гемостимулирующее средство и способ стимуляции гемопоэза

Формула изобретения

1. Средство для стимуляции гемопоэза, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с молекулярной массой от 400 до 4000 Да направленным потоком ускоренных электронов 2,5МэВ с поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч.

2. Способ стимуляции гемопоэза, включающий введение препарата, отличающийся тем, что в качестве препарата используют иммобилизированную гиалуронидазу по п.1, которую вводят парентерально либо перорально 1 раз в сутки в течение 1-5 дней в дозе 10-1000ЕД/кг.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови и гематологических осложнений, в том числе ятрогенного характера, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых гемостимуляторов.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].

Наиболее близким по природе происхождения к предлагаемому средству является препарат нативной гиалуронидазы, конъюгированной с полиоксидонием путем химического синтеза [3].

Существует иммобилизированная с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидаза, введение которой приводит к увеличению содержания прогениторных клеток в организме [4].

Авторами изобретения впервые выявлена выраженная гемостимулирующая активность иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата нативной гиалуронидазы, который вводят парентерально в дозе 1000 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2 дней [5].

Недостатком данного способа является его эффективность только в случае применения препарата гиалуронидазы в указанной высокой/токсичной дозе [5]. При этом использование данного средства даже в терапевтическом режиме зачастую приводит к развитию целого ряда побочных эффектов и осложнений [6, 7], связанных, в первую очередь, с его иммуногенностью.

Данный способ является наиболее близким к заявляемому по механизму действия и техническому результату и выбран в качестве прототипа.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной гиалуронидазы и повышение безопасности и эффективности способа.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства. Препарат назначают парентерально либо перорально в дозе 10-1000 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 1-5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является применение иммобилизированной гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронидазы [4] было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск). Иммобилизация гиалуронидазы осуществлялась на низкомолекулярном полиэтиленгликоле (400 до 4000 Да) направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.

На сегодняшний день показана возможность стимуляции миелопоэза с помощью высоких доз препарата нативной гиалуронидазы [5]. Кроме того, известно, что иммобилизизация гиалуронидазы с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе сопровождается появлением новых физико-химических свойств у данного фермента, что делает эффективным его применение в качестве средства, увеличивающего популяцию родоначальных клеток различных классов (в том числе гемопоэтических предшественников) в костном мозге, в низких дозах [4]. При этом согласно литературным сведениям пегилированные (конъюгированные с полиэтиленгликолем) белковые средства являются более безопасными, чем их неконъюгированные аналоги [8].

Тем не менее способность кроветворных стволовых клеток к реализации своего ростового потенциала, проявляющегося увеличением образования зрелых клеток крови за счет стимуляции процессов их дифференцировки под влиянием модифицированной (иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазы, остается неизученной. В то же время известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [8, 9], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться непредсказуемыми изменениями не только стереохимической структуры исходных веществ, но и их функциональными характеристиками.

Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции гемопоэза на фоне снижения риска развития осложнений и побочных эффектов за счет уменьшения лекарственной нагрузки на организм, для специалиста является неочевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному 1 раз в сутки в течение 1-5 дней парентерально либо перорально вводят иммобилизированную гиалуронидазу в дозе 10-1000 ЕД/кг.

Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 543 штук, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [10] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов [11].

Пример 1

Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили внутрибрюшинно (парентерально) 1 раз в сутки в течение 2-х дней препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) в дозах 1000 и 50 ЕД/кг (способ прототип) и препарат иммобилизированной гиалуронидазы внутрибрюшинно (парентарально) в дозе 50 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 2-х дней) и перорально в дозах 50 и 10 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 1 и 5 дней соответственно). При этом доза «Лидазы» в 1000 ЕД/кг в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная у препарата нативной гиалуронидазы.

Введение препарата нативной гиалуронидазы на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения, но только при использовании дозы 1000 ЕД/кг. В данном случае отмечалось существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2). При этом указанные изменения сопровождались закономерным увеличением количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).

Вместе с тем эффективность применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) наблюдалась при ее использовании во всех режимах и способах введения (табл.1, 2, 3). При этом парентеральное введение 50 ЕД/кг имГД приводило к значительно более выраженному увеличению показателей активности кроветворения, чем при использовании в качестве гемостимулятора препарата нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг. Так, отмечалось более существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров, эритроидных клеток, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Аналогичные изменения имели место в периферической крови. Количество нейтрофилов, ретикулоцитов и эритроцитов значительно превосходило значения соответствующих показателей у животных, которым вводили «Лидазу» (табл.3). Кроме того, в отличие от стандартного препарата фермента использование имГД сопровождалось значительным увеличением числа тромбоцитов в периферической крови.

Таким образом, иммобилизированная гиалуронидаза оказывала выраженный стимулирующий эффект в отношении эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоцитарного (тромбоцитарного) ростков кроветворения. Причем, данное вещество приводило к максимально быстрому восстановлению показателей костного мозга и периферической крови при цитостатической миелосупрессии как при парентеральном, так и пероральном его использовании в низких дозах.

В целом, исходя из полученных данных следует, что средство, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на водорастворимом носителе с помощью ионизирующего излучения, обладает выраженной гемостимулирующей активностью. При этом эффективность данного средства значительно превышает таковую у стандартных препаратов гиалуронидазы.

Цитируемая литература:

1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - № 11. - P.1593-1603.

2. Волкова M.A. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - № 4. - С.80-84.

3. Дубницкая Л.В., Назаренко Т.А. Возможности применения препарата Лонгидаза® в комплексной терапии патологических изменений эндометрия // Русский медицинский журнал. - 2008. - Т.16 - № 19. - С.1248-1251.

4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - № 11. - С.7-10.

5. Патент (RU) на изобретение № 2336899 «Способ стимуляции миелопоэза», 2008 г. Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.

6. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857.

7. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. e.a. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, Pa^ JB Lippincott. - 1993 - p.396-551.

8. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспер. и клин. фарм. 2008. Том 71. № 1. С.61-69.

9. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биотехнологий // Российские нанотехнологии. - 2006. - № 1-2. - С.256-264.

10. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - № 1(9). - С.29-32.

11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.

Таблица 1
Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBACaLac (на 105 неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m)
Сроки исследования, сутки	КОЕ-Э	КОЕ-ГМ
Фон	6,75±0,73	4,50±0,38
	1	9,50±0,50*	8,38±0,63*
3-е	2	8,88±0,81	8,00±0,87*
	3	9,13±1,13*	12,38±0,82*#
	4	18,50±0,50*#$	17,00±0,53*#$
	5	14,38±1,00*#$	14,63±0,51*#$
	6	15,25±0,33*#$	16,25±0,86*#$
	1	7,25±0,70	6,63±0,73*
5-е	2	7,50±0,53	5,75±0,75
	3	10,13±0,44*#	7,88±0,55*
	4	14,88±0,44*#$	10,75±0,45*#$
	5	9,38±0,42*#	8,75±0,49*#
	6	12,25±0,65*#$	9,5±0,70*#
	1	6,38±0,68	4,25±0,56
10-е	2	5,75±0,37	5,50±0,42
	3	7,88±0,83	7,14±0,70*
	4	10,00±0,71*#	9,2±0,2*#$
	5	7,50±0,53	6,50±0,63*
	6	12,1±0,33*#$	9,88±0,72*#$
Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана.
$ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг

Таблица
Динамика костномозгового кроветворения у мышей линии CBACaLac (×106/бедро) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m)
Сроки исследования, сутки	Незрелые нейтрофильные гранулоциты	Зрелые нейтрофильные гранулоциты	Эозинофильные гранулоциты	Лимфоидные клетки	Моноциты	Эритроидные клетки
фон	1,10±0,10	3,72±0,31	0,47±0,09	3,38±0,30	0,48±0,06	1,77±0,32
3-е	1	0,04±0,01*	0,11±0,04*	0	1,87±0,15*	0,55±0,04	0,18±0,05*
2	0,05±0,02*	0,16±0,03*	0	1,57±0,13*	0,60±0,11	0,13±0,03*
3	0,13±0,03*#	0,15±0,04*	0	1,36±0,10*#	0,42±0,09	0,31±0,02*#
4	0,14±0,05*#	0,17±0,04*	0	1,29±0,12*#	0,61±0,06	0,28±0,02*#
5	0,15±0,02*#	0,11±0,02*	0,01±0,01*	1,36±0,07*#	0,36±0,04#	0,30±0,01*#
6	0,17±0,11*#	0,10±0,01*	0,01±0,01*	1,35±0,14*#	0,39±0,11	0,45±0,02*#
5-е	1	4,22±0,26*	1,45±0,26*	0,30±0,08	2,03±0,21*	0,86±0,08*	1,04±0,16
2	4,82±0,46*	1,69±0,23*	0,07±0,07*	2,66±0,26	0,98±0,20*	1,27±0,28
3	6,31±0,52*#	2,2±0,11*#	0,12±0,08	2,28±0,36	1,29±0,15*	1,98±0,30#
4	8,49±0,50*#	3,98±0,33#	0,17±0,10	2,62±0,23	2,14±0,22*#$	2,78±0,19#$
5	5,77±0,44*#	3,26±0,29#	0,31±0,08	2,88±0,09	0,90±0,12*	1,74±0,08#
6	6,01±0,46*#	2,26±0,26#	0,15±0,08*	2,15±0,18	1,07±0,15*	2,09±0,29#
10-е	1	1,00±0,18	6,65±0,45*	0,76±0,45	1,82±0,25*	0,60±0,09	0,35±0,06*
2	0,80±0,11	6,57±0,53*	0,51±0,10	1,87±0,17*	0,66±0,14	0,39±0,03*
3	0,99±0,06	6,11±0,57*	0,33±0,10	2,39±0,50	0,94±0,21	1,29±0,19#
4	0,97±0,13	6,32±0,48*	0,53±0,12	3,35±0,65#	1,00±0,09*#	3,71±0,02*#$
5	0,74±0,05	6,13±0,68*	0,29±0,10	2,49±0,56	1,39±0,26*#	2,63±0,22*#$
6	0,86±0,13	5,78±0,34*	0,21±0,06	2,45±0,32	1,49±0,16*#	3,1±0,15*#$
Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана
$ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалупонидазы в дозе 1000 ЕД/кг

Таблица 3
Показатели периферической крови у мышей линии CBACaLac после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m)
Сроки исследования, сутки	Эритроциты, Т/л	Ретикулоциты, в промиллях	Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л	Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л	Тромбоциты, Т/л
Фон	8,61±0,18	14,1±0,3	0,40±0,06	2,26±0,02	796,57±77,49
	1	7,89±0,28*	10,7±0,24*	0,01±0,01*	0,12±0,03*	503,80±25,97*
3-е	2	7,19±0,21*	9,89±0,37*	0,01±0,01*	0,13±0,03*	557,83±46,69*
	3	7,84±0,25*	12,8±0,6*#	0,02±0,01*	0,17±0,02*	505,67±24,25 *
	4	7,69±0,14*	14,7±0,52#$	0,02±0,01*	0,15±0,01*	568,17±22,60*
	5	7,59±0,18*	12,3±0,41*#	0,04±0,02*	0,14±0,06*	560,67±36,33*
	6	7,54±0,45*	12,7±0,38*#	0,02±0,01*	0,15±0,01*	509,83±58,60*
	1	7,53±0,15*	28,4±1,3*	0,16±0,04*	0,75±0,23*	349,40±36,84*
5-е	2	7,85±0,27*	27,6±2,4*	0,13±0,05*	0,65±0,10*	393,33±33,96*
	3	8,59±0,12#	37,5±1,89*#	0,41±0,08#	1,7±0,16#	321,60±23,22*
	4	9,53±0,35*#$	41,2±1,3*#	0,83±0,25*#$	2,47±0,16#$	672,83±22,69#$
	5	8,06±0,30	34,5±0,96*#	0,99±0,31*#$	1,69±1,12#	450,83±11,12*#
	6	9,13±0,08*#	32,7±2,3*#	1,03±0,21*#$	1,79±0,14#	727,67±74,10#
	1	7,29±0,18*	15,6±1,4	1,31±0,32*	5,13±0,63*	977,33±27,66
10-е	2	7,18±0,15*	16,7±0,78*	1,71±0,42*	5,36±1,15*	843,33±100,51
	3	7,33±0,15*	16,4±0,97*	1,17±0,23*	7,42±0,18*#	884,17±33,78
	4	8,14±0,17$	24,3±1,7*#$	1,25±0,14*	8,50±0,37*#$	1143,17±38,51*#$
	5	7,36±0,29*	19,4±0,45*#$	1,18±0,24*	7,93±0,65*#	1367,80±101,30*#
	6	8,53±0,18	26,7±1,84*#$	1,48±0,26*	8,67±0,42*#$	803,83±98,77
Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана,
$ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг