикуло-рубце. Этот процесс является расточительным процессом для жвачного животного-хозяина, так как бактериальные клетки и питательные вещества (нутриенты), содержащиеся в этих клетках, не выходят из рубца и не вносят вклад в питание жвачного животного.

Подобным образом, животным добавляют в корм бактериальные препараты, которые будут прикрепляться к эпителию кишечника, улучшая за счет этого скорость роста животного и превращение корма (патент США № 4980164, патент США № 5256425). Однако для жвачных животных эти бактериальные препараты также имеют низкую выживаемость при прохождении через рубец. Для преодоления потери жизнеспособности при пероральном введении Batich (патент США № 6242230) описывает способ инкапсулирования бактерий в гелевом матриксе таким образом, что они могут доставляться в тонкую кишку животных. Целью Batich является предотвращение генерирования животным-хозяином иммунологической реакции на эти бактерии с уменьшением посредством этого их выживаемости. Batich предполагает только преодоление иммунологической реакции хозяина и ничего не говорит о каком-либо протозойном переваривании, и, следовательно, гидролитические условия рубца могут приводить к расщеплению этого инкапсулирующего матрикса. Кроме того, этот способ является дорогостоящим и предусматривает использование химических средств, которые могут уменьшать жизнеспособность некоторых микроорганизмов.

Поскольку дрожжи являются во много раз большими, чем бактерии, они не чувствительны к протозойному потреблению в рубце, как бактерии, но являются обычно чувствительными к лизису в рубце. Shiozaki et al. (патент США № 4562149) описывают способ выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisiae таким образом, что клетка обогащается до 10-20% S-аденозилметионином. Настоящее изобретение является попыткой использования дрожжей, а не бактерий для синтеза метионина. Хотя данное изобретение является новым, оно не является экономически осуществимым, так как дрожжи менее эффективны, чем бактерии в отношении синтеза таких аминокислот. Кроме того, не обеспечено доказательство, показывающее, что этот способ производит продукт, который является устойчивым к расщеплению метионина в рубце.

Подобным образом, Ohsumi et al., Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1302-1305 (1994) описывают способ выращивания дрожжей, которые обогащены содержанием лизина. Хотя содержание лизина было увеличено по сравнению с обычно наблюдаемым содержанием лизина в дрожжах дикого типа, этот способ не был признан экономичным в качестве способа получения проходящего через рубец лизина. Strauss et al., Can. J. Anim. Sci. (2004) использовали другой вид дрожжей Pichiа pastoris для демонстрации того, что, когда этот организм является генетически сконструированным, он может быть использован для доставки некоторых рекомбинантных белков в тонкую кишку жвачных животных. Однако Pichia pastoris не считается безопасной для скармливания скоту.

Bolla et al. (патент США № 6737262) описывают способ включения грибков или других микроорганизмов в корм, посредством которого этот организм был генетически трансформирован для продуцирования пептидов из по меньшей мере двух аминокислот, а не отдельных аминокислот. Кроме того, авторы настоящего изобретения утверждают, что может быть необходимым дополнительное инкапсулирование для гарантии того, что эти пептиды проходят среду рубца.

Во всех описанных выше случаях требуется манипулирование дрожжевыми клетками либо посредством интенсивного отбора, либо посредством генетического манипулирования. Обычно скоту скармливают Saccharomyces cerevisiae для обеспечения доступных для рубца нутриентов, и эти дрожжи не являются особенно хорошо подходящими для обеспечения больших количеств соединений, которые могли бы быть биологически активными в тонкой кишке. Хотя бактерии могут быть использованы коммерчески для получения более широкого диапазона биологически активных соединений и нутриентов, чем дрожжи, задачей является обеспечение соединений, экскретируемых из клетки, для получения соединений, которые можно легче выделить. Не существует известного изобретенного способа, при помощи которого выращивают бактериальные препараты, независимо от того, достигается это интенсивным отбором штаммов или посредством условий культивирования, таким образом, что бактерии и биологически активные соединения, содержащиеся в них, защищены от деградации в рубце.

При получении бактериальных препаратов, питательных веществ и других соединений, которые обладают биологически активными свойствами, предназначенных для введения жвачным животным, важно защитить эти активные ингредиенты против микробной деградации, которая имеет место в рубце. Хорошо известно, что скорость производства мяса, шерсти и/или молока может быть увеличена, если источники ограничивающих рост незаменимых аминокислот и других биологически активных соединений защищены от изменения микроорганизмами рубца и, следовательно, доступны для дальнейшего усвоения животным в желудочно-кишечном тракте.

Имеются многочисленные изобретения в отношении увеличения стабильности активных соединений и питательных веществ в рубце путем инкапсулирования с нанесением покрытия или включения этого соединения в химический матрикс. Патент США № 3959493 описывает стабильные в рубце продукты, содержащие биологически активные вещества, защищенные алифатическими жирными кислотами. Патент США № 3655864, выданный Grass et al., описывает ветеринарные композиции, делающие возможной пострубцовую доставку биологически активных кормовых добавок, причем эти композиции включены в матрикс или покрыты матриксом глицерилтристеарата с жидкой ненасыщенной высшей жирной кислотой.

Патент США № 4473545, выданный Drake et al., описывает кормовую добавку для животных, содержащую композит относительно нерастворимого связывающего вещества, состоящего из частиц растворимого материала и активного материала. Этот состоящий из частиц (корпускулярный) материал является таким, что он легко растворим в определенном диапазоне условий рН. Растворение таких состоящих из частиц материалов делает связывающее вещество водопроницаемым с высвобождением, таким образом, активного материала.

Патент США № 4533557 описывает кормовую добавку для животных, содержащую смесь в форме таблетки или гранулы по меньшей мере одного биологически активного ингредиента, хитозана и защитного материала жирных кислот с длинной цепью. Патент США № 6238727 и патент США № 5885610 описывают получение нерастворимых минеральных солей незаменимых аминокислот таким образом, что они являются нерастворимыми в рубце и, следовательно, недоступными для микробной деградации, но затем являются доступными для поглощения в тонкой кишке.

Klose (патент США № 6013286) описывает композицию и способ введения биологически активного соединения жвачным животным таким образом, что это соединение не поступает в рубец непосредственно, а проходит в тонкую кишку в интактном виде. Данный способ требует, чтобы этот материал имел удельную массу между приблизительно 0,3 и 2,0 и чтобы эти частицы содержали сердцевинную часть биологически активного вещества с гидрофобным покрытием, полностью инкапсулирующим эту сердцевинную часть. Кроме того, на поверхность этого гидрофобного покрытия наносят поверхностно-активное вещество для гарантии того, что частицы не будут всплывать в рубце.

Во всех этих изобретениях, в которых биологически активные соединения являются инкапсулированными или включенными в матриксы, предназначенные для их защиты от деградации в рубце, необходимо, чтобы это соединение было сначала получено микробной ферментацией или химическим синтезом, затем очищено и подвергнуто процессу инкапсулирования. Этот многостадийный процесс является дорогим и неэффективным способом получения защищенных в рубце биологически активных соединений. На каждой стадии имеется потеря продукта и потеря биологической активности в извлеченном продукте.

L-лизин получают ферментацией продуцирующими L-лизин штаммами Corynebacterium glutamicum. Продуктивность C.glutamicum может быть улучшена отбором штамма, улучшениями в способе ферментации (например, перемешивании, подаче кислорода, составе питательных сред). Способы технологии рекомбинантных ДНК также могут быть использованы для улучшения продуцирования L-лизина в штаммах C.glutamicum амплификацией отдельных генов биосинтеза. Таким путем увеличенное продуцирование L-лизина было достигнуто амплификацией ДНК-фрагмента, придающего устойчивость к аминоэтилцистеину (ЕР 88166), устойчивой к действию по типу обратной связи аспартаткиназы (ЕР 387527), амплификацией дигидродипиколинатсинтазы (ЕР 197335), аспартатаминотрансферазы (ЕР 219027), аспартатфосфоенолпируваткарбоксилазы (ЕР 143195 и ЕР 358940), семиальдегиддегидрогеназы (ЕР 219027) и пируваткарбоксилазы (DE 19831609).

В промышленном производстве L-лизина необходимо выделять продукт L-лизин из бактериальной клетки для увеличения эффективности синтеза L-лизина бактериями. Было обнаружено, что ген LysE является ответственным за экспорт L-лизина из цитоплазмы C.glutamicum и в среду и является решающим для эффективного промышленного получения L-лизина (Tryfona et al., Process Biochem (2004)). Увеличенная активность экспортирующего L-лизин носителя LysE стимулирует продуцирование лизина (DE 19548222).

Проблемой, которая существует, является то, что нет средств защиты бактерий и других микроорганизмов от деградации в рубце таким образом, чтобы они могли проходить рубец и доставляться в интактном виде в тонкую кишку. Подобным образом, биологически активные соединения, которые продуцируются, должны экскретироваться из бактериальных клеток таким образом, чтобы они могли быть очищены. После очистки эти биологически активные соединения должны быть защищены против деградации в рубце технологией инкапсулирования или заделки.

Сущность изобретения

Теперь были обнаружены способы идентификации штаммов грамположительных бактерий, применимые для желудочно-кишечной доставки у жвачных животных биологически активных соединений, которые являются устойчивыми к инактивации в рубце. Были обнаружены другие способы увеличения устойчивости к инактивации в рубце культивированных штаммов бактерий, применимых для желудочно-кишечной доставки биологически активных соединений жвачным животным, независимо от того, насколько высокая устойчивость к инактивации в рубце присуща этому бактериальному штамму.

Таким образом, согласно одному аспекту данного изобретения обеспечивается способ in vitro для оценки устойчивости бактериального штамма к инактивации в рубце in vivo, включающий:

культивирование in vitro грамположительного бактериального штамма, применимого для желудочно-кишечной доставки биологически активного соединения у жвачных животных, в питательной среде, содержащей натуральную или синтетическую жидкость рубца; и

измерение деградации белка в бактериальной культуре как функции времени.

Жидкость рубца выбирают для приближения к условиям рубца, с которыми должен встретиться вводимый бактериальный штамм. Натуральную жидкость рубца берут из содержимого рубца здорового жвачного животного в пределах двадцати четырех часов после кормления. Синтетической жидкостью рубца является смесь материалов, отобранных для имитации условий в рубце, включающая в себя один или несколько видов потребляющих микроорганизмы простейших, которые утилизируют микроорганизмы в рубце. Такие протозойные виды могут быть легко идентифицированы специалистами со средней квалификацией в данной области.

В предпочтительных способах согласно данному изобретению анализируют высвобождение ¹⁴С-меченого лейцина для измерения деградации белка в соответствии со способом Wallace et al., Br. J. Nutr., 58, 313-323 (1987), описание которого включено в виде ссылки. Результаты выражены в виде скорости, описанной как % от оставшихся присутствующих бактерий, которые расщепляются в час. Для целей настоящего изобретения штаммы бактерий со скоростью деградации менее чем 8% в час определяют как устойчивые к инактивации в рубце. Штаммы, имеющие скорость деградации менее чем 6% в час, являются предпочтительными для доставки биологически активного соединения жвачному животному, причем штаммы, имеющие скорость деградации менее чем 4% в час, являются более предпочтительными.

Таким образом, штаммы, которые являются устойчивыми к инактивации в рубце, будут иметь более чем 20% дозы бактерий, скармливаемой животному в день, доставляемых через ретикуло-рубец в интактном виде. Предпочтительные штаммы будут иметь более чем 50% дозы бактерий, скармливаемой животному в день, доставляемых через ретикуло-рубец в интактном виде, и более предпочтительно будут иметь более чем 80% дозы бактерий, скармливаемой животному в день, доставляемых через ретикуло-рубец в интактном виде.

Таким образом, один вариант этого аспекта изобретения дополнительно включает в себя стадию идентификации в качестве устойчивых к инактивации в рубце бактериальных штаммов, имеющих скорость деградации менее чем 8% в час, измеряемую по высвобождению ¹⁴С-меченого лейцина в соответствии со способом Wallace et al.

Согласно другому варианту осуществления этого аспекта данного изобретения применимым бактериальным штаммом является продуцирующий лизин бактериальный штамм, предпочтительно штамм Corynebacterium glutamicum и более предпочтительно штамм C.glutamicum, о котором известно, что он сверхпродуцирует лизин, в том числе штаммы C.glutamicum, генетически модифицированные для сверхпродуцирования лизина. Однако этот способ может быть применен по существу к любому бактериальному штамму, который применим для желудочно-кишечной доставки жвачному животному биологически активного соединения, для которого является желательной оценка устойчивости к инактивации в рубце.

Для целей данного изобретения «желудочно-кишечная доставка» определяется как включающая в себя доставку в сычуг, тонкую кишку и толстую кишку жвачного животного. Точное место, в которое доставляется биологически активное соединение, зависит от природы доставляемого биологически активного соединения, что является понятным специалисту с обычной квалификацией в данной области, желающему ввести это соединение. Данное изобретение не модифицирует местоположение доставки, а защищает биологически активное соединение от инактивации в рубце при его доставке.

Способ в соответствии с этим аспектом данного изобретения обеспечивает возможность отбора бактериальных штаммов с уменьшенной деградируемостью (расщепляемостью) в рубце, которые могут быть использованы для доставки специфических для желудочно-кишечного тракта бактерий и биологически активных соединений, содержащихся в них, жвачному животному, причем стенка бактериальной клетки служит для обеспечения защиты для содержимого клеток при прохождении рубца. Отобранные бактериальные штаммы могут обладать достаточной устойчивостью к деградации в рубце для создания возможности подачи полезной бактериальной биомассы жвачным животным без дополнительной модификации.

Штаммы, в отношении которых было обнаружено, что они обладают достаточной устойчивостью к модификации в рубце для обеспечения подачи содержимого этих клеток жвачным животным без дополнительной модификации, включают в себя штаммы C.glutamicum АТСС 13058, 13825, 14066, 14067, 14068, 21127 и 700239. Таким образом, согласно другому аспекту данного изобретения обеспечена кормовая добавка, проходящая через рубец, включающая содержащую лизин биомассу штамма C.glutamicum, выбранного из группы, состоящей из штаммов С.glutamicum АТСС 13058, 13825, 14066, 14067, 14068, 21127 и 700239.

Данное изобретение обеспечивает также способ, при помощи которого бактериальные штаммы могут быть сделаны более устойчивыми к инактивации в рубце. Способ в соответствии с этим аспектом данного изобретения может быть использован для увеличения устойчивости к инактивации в рубце бактериальных штаммов, идентифицированных как устойчивые к инактивации в рубце штаммы, и штаммов, идентифицированных как неустойчивые к инактивации в рубце штаммы.

Таким образом, согласно другому аспекту этого изобретения обеспечивается способ увеличения устойчивости культивированного бактериального штамма к инактивации в рубце, где этим бактериальным штаммом является грамположительный бактериальный штамм, который в пищевом отношении полезен для жвачных животных, и этот способ включает стадии:

выращивания культуры бактериального штамма посредством по меньшей мере одного пассажа в среде для выращивания, содержащей количество лизоцима, эффективное для индукции роста стенок бактериальных клеток, устойчивых к протозойному потреблению; и

выделения этого бактериального штамма из содержащей лизоцим среды.

Согласно одному варианту осуществления этого аспекта данного изобретения концентрация лизоцима в среде для выращивания составляет от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкг/мл. Согласно другому варианту осуществления этого аспекта данного изобретения используют множество пассажей выращивания, причем предпочтительное количество пассажей составляет от приблизительно 2 до приблизительно 20.

Согласно еще одному варианту осуществления этого аспекта данного изобретения стадию выделения выполняют после последнего пассажа, после которого извлекают бактериальную биомассу, в которой стенки бактериальных клеток являются устойчивыми к расщеплению в рубце. Затем эту биомассу предпочтительно обезвоживают и концентрируют для скармливания жвачному животному общепринятыми способами.

В другом варианте осуществления этого аспекта данного изобретения, этим бактериальным штаммом является продуцирующий лизин бактериальный штамм, предпочтительно штамм Corynebacteriumglutamicum и более предпочтительно штамм C.glutamicum, о котором известно, что он сверхпродуцирует лизин, в том числе штаммы, генетически модифицированные для сверхпродуцирования лизина. Однако этот способ может быть применен также к любому бактериальному штамму, который применим для желудочно-кишечной доставки жвачному животному биологически активных соединений, для которых является желательным увеличение устойчивости к инактивации в рубце.

Данное изобретение относится также к кормовым добавкам, проходящим через рубец, содержащим бактериальную биомассу, применимым для желудочно-кишечной доставки жвачным животным биологически активных соединений, которые являются устойчивыми к инактивации в рубце, полученным согласно любому способу в соответствии с данным изобретением, и к способам дополнения рациона жвачного животного этими кормовыми добавками, проходящими через рубец. При включении в корм животного и предоставлении жвачным животным эти бактерии функционируют в качестве системы для желудочно-кишечной доставки биологически активных соединений жвачным животным.

Все предыдущие и другие цели, признаки и преимущества данного изобретения являются более очевидными из подробного описания предпочтительных вариантов осуществления, представленных ниже, рассматриваемых вместе с сопутствующим графическим материалом.

Краткое описание графического материала

Фиг.1 изображает скорость деградации двух штаммов С.glutamicum, не выращиваемых в присутствии лизоцима, в сравнении с S.ruminantium Z108.

Фиг.2 изображает скорость деградации тех же самых двух штаммов С.glutamicum , выращиваемых в присутствии лизоцима, в сравнении с S.ruminantium Z108.

Фиг.3 изображает количество разрушения в жидкости рубца штаммов С.glutamicum АТСС 13869, 700239 и 31269, выращиваемых в присутствии и в отсутствие лизоцима, в сравнении с S.bovis ES1;

Фиг.4 изображает скорость разрушения в жидкости рубца тех же самых штаммов C.glutamicum, выращиваемых в присутствии и в отсутствие лизоцима, в сравнении с S.bovis ES1; и

Фиг.5 изображает разрушение в жидкости рубца из крупного рогатого скота Bifidobacter longum, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus raffinolactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus pentosus и Propionibacterium acidipropionici, выращиваемых в присутствии и в отсутствие лизоцима, в сравнении с S.bovis ES1.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Для придания устойчивости к деградации в рубце полезные бактерии выращивают в питательной среде в присутствии лизоцима, предпочтительно в условиях ферментации, которые являются идеальными для выращивания конкретного организма в коммерческих количествах и оптимизированными для синтеза представляющего интерес биологически активного соединения. Примеры подходящих питательных сред включают в себя среду Lennox (Kumagai et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 69, 2051-2056 (2005)), среду CGXII (Keilhauer et al. 1993. J Bacteriol 175: 5595-5603), бульон Luria Bertani (Lennox, E.S. 1955. Virology 1:190-206) и комплексную среду, описанную Broer & Kramer (J. Bacteriol. 1990, 172, 7241-7248).

Лизоцим добавляют к питательной среде в концентрации, эффективной для усиления устойчивости к лизису в рубце. Концентрация лизоцима не должна быть настолько низкой, что не наблюдается статистически или коммерчески значимое улучшение в производительности деградации в рубце, или настолько высокой, что рост клеток неприемлемо ингибируется. Таким образом, концентрация лизоцима предпочтительно составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мкг/мл и более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл.

В предпочтительных способах используют множество серийных пассажей в содержащей лизоцим среде для выращивания. Более предпочтительными являются способы, предусматривающие использование от приблизительно 2 серийных пассажей до приблизительно 10 серийных пассажей. Бактерии выращивают в каждом пассаже в течение от приблизительно 12 до приблизительно 48 часов, причем предпочтительным является общее время выращивания в присутствии лизоцима от приблизительно 1 дня до приблизительно 20 дней.

Затем бактериальные клетки собирают фильтрованием и/или центрифугированием, концентрируют и/или сушат и упаковывают коммерчески приемлемым образом.

Способ данного изобретения, в котором использует лизоцим для придания устойчивости к инактивации в рубце, может быть применен к любому бактериальному виду, применимому для желудочно-кишечной доставки биологически активных соединений жвачным животным. Примеры таких видов включают в себя, но не ограничиваются ими, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Leuconostoc mesenteroides, Bacillus coagulans, Bifidobacterium thermophilum, Pediococcus acidilactici, Bacillus lentus, Lactobacillus acidophilus, Pediococc. cerevis. (damnosus), Bacillus licheniformis, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, Bacillus pumilus, Lactobacillus bulgaricus, Propionibacter. freudenreichii, Bacillus subtilis, Lactobacillus casei, Propionibacterium shermanii, Bacteroides amylophilus, Lactobacillus cellobiosus, Bacteroides capillosus, Lactobacillus curvatus, Streptococcus cremoirs, Bacteriodes ruminicola, Lactobacillus delbrueckii, Streptococcus diacetilactis, Bacteroides suis, Lactobacillus fermentum, Streptococcus faecium, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus helveticus, Streptococcus intermedius, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus lactis, Streptococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus plantarum и Streptococcus thermophilus.

Полученные пищевые добавки сообщают также полезные преимущества моногастрическим животным, в том числе человеку, даже несмотря на то что в этом случае не требуются свойства прохождения через рубец.

Данное изобретение является особенно хорошо подходящим для использования с грамположительными бактериями вследствие их толстой пептидогликановой клеточной стенки. Примеры грамположительных бактерий включают в себя микобактерии (Mycobacteria), Nocardia, Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus и Corynebacterium. Были разработаны многие коммерчески применимые продуцирующие лизин штаммы С.glutamicum , которые особенно пригодны для использования с этим изобретением, такие как штаммы АТСС 13058, 13825, 14066, 14067, 14068, 21127 и 700239. Предпочтительными являются штаммы Corynebacterium glutamicum, способные синтезировать высокие концентрации L-лизина, такие как штаммы АТСС 21127 и 700239. Предпочтительными являются также штаммы Corynebacterium glutamicum, которые являются недостаточными в отношении гена LysE.

Биологически активные соединения, которые могут быть доставлены видами бактерий, выращенными в присутствии лизоцима, включают в себя питательные вещества, такие как аминокислоты, их производные, гидроксигомологи аминокислот, белки, углеводы, жиры, витамины и лекарственные средства для животных, отдельно или в виде смеси двух или более лекарственных средств.

Иллюстративные примеры биологически активных соединений включают в себя аминокислоты, такие как лизин, метионин, триптофан, треонин и т.д.; производные аминокислот, такие как N-ациламинокислоты, кальциевая соль N-гидроксиметилметионина, лизин HCl и т.д.; гидроксигомологи аминокислот, такие как 2-гидрокси-4-метилмеркаптомасляная кислота и ее соли и т.д.; углеводы, такие как крахмал, сахароза, глюкоза и т.д.; жиры, такие как полиненасыщенные жирные кислоты, омега-3-жирные кислоты, омега-6-жирные кислоты, транс-жирные кислоты и т.д.; и витамины и вещества с функцией, подобной функции витаминов, такие как витамин А, ацетат витамина А, пальмитат витамина А, витамины В, такие как тиамин, тиамин HCl, рибофлавин, никотиновая кислота, никотинамид, пантотенат кальция, пантотенат холина, пиридоксин HCl, холинхлорид, цианокобаламин, биотин, фолиевая кислота и т.д., п-аминобензойную кислоту, витамины D2 и D3, витамин Е и т.д.

Кроме питательных веществ биологически активные соединения включают в себя также терапевтические соединения, в том числе гормоны, такие как эстроген, стилбестрол, гексестрол, тиропротеин, гоитроген, гормон роста и т.д. Биологически активные терапевтические соединения включают в себя также терапевтические пептиды и белки, в том числе ферменты, такие как амилаза, протеаза, ксиланаза, пектиназа, целлюлаза, лактаза, липаза и т.д.; гормональные белки, такие как гормон роста, соматотропин и т.д.; микробные связывающие углеводы, такие как маннан- и фруктоолигосахариды, и антимикробные пептидные соединения, такие как бактериоцины.

Таким образом, способ данного изобретения кроме его применения как с встречающимися в природе бактериальными штаммами, так и штаммами, полученными интенсивными процессами селекции, может быть также применен к рекомбинантно полученным бактериальным штаммам. Рекомбинантный бактериальный штамм, генетически сконструированный для продуцирования желаемого терапевтического пептида или белка, может быть затем модифицирован по способу настоящего изобретения, чтобы позволить этим рекомбинантным бактериальным клеткам безопасно проходить рубец для желудочно-кишечной доставки этого пептида или белка.

Эти бактериальные клетки могут быть сами ценными для желудочно-кишечной доставки соединений, содержащихся на клеточной поверхности этих бактерий. Кроме того, клетки без пищевой ценности, которые функционируют, конкурируя с патогенами в кишечнике (т.е. участвуя в конкурентном исключении), также включены в рамки определения «биологически активные соединения» для целей данного изобретения.

Отдельный способ in vitro обеспечивается также для идентификации полезных бактериальных штаммов, которые либо являются инертными к инактивации в рубце, либо должны выращиваться в содержащей лизоцим среде для выращивания, чтобы стать инертными к инактивации в рубце. Этот способ оценки полезных бактериальных штаммов в отношении устойчивости к инактивации в рубце может быть применен к указанным выше применимым видам бактерий. Этот способ служит для идентификации штаммов, которые обладают присущим им свойством устойчивости к инактивации в рубце и могут применяться в качестве проходящих через рубец кормовых добавок без необходимости выращивания их сначала в содержащей лизоцим среде, и штаммов, которым устойчивость к инактивации в рубце должна быть предоставлена за счет первоначального культивирования в присутствии лизоцима.

Этот способ in vitro включает культивирование штамма грамположительной бактерии, применимого для желудочно-кишечной доставки биологически активного соединения у жвачных животных, в среде для выращивания, содержащей натуральную или синтетическую жидкость рубца, с измерением деградации белка как функции времени. Среда для выращивания будет содержать от приблизительно 80 до приблизительно 99 об.% питательной среды и от приблизительно 1 до приблизительно 20 об.% жидкости рубца. Примеры подходящих питательных сред включают в себя среду Dehority (Scott and Dehority, J. Bacteriol., 89, 1169-1175 (1965)), среду Hobson М2 (Hobson, Methods Microbiol., 3B, 133-149 (1969)) и среду CRT (Wallace et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53, 965-970 (2003)). Многочисленные другие подходящие среды описаны в книгах Hungate (Hungate R E 1966. The rumen and its microbes. Academic Press, New York, NY) и Hobson & Stewart (The Rumen Microbial Ecosystem, Chapman and Hall, London).

Жидкость рубца выбирают для приближения к условиям рубца. Натуральную жидкость рубца получают из содержимого рубца здоровых жвачных животных. Например, эта жидкость может быть извлечена у животных с фистулами рубцов. Предпочтительно эту жидкость получают от того же самого вида жвачного животного и предпочтительно от жвачных животных, подвергнутых тем же самым условиям кормления, что и жвачные животные, которым будет вводиться этот бактериальный штамм. Предпочтительно эту жидкость получают в пределах одного-трех часов после утреннего кормления. Эта жидкость рубца должна быть процежена для удаления нежелательного состоящего из частиц материала.

Синтетическую жидкость рубца готовят из материалов, имитирующих условия, которые встречаются в рубце. Эта жидкость будет содержать один или несколько видов простейших-«хищников», которые поглощают микроорганизмы в рубце, и питательные вещества для роста этих бактерий, которые включают в себя сахара, фосфатный и бикарбонатный буферы, минеральные соли, летучие жирные кислоты и витамины. Примеры синтетических сред хорошо описаны Hobson & Stewart (The Rumen Microbial Ecosystem, Chapman and Hall, London). Примеры простейших рубца, ответственных за бактериальную деградацию, включают в себя виды Epidinium, Eudiplodinium , Isotricha, Dasytricha, Entodinium и Polyplastron (Ivan et al., 2000a, J Anim Sci 78, 750-759; Ivan et al., 2000b, J Dairy Sci 83, 776-787).

Применимый бактериальный штамм, подлежащий оценке, культивируют в среде для выращивания при температурных условиях, которые должны встретиться ему в рубце, т.е. от приблизительно 36 до приблизительно 40°C. Время инкубации может быть выбрано таким образом, чтобы оно приближалось ко времени, в течение которого этот бактериальный штамм будет находиться в рубце, обычно от приблизительно одного часа до приблизительно 48 часов, например от 12 до приблизительно 48 часов. Величина деградации белка, ожидаемая для периода времени, в течение которого бактериальный штамм будет фактически находиться в рубце, может быть затем экстраполирована из этих данных.

Деградацию белка для этого бактериального штамма измеряют в виде массы продукта или продуктов деградации, полученных в зависимости от времени. Один предпочтительный способ в соответствии с данным изобретением анализирует высвобождение ¹⁴ С-меченого лейцина для измерения деградации белка по способу Wallace et al., Br. J. Nutr., 58, 313-323 (1987), описание которого включено в виде ссылки. Результаты выражают в виде скорости, описанной как % от оставшихся присутствующих бактерий, которые разрушаются, за час. Для целей данного изобретения штаммы бактерий со скоростью деградации менее чем 8% в час определяют как устойчивые к инактивации в рубце. Штаммы, имеющие скорость деградации менее чем 6% в час, являются предпочтительными для доставки биологически активного соединения жвачному животному, причем штаммы, имеющие скорость деградации менее чем 4% в час, являются более предпочтительными.

Бактериальные штаммы, которые после оценки не считаются устойчивыми к деградации в рубце, т.е. штаммы, которые имеют скорость деградации более чем 8% в час, могут затем выращиваться в присутствии лизоцима для улучшения устойчивости к деградации в рубце. Это улучшение можно измерить путем повторной оценки этого бактериального штамма после воздействия лизоцима способом оценки in vitro данного изобретения, используя натуральную или синтетическую жидкость рубца. Степень улучшения может быть выражена в виде процентного уменьшения скорости деградации на протяжении той же самой единицы времени после воздействия лизоцима. Однако степень улучшения не является такой важной, как падение скорости деградации ниже предела, необходимого для того, чтобы этот бактериальный штамм считался устойчивым к деградации в рубце, как определено данной заявкой. То есть большое увеличение в устойчивости может быть все еще недостаточным, тогда как небольшое улучшение может быть более чем достаточным.

Применимые бактериальные штаммы, идентифицированные как устойчивые к деградации в рубце или устойчивые к деградации в рубце при выращивании в присутствии лизоцима, могут быть затем выращены (с лизоцимом, если это необходимо для устойчивости к деградации в рубце), и биомасса может быть собрана в коммерческих количествах с использованием коммерческого оборудования для ферментации, в том числе оборудования для периодической культуры, культуры с подпиткой и непрерывной культуры. Затем эта биомасса может быть необязательно смешана с приемлемыми наполнителями, связующими, вкусовыми и ароматизирующими добавками и т.п. с образованием кормовой добавки, которая подлежит смешиванию с кормовым рационом жвачных животных. Альтернативно эта биомасса и другие добавки могут быть растворены или суспендированы в водной среде с образованием кормовой добавки, проходящей рубец, которую разбрызгивают на кормовой рацион. Образование любой дозированной формы по существу является общепринятым и хорошо известным специалисту с обычной квалификацией в данной области. Могут быть добавлены другие известные кормовые ингредиенты для жвачных животных к любой форме кормовой добавки, которая проходит рубец.

Собранные бактериальные клетки, устойчивые к деградации в рубце, могут удобным образом скармливаться жвачному животному в смеси с общепринятым кормом для жвачных животных. Этими кормами являются обычно растительные материалы, годные в пищу жвачным животным, такие как сено бобовых растений, травяное сено, бобовый силос, зерно кукурузы, овес, ячмень, барда, пивная дробина, соевая мука и мука из жмыха хлопчатника, и они включены в количестве, обычно рекомендуемом специалистом по питанию животных, которое обычно не превышает 5 мас.% содержания сухого твердого вещества этого корма.

Для защищенной от рубца лизиновой кормовой добавки, такой как кормовая добавка, содержащая биомассу С.glutamicum, количество добавки, которое должно быть добавлено к содержимому сухих твердых веществ этого корма, должно быть количеством, эффективным для подачи суточной средней величины от приблизительно 5 до приблизительно 150 мг метаболически доступного лизина на кг массы тела жвачного животного. Предпочтительным является количество метаболически доступного лизина от приблизительно 15 до приблизительно 75 мг на кг массы тела жвачного животного. Метаболически доступный лизин может быть измерен определением потока лизина из имитирующей рубец системы in vitro; измерением потока лизина в тонкую кишку у животных, снабженных сычужной и/или кишечной канюлями, или измерением увеличения процента и/или выхода белка в молоке самок жвачных животных, вскармливаемых рационом, составленным таким образом, что он является недостаточным в отношении метаболически доступного лизина.

Кормовые добавки, проходящие рубец, по данному изобретению могут даваться любому жвачному животному, нуждающемуся в пищевом дополнении, в том числе скоту, животным, исследуемым в лаборатории, и животным, демонстрируемым в зоопарках и других выставках, посвященных жизни диких животных. Примеры жвачных животных включают в себя домашний скот, рогатый скот, овец и коз. Кормовые добавки, проходящие рубец, могут добавляться в корм скота, разводимого для мяса, молока, кожи, щетины или шерсти, или рабочих животных сельскохозяйственных предприятий (фермерских хозяйств).

Следующие неограничивающие примеры, представленные ниже, иллюстрируют некоторые аспекты данного изобретения. Все части и проценты даны в виде мас.%, если нет других указаний, и все температуры даны в градусах Цельсия.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Чувствительность штаммов С.glutamicum к деградации в рубце посредством протозойного потребления

Деградацию С.glutamicum и S.ruminantium (представляющих «средние» бактерии рубца) определяли в жидкости рубца по способу Wallace et al., Br. J. Nutr., 58, 313-323 (1987).

Штаммы Corynebacterium glutamicum (АТСС 13761 и АТСС 13869) выращивали в аэробной среде Wallace и McPherson. S.ruminantium Z108 выращивали в анаэробной среде Wallace и McPherson. Среды Wallace и McPherson и их приготовление описаны в вышеуказанной ссылке на статью Wallace et al. в журнале. Культуры выращивали в течение ночи при 39°C. Клетки собирали центрифугированием при 1000 g×10 минут при комнатной температуре. Клетки ресуспендировали в анаэробном буфере Coleman, содержащем 5 мМ ¹⁴С-L-лейцин, и инкубировали в течение ночи (OD=1,0) для мечения бактериального белка. Брали пробу (1 мл) и помещали в 0,25 мл 25% ТХУ для определения белка. Две аликвоты по 50 мкл помещали в сцинтилляционную жидкость для определения количества добавленной радиоактивности.

Жидкость рубца извлекали у трех овец спустя 2 ч после кормления и процеживали через муслин. Добавляли немеченый L-лейцин (5 мМ) и процеженную жидкость рубца (SRF) выдерживали в тепле. Пробу (1 мл) добавляли к 1 мл 4% формалина для счета простейших.

Суспензию меченых бактериальных клеток (0,5 мл) добавляли к 4,5 мл SRF или буфера и инкубировали при 39°C. Пробы (0,5 мл) брали при 0, 1, 2 и 3 ч и помещали в 0,125 мл ТХУ. Пробы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 3 минут и 200 мкл супернатанта считали для определения высвобожденной радиоактивности, представляющей бактериальный белок, деградированный простейшими.

На основе высвобождения радиоактивности, представляющей бактериальный белок, деградированный простейшими, процентную деградацию определяли в каждой временной точке. Данные подставляли в уравнение (Mehrez and Orskov, 1987):

Y=a+(c-a)*1-(exp[-k _d*x]; где Y=деградация в указанное время x, ч;

а=начальная деградация; с=максимальная деградация; k_D =скорость деградации, ч^-1.

Эффективную деградируемость определяли для выбранных скоростей пассажа через рубец согласно уравнению:

Y=a+(c*k_d )/(K_d+K_p), где K_p=скорость оборачиваемости в рубце.

Эти результаты показаны на фиг.1. Оба штамма С.glutamicum обнаруживали быструю деградацию в сравнении с S.ruminantium Z108. Исчезновение на протяжении 3-часового периода инкубации было равно 71,2 и 93,1% для штаммов 10336 и 13869 соответственно в сравнении с 21,9% для S.ruminantium Z108. Эффективная деградируемость при скорости оборачиваемости 0,07 ч^-1 составляла 71,2 и 53,8% для штаммов 13761 и 13869 соответственно.

Пример 2. Выращивание С.glutamicum в присутствии низких уровней лизоцима

Готовили среды Wallace и McPherson, не содержащие ¹⁴С (24×7 мл). К каждой из 4 наборов пробирок добавляли 0,5 мл стерилизованного при помощи фильтра лизоцима (0,1; 1,0; 10;, 100 или 1000 мкг/мл). К конечному набору из 4 пробирок добавляли 0,5 мл среды D Колемана (контроль). Пробирки инокулировали культурами штамма С.glutamicum АТСС 13761 и инкубировали при 39°C в течение 48 часов и измеряли OD (650 нм) для каждого организма при 24 и 48 часах.

Штамм 13761 рос хорошо при воздействии двух самых низких уровней лизоцима (0,1 и 1 мкг/мл). Рост снижался наполовину при 100 мкг/мл и полностью ингибировался при 1000 мкг/мл.

Пример 3. Эффект роста штаммов С.glutamicum в присутствии лизоцима и чувствительность к протозойному потреблению

Методология была по существу той же самой, что и эксперимент 1, за исключением того, что обработки состояли из штаммов С.glutamicum АТСС 13761 и АТСС 13869, выращенных, как в эксперименте 1, или в присутствии лизоцима (0,5 мл 0,25 мкг/мл лизоцима; конечная концентрация 16,7 мкг/мл). Как и в эксперименте 1, S.ruminantium Z108 использовали в качестве контрольного организма.

Эти результаты показаны на фиг.2. Деградация была более низкой в этом эксперименте, чем в эксперименте 1 для всех организмов. При выращивании штаммов без лизоцима (нативного) исчезновение на протяжении 3-часового периода инкубации составляло 37,9 и 42,8% для штаммов 13761 и 13869 соответственно в сравнении с 13,3% для S.ruminantium Z108. Однако при выращивании в присутствии лизоцима 3-часовая деградация уменьшалась до 15,2% для штамма 13869, но была неизмененной для штамма 13761 (36,3%). Эффективная деградируемость при скорости оборота в рубце 0,07 ч^-1 составляла 53,8 и 64,7% для штаммов 13761 и 13869 соответственно при выращивании в присутствии лизоцима и 36,1 и 24,5% для соответствующих штаммов при выращивании в присутствии лизоцима.

Примеры 4-6. Эффект роста штаммов С.glutamicum 13869, 700239 и 31269 в присутствии лизоцима и чувствительность к протозойному потреблению

Штаммы С.glutamicum 13869, 700239 и 31269 получали из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС). Культуры оживляли на питательном агаре и переносили в питательный бульон в соответствии с инструкциями АТСС. При наблюдении здорового роста (после 3×24 ч пассажей через питательный бульон при 39°C) культуры выращивали в течение дополнительных 3×24 ч при 39°C в питательном бульоне плюс или минус 20 мкг/мл лизоцима белка куриного яйца. S.bovis ES1 выделяли предварительно из рубца овцы, и его поддерживают в коллекции культур Institute of Rural Sciences, University of Wales, Aberystwyth.

Бактерии метили выращиванием культур в течение 24 ч при 39°C в среде Wallace и McPherson, содержащей жидкость рубца, с аммиаком, цистеином и L-[U-¹⁴С]лейцином в качестве единственных добавленных источников азота, и 20 мкг/мл лизоцима белка куриного яйца добавляли к культурам, предварительно выращенным в присутствии лизоцима. Клетки собирали центрифугированием и промывали один раз в растворе D солей Колемана (Coleman, 1978) перед инкубированием с процеженной жидкостью рубца. Жидкость рубца извлекали спустя 2 часа после утреннего кормления у 3 животных с фистулами в рубце, получавших рацион на основе травяного силоса. Эту жидкость процеживали через 4 слоя муслиновой ткани.

Среднюю деградацию белка измеряли по высвобождению [¹⁴С] в растворимый в трихлоруксусной кислоте материал во время 3-часовых инкубаций. Немеченый L-лейцин включали во все инкубации в конечной концентрации 5 ммоль/л.

Разрушение различных бактерий на протяжении трехчасовой инкубации в жидкости рубца показано на фиг.3. Начальное сравнение скорости разрушения бактерий (в виде %/ч) показало, что штамм С.glutamicum 700239 разрушался значимо более медленно, чем другой штамм С.glutamicum или бактерия рубца S.bovis (5,63, 2,58, 8,27, 6,88%/ч SED 1,287 для штаммов С.glutamicum 13869, 700239 и 31269 и S.bovis ES1, соответственно, фигура 4). При испытании данных для штаммов С.glutamicum отдельно было ясно, что, хотя опять было значимое различие в скорости разрушения между используемыми штаммами, не было улучшения для этих штаммов после предынкубации с лизоцимом (таблица 1).

Таблица 1 Эффект роста в присутствии и в отсутствие лизоцима на разрушение штаммов С.glutamicum 13869, 700239 и 31260 в жидкости рубца
	Выращенные в присутствии лизоцима	Выращенные в отсутствие лизоцима
	Разрушение (%/ч)
C.glutamicum
13869	5,5	5,8
700239	2,2	3,0
31269	7,4	9,1
SED
Процеживание	1,03 ***
Лизоцим	0,84 ns
Взаимодействие процеживания и лизоцима	1,46ns

Использованный здесь анализ основан на анализе, описанном Wallace et al., где высвобождение ¹⁴С-лейцина из бактерий в жидкость рубца в присутствии избытка немеченого лейцина используют для измерения разрушения бактерий в рубце. Для трех бактериальных штаммов выращивание этих культур в лизоциме не имело значимого действия на скорость разрушения в жидкости рубца, несмотря на то что имеется численное уменьшение около 16%. Две возможные причины этого отсутствия действия представлены ниже:

Время в культуре : в данном эксперименте С.glutamicum инкубировали с лизоцимом в течение 96 часов в целом (3 пассажа 24-20 мкг/мл в питательном бульоне плюс один пассаж в среде Wallace и McPherson, используемой для мечения клеток). Возможно, что недостаточное время было предоставлено для того, чтобы эти культуры изменили их структуру клеток в ответ на лизоцим.

Низкая деградируемость этих культур даже в отсутствие лизоцима: в данном эксперименте деградируемость штаммов С.glutamicum в отсутствие лизоцима варьировалась от 9 до 3%/ч. Это значительно меньше, чем величины, зарегистрированные ранее с другими штаммами С.glutamicum (т.е. 12 и 24%/ч со штаммами 10334 и 10337), и гораздо ниже, чем цифры, зарегистрированные с B.fibrisolvens (около 30%/ч), причем были сделаны начальные наблюдения, что лизоцим мог уменьшать деградацию. В противоположность этому цифры для S.bovis, зарегистрированные здесь, являются очень сходными с цифрами, наблюдаемыми ранее. Возможно, что причиной того, что лизоцим сообщал низкое защитное действие, было то, что эти клетки были уже относительно устойчивыми к атаке простейших.

Примечательно, что при выращивании С.glutamicum 700239 в присутствии лизоцима скорость деградации составляла приблизительно 2%/ч. Если предположить, что при добавлении в рубец С.glutamicum 700239 может покидать рубец при приблизительно 10%/ч в жидкой фазе, то на протяжении 24-часового периода приблизительно 77% С.glutamicum 700239 может проходить рубец при деградации менее чем 15%. При более реалистическом обороте жидкости 15%/ч более 85% может проходить рубец при деградации менее чем 12%.

В данном эксперименте выращивание в присутствии лизоцима, по-видимому, не защищало исследованные штаммы С.glutamicum против деградации в рубце. Однако штамм С.glutamicum 700239 является очень устойчивым к разрушению в рубце, и ожидается, что он может быть подходящим переносчиком для проведения аминокислот, таких как лизин, через рубец.

Примеры 7-13. Эффект роста штаммов Bifidobacterium longum, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus raffinolactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus pentosus и Propionibacterium acidipropionici в присутствии лизоцима и чувствительность к протозойному потреблению

Действие на разрушение в жидкости рубца семи различных потенциально пробиотических организмов, иных, чем С.glutamicum, исследовали выращиванием этих организмов в присутствии лизоцима in vitro, используя в качестве контроля типичную бактерию рубца, Streptococcus bovis, как в примерах 1-6.

Bifidobacterium longum, P.freudenreichii и Р.аcidipropionici получали из Национальной Коллекции Промышленных и Морских Бактерий (NCIMB) и Национальной Коллекции Пищевых Бактерий, Aberdeen. Lactobacillus raffinolactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus pentosus получали от доктора Кувина Хиллмана, Gutbugs, UK.

Бактерии выращивали и метили и видимое разрушение измеряли, как в примерах 4-6, в том числе S.bovis ES1. Разрушение различных бактерий на протяжении трехчасовой инкубации в жидкости рубца показано на фиг.5. Выращивание в присутствии лизоцима уменьшало разрушение S.bovis,P.freudenreichii и L.raffinolactis более чем на 70%. Разрушение L.pentosus, B.longum и L.fermentum уменьшалось на 40-50%, тогда как не было действия на разрушение L.lactis и Р.acidipropionici (таблица 2).

Таблица 2 Влияние роста в присутствии и в отсутствие лизоцима на пробиотические организмы в жидкости рубца
	Выращенные в отсутствие лизоцима	Выращенные в присутствии лизоцима	SED
Разрушение (%/ч)
Streptococcus bovis	6,44	1,58	1,629
Bifidobacterium longum	7,25	3,46	0,535
P.freudenreichii	3,56	0,50	0,444
Lactobacillus raffinolactis	3,66	0,92	0,307
Lactobacillus fermentum	3,68	2,24	0,0702
Lactobacillus lactis	4,91	4,55	0,1285NS
Lactobacillus pentosus	2,81	1,73	0,1317
P.acidipropionici	2,95	2,19	0,252NS

Предыдущие примеры и описание предпочтительных вариантов осуществления должны рассматриваться в качестве иллюстрации, а не ограничения данного изобретения, определенного его формулой изобретения. Многочисленные комбинации представленных выше признаков могут быть использованы без отклонения от данного изобретения, описанного в формуле изобретения. Такие вариации не должны рассматриваться как отклонение от идеи и объема этого изобретения, и предполагается, что все такие модификации включены в объем формулы изобретения.