способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции
Классы МПК: | G09B23/28 в медицине |
Автор(ы): | Емельянов Сергей Геннадьевич (RU), Корокин Михаил Викторович (RU), Покровский Михаил Владимирович (RU), Кочкаров Владимир Исхакович (RU), Корокина Лилия Викторовна (RU), Покровская Татьяна Григорьевна (RU), Гладченко Михаил Петрович (RU), Артюшкова Елена Борисовна (RU), Гуреев Владимир Владимирович (RU), Артюшкова Екатерина Вячеславовна (RU), Полонская Ксения Вадимовна (RU), Цепелев Василий Юрьевич (RU), Гудырев Олег Сергеевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Юго-Западный государственный университет" (ЮЗГУ) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-10-19 публикация патента:
20.03.2011 |
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиофармакологии, и может быть использовано для моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции. Для этого 1 раз в сутки в течение 7 дней самцам крыс линии Wistar внутрижелудочно вводят аминокислоту метионин в дозе 3 г/кг. По окончании введения метионина, на 8 сутки от начала эксперимента животных наркотизируют, вводят катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей гемодинамики; болюсное введение фармакологических агентов (ацетилхолин в дозе 40 мкг/кг, нитропруссид натрия в дозе 30 мкг/кг) осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики измеряются непрерывно посредством инвазивного датчика и компьютерной программы "Biopac". Степень развития эндотелиальной дисфункции оценивается с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции. Степень развития гипергомоцистеинемии оценивается по содержанию гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных. Способ обеспечивает создание легко воспроизводимой и токсикологически безопасной модели гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции. 2 табл.
Формула изобретения
Способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции, отличающийся внутрижелудочным введением самцам крыс линии Wistar аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг один раз в сутки в течение 7 дней, оценкой развития эндотелиальной дисфункции с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции и подтверждением развития гипергомоцистеинемии с помощью определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии, и может быть использовано для оценки эндотелиопротективного действия ряда фармакологических препаратов при моделировании гипергомоцистеинемии.
Наиболее близким к заявленному решению является способ моделирования гипергомоцистеинемии, который заключается в введении метионина в дозах от 12 до 44 г/кг в корм экспериментальным животным или добавлении метионина в поилки экспериментальным животным (Sanjana Dayal, «Murine Models of Hyperhomocysteinemia and Their Vascular Phenotypes», Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2008; 28: 1596-1605).
Основными недостатками способа являются: недостаточно точное дозирование метионина при моделировании патологии; отсутствие оценки развития гипергомоцистеинемии и эндотелиальной дисфункции на различных сроках введения метионина в указанных дозировках; токсическое влияние метионина на физиологические показатели жизнедеятельности экспериментальных животных.
Задачей изобретения является разработка легко воспроизводимой и токсикологически безопасной модели гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции, основанной на внутрижелудочном введении метионина.
Технический результат достигается внутрижелудочным введением самцам крыс линии Wistar аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг один раз в сутки в течение 7 дней, оценкой развития эндотелиальной дисфункции с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции и подтверждением развития гипергомоцистеинемии с помощью определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови.
Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг приводит к развитию гипергомоцистеинемии у крыс линии Wistar. Гомоцистеин синтезируется в организме из незаменимой аминокислоты метионин и служит предшественником цистатионина и цистеина. Повышение уровня гомоцистеина коррелирует со снижением выраженности эндотелийзависимой вазодилатации. Из указанных данных можно сделать вывод о способности аминокислоты метионин вызывать эндотелиальную дисфункцию.
Способ осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 180-220 г. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ex tempore с помощью солюбилизатора ТВИН 80 и 1% крахмального раствора. С целью изучения возможности моделирования эндотелиальной дисфункции метионин (ООО «Полисинтез», г.Белгород) вводили по следующим схемам: 1) ежедневное, 2 раза в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 7 дней (n=10 животных); 2) ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 14 дней (n=10 животных); 3) ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (n=10 животных); 4) ежедневное, 1 раз в сутки, в течение 7 дней внутрижелудочное введение 10% раствора ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг (контроль, n=10 животных).
По окончании введения метионина, на 15 и 8 сутки, от начала эксперимента выживших животных наркотизировали (хлоралгидрат 300 мг/кг), вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell". Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ) - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.
Степень развития эндотелиальной дисфункции оценивается с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции, являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение АХ.
Степень развития гипергомоцистеинемии оценивается по содержанию гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных. Концентрация гомоцистеина определяется методом иммунотурбодиметрии с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s.r.o.
При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величина стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при р<0,05.
Пример конкретного выполнения.
Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что ежедневное, в течение 7 суток, внутрижелудочное введение метионина дважды в день в дозе 5 г/кг вызывает гибель 60% экспериментальных животных. Начиная со вторых суток введения метионина, животные становились вялыми, малоподвижными, отказывались от пищи и воды. Начиная с третьих суток, наблюдалась гибель животных с клинической картиной, характерной для острого нарушения мозгового кровообращения. При вскрытии погибших животных обнаружена морфологическая картина ишемического инсульта, что согласуется с литературными данными о повышении тромбообразования и нарушении гемореологии под влиянием гипергомоцистеинемии.
Ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 14 дней вызывало гибель 40% животных к 7 суткам от начала эксперимента. Морфологическая и клиническая картина гибели животных соответствовала таковой у животных вышеобозначенной экспериментальной серии.
В группах животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг и 10% раствор ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг, гибели животных не отмечалось на протяжении всего периода введения.
Выживших животных выводили из эксперимента в соответствии с вышеописанным дизайном исследования.
В табл. 1 представлены данные о влиянии внутрижелудочного введения метионина на функциональные показатели сердечно-сосудистой системы экспериментальных животных.
Обнаружено, что ежедневное введение метионина по обозначенным схемам не вызывает достоверных изменений артериального давления и частоты сердечных сокращений (табл.1).
Обработка полученных экспериментальных данных при проведении функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у экспериментальных животных позволила установить, что внутрижелудочное введение 10% раствора ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг не вызывает повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции. Внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг 2 раза в сутки в течение 7 дней вызывает повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции до 3,7±0,5 (табл. 1).
Наибольшее значение КЭД получили в группе животных с внутрижелудочным введением метионина в дозе 5 г/кг 1 раз в сутки в течение 14 дней. В данной группе КЭД был равен 3,9±0,2. Достоверное повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции получили и в группе животных с внутрижелудочным введением метионина в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (КЭД равен 3,3±0,3) (табл. 1).
Таблица 1 | |||||
Влияние метионина на показатели гемодинамики и коэффициент эндотелиальной дисфункции при моделировании гомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции (М±m) | |||||
Группы животных | Функциональная проба | САД, мм рт.ст. | ДАД, мм рт.ст | S сосудистой реакции при проведении ЭЗВД с АХ и ЭНВД с НП, усл.ед. | КЭД, усл.ед. |
10% ТВИН 80 | Исходные | 129,2±4,3 | 82,4±5,9 | ||
1 мл/кг | АХ | 74,1±2,9 | 39,4±3,1 | 1124,2±63,7 | 0,9±0,2 |
Контроль | НП | 67,2±5,1 | 42,9±5,4 | 1011,8±94,6 | |
Метионин 5 г/кг 2 раза/сутки в течение 7 дней | Исходные | 117,2±4,1 | 78,4±5,6 | ||
АХ | 77,6±6,1 | 45,4±4,1 | 794,3±54* | 3,7±0,5* | |
НП | 65,4±7,1 | 38,3±3,4 | 2938,1±184* | ||
Метионин 5 г/кг 1 раза/сутки в течение 14 дней | Исходные | 121±4,2 | 79,6±2,4 | 3,9±0,2* | |
АХ | 81,4±4,8 | 42,4±2,5 | 658,1±71,2* | ||
НП | 56,1±8,6 | 34,2±8,3 | 2566,6±181,4** | ||
Метионин 3 г/кг 1 раза/сутки в течение 7 дней | Исходные | 118,9±10,1 | 76,6±7,2 | ||
АХ | 80,1±2,9 | 41,4±2,3 | 854,6±61,4* | 3,3±0,3* | |
НП | 72,3±6,7 | 45,9±4,3 | 2820,2±210,4* | ||
Примечание: * - р<0,05 - в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80. САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, S - площадь над кривой восстановления артериального давления при проведении фармакологических проб, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции. |
Результаты определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови позволили установить достоверное повышение уровня гомоцистеина во всех группах экспериментальных животных. Значения концентрации гомоцистеина достоверно отличались от таковых в контрольной группе животных (таблица 2).
Наибольшее повышение уровня гомоцистеина обнаружено в сыворотке крови животных, получавших метионин в дозе 5 г/кг в течение 14 дней (табл. 2).
Таблица 2 | ||||
Влияние метионина на концентрацию гомоцистеина при моделировании гомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции (М±m) | ||||
Группы животных | 10% ТВИН 80 1 мл/кг Контроль | Метионин 5 г/кг 2 раза/сутки в течение 7 дней | Метионин 5 г/кг 1 раза/сутки в течение 14 дней | Метионин 3 г/кг 1 раза/сутки в течение 7 дней |
Концентрация гомоцистеина (мкмоль/л) | 8,6±2,1 | 92,3±11,3* | 104,7±8,9* | 53,5±3,2* |
Примечание: * - р<0,05 - в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80. |
Таким образом, моделирование гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции с помощью внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней следует признать адекватной экспериментальной моделью гипергомоцистеинемии, которая может быть использована для изучения эндотелио- и кардиопротективных эффектов различных групп фармакологических препаратов при данной модели патологии