способ раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторной патологией

Формула изобретения

Способ раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторной патологией путем исследования крови, отличающийся тем, что в пробе венозной крови методом прямой иммунофлюоресценции на проточном цитометре определяют относительное содержание Аннексина V на моноцитах, и при его значении, равном 17,4% и более, диагностируют септические осложнения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и может быть использовано для раннего прогнозирования неонатального сепсиса у новорожденных детей с респираторной патологией и перинатальным поражением центральной нервной системы (ЦНС), находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ).

Широкое внедрение в неонатологию высокотехнологичных методов обследования и лечения, в том числе аппаратной искусственной вентиляции легких, обеспечивает возможность успешного выхаживания новорожденных с глубокими нарушениями функции дыхания. Однако в условиях незавершенности становления иммунной системы и развития механизмов местной неспецифической противоинфекционной защиты у новорожденных с респираторной патологией возможна повышенная микробная колонизация организма ребенка и, как следствие, развитие септических осложнений.

Проведенный анализ литературы показал, что вопрос прогнозирования развития бактериальных осложнений у новорожденных детей с тяжелой респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС недостаточно освещен, в связи с этим разработки в данном направлении весьма актуальны.

В настоящее время известны следующие способы прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных.

В последние годы большое внимание уделяется С-реактивному белку (СРБ). СРБ начинает синтезироваться в период 6-8 ч от начала инфекционного процесса или повреждения тканей. Как диагностический маркер у новорожденных СРБ более чувствительный и специфичный тест по сравнению с показателем лейкоцитов и степенью их незрелости. Однако уровень СРБ повышается очень медленно в начале септической инфекции, чувствительность теста в этот период едва достигает 60% (Ng Р.С., Cheng S.H., Chui K. et al. // Arch. Dis. Childh. - 1997. - Vol.77. - P.221-227). Наиболее информативен тест в режиме мониторирования в течение 24 или 48 ч, в этом случае чувствительность его достигает 84%. СРБ достаточно чувствительный, но поздний маркер септической инфекции новорожденных.

Несколько более высокие показатели чувствительности и специфичности тестов продемонстрировали такие маркеры, как уровень интерлейкина 1 (ИЛ1 ) и фактор некроза опухолей (ФНО ) в сыворотке крови. Повышение уровня ИЛ1 свыше 20 нг/л оказалось чувствительным тестом (92,3%), но не специфичным (34,5%). В то же время ФНО продемонстрировал низкую чувствительность (60%) при хорошей специфичности (85,2%) (Т.В.Бирюкова, И.Г.Солдатова, Н.Н.Володин и др. "Сравнительная информативность определения уровней прокальцитонина, интерлейкина и С-реактивного белка как критериев системного воспалительного ответа при раннем неонатальном сепсисе". / Педиатрия. 2007; 86 (4): 43-51; И.Г.Солдатова. "Роль провоспалительных цитокинов, рецепторного антагониста интерлейкина 1 в диагностике и лечении бактериальных инфекций у новорожденных детей". Автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 2003). Таким образом, стало очевидным, что эти тесты (СРБ, ИЛ1 , ФНО ) не могут использоваться как маркеры сепсиса.

Прототипом предлагаемого изобретения выбран один из перспективных маркеров сепсиса прокальцитонин, который избирательно реагирует на системные и септические инфекционные процессы и может служить ранним критерием для их диагностики (А.Г.Антонов, Е.Н.Байбарина, Ю.В.Соколовская, Н.В.Евтеева. "Объективные диагностические критерии сепсиса у новорожденных". / Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2005, т.4, № 5-6, с.113-115).

Недостатками прототипа являются: 1. Концентрация прокальцитонина широко варьирует в первые дни жизни ребенка (Chiesa С., Panero A., Rossi N. et al. // Clin. Infect. Dis. - 1998. - Vol.26. - Р.664-672). 2. Опубликованы работы, в которых приводятся очень высокие ложноположительные значения прокальцитонина у пациентов с респираторным дистресс-синдромом, острыми заболеваниями легких, гемодинамическими повреждениями, тяжелой травмой без бактериального инфицирования (Lapillone A., Basson Е., Monneret G. et al. // Lancet. - 1998. - Vol.351. - P.1211-1212). 3. Низкая специфичность (48%) (Turner D., Hammerman C., Rudenssky В., Schlesinger Y., Schimmel M.S. // Acta paediatr. 2006. Dec.; 95 (12); 1571-6).

Задачей изобретения является разработка более совершенного, высокочувствительного метода раннего прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных детей.

Поставленная задача решается тем, что в крови у новорожденных детей методом прямой иммунофлюоресценции на проточном цитометре определяют относительное содержание Аннексина V на моноцитах и при его значении, равном 17,4% и более, диагностируют септическое осложнение.

Наиболее чувствительным и патогенетически обоснованным лабораторным тестом, на основании которого возможна ранняя диагностика дисфункции иммунной системы еще до формирования нарушений в различных звеньях иммунореактивности и развития иммунной недостаточности, является оценка интенсивности процессов апоптоза. В частности, известно, что при сепсисе резко возрастает интенсивность гибели моноцитов механизмом апоптоза (В.А.Черешнев, Е.Ю.Гусев. "Иммунология воспаления: роль цитокинов" // Медицинская иммунология. - 2001. Т.3, № 3. - С.361-368; Hotchkiss R.C., Swanson P.E., Freeman B.D. Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock and multiple organ dysfunction // Crit. Care Med. - 1999. - Vol.27. - P.1230-1250). Возникает состояние иммунологической толерантности или «иммунопаралича», моноциты/макрофаги не в состоянии запускать иммунный ответ, т.е. продуцировать провоспалительные цитокины и экспрессировать HLA-DR. В этих условиях иммунная система не может выполнять свою главную функцию осуществления иммунологического надзора, что приводит к развитию тяжелых гнойно-септических осложнений и усугубляет синдром полиорганной недостаточности. У новорожденных с респираторной патологией развивается апоптогенное иммунодефицитное состояние.

Утрачивание фосфолипидной асимметричности клеточной мембраны характерно для ранних стадий апоптоза. В жизнеспособных клетках фосфатидилсерин расположен на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. В апоптотических клетках фосфатидилсерин переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны, становясь доступным для связывания с Аннексином V. Аннексин V - белок (35-36 kD), который при определенной концентрации солей и ионов Са²⁺ обладает высокой аффинностью к фосфатидилсерину, являясь индикатором ранних стадий апоптоза. Для окрашивания клеточной ДНК в анализе используется пропидий иодид. Клетки, окрашенные только Аннексином V, конъюгированным с FITC (флуоресцеин), находятся на более ранней стадии апоптоза, чем окрашенные также и пропидий иодидом (PI), так как переориентация фосфатидилсерина наблюдается раньше, чем изменения ядра клетки, связанные с апоптозом. Одним из основных методов детекции процессов апоптоза с помощью проточной цитофлуориметрии является использование системы ANNEXIN V - FITC - kit. Различное насыщение клеток двумя красителями позволяет определить живые, некротические и апоптотические клетки - жизнеспособные клетки (неокрашенные), находящиеся в раннем апоптозе (положительные по Аннексину V), находящиеся в позднем апоптозе/некрозе (положительные и по Аннексину V, и по пропидий иодиду).

Нашими исследованиями установлено, что у новорожденных детей с септическими осложнениями относительное содержание Аннексина V⁺ на моноцитах значительно больше, чем у новорожденных без таковых, и мониторинговое определение относительного содержания Аннексина V⁺ на моноцитах позволяет с высокой степенью вероятности диагностировать развитие неонатального сепсиса у новорожденных детей на доклинической стадии.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1

Ребенок У-ва, 1-х суток жизни, история болезни № 112/34. Пациентка переведена в отделение реанимации из родильного дома на искусственной вентиляции легких (ИВЛ) с диагнозом гипоксия, впервые выявленная до родов, асфиксия в родах тяжелой степени, мекониально-аспирационный синдром. Клинически выражены симптомы угнетения ЦНС: резко снижена реакция на осмотр, мышечная гипотония, гипорефлексия, спонтанный горизонтальный нистагм; выражена бледность кожного покрова; аускультативно дыхание в легких с обеих сторон ослаблено, хрипы не выслушиваются. Клинические и лабораторные симптомы бактериального инфицирования отсутствуют: температура тела нормальная, гемодинамика стабильная, печень, селезенка не увеличены, общий анализ крови без особенностей, прокальцитонин крови меньше 0,5 нг/мл.

При поступлении у ребенка из пупочного катетера набрали 1,5 мл венозной крови в пробирку, содержащую литиевую соль гепарина. Выделение моноцитарных клеток из цельной крови производили на градиенте плотности фиколл-урографина (1,082 г/см³) с последующей отмывкой клеток фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2). Ресуспендировали клетки в связывающем буфере (концентрация клеток составляла 1-2×10⁶ клеток/мл, жизнеспособность более 95%, примесь гранулоцитов не более 4%). Для диагностики использовали набор "ANNEXIN V - FITC - kit" фирмы Caltag Laboratories (США). Помещали 100 мкл клеточной суспензии в пробирку объемом 5 мл. Добавляли 5 мкл Аннексина V - FITC и 10 мкл раствора пропидиума йодида. Перемешивали на шейкере (1000 об/мин) в течение 3 секунд и инкубировали при комнатной температуре в темноте 20 минут. Затем добавляли в пробирку 400 мкл связывающего буфера. Анализировали образец на проточном цитометре фирмы Beckman Coulter Epics XL в течение 1 часа. Цитофлуориметрический метод оценки апоптоза клеток является очень чувствительным методом, позволяет проанализировать за короткий промежуток времени большое количество образцов и значительное количество клеток, что дает возможность получить достоверные сведения о состоянии клеток при различных патологических процессах.

В результате проведенного исследования были получены следующие результаты относительного содержания Аннексина V на моноцитах, находящихся в раннем апоптозе (Апоптоз моноцитов ранний, %) при поступлении - 21,4%.

Обнаружение цифр относительного содержания моноцитов, находящихся в раннем апоптозе 21,3%, свидетельствовало о высоком риске развития неонатального сепсиса. На 4-е сутки пребывания в отделении у пациентки отмечена гипертермия свыше 39°С, тахиаритмия свыше 160/мин, артериальная гипотония; в легких с обеих сторон выслушивались крепитирующие хрипы, наблюдалось увеличение размеров печени и селезенки; в гемограмме - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом до юных, прокальцитонин крови - 10 нг/мл, гипокоагуляция. Бактериологический посев крови - обнаружен рост Ps. aeruginosa. Пациентке поставлен клинический диагноз: неонатальный сепсис. Благодаря своевременному усилению интенсивной и антибактериальной терапии, назначению иммуностимулирующих препаратов ребенок остался жив. На 10-е сутки при повторном исследовании относительное содержание Аннексина V на моноцитах, находящихся в раннем апоптозе, снизилось до 16%. На 16-е сутки ребенок был экстубирован и переведен на спонтанное дыхание и на 20-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения. На момент перевода уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах, находящихся в раннем апоптозе, составил 15,4%.

Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение уровня экспрессии Аннексина V на моноцитах выше 17,4% свидетельствовало о возможности развития у ребенка неонатального сепсиса в наиболее раннем сроке, до появления клинических и лабораторных признаков тяжелой бактериальной инфекции.

Пример 2

Ребенок И-ов, первых суток жизни, история № 141/31. Поступил из родильного дома в отделение реанимации на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности и неврологической симптоматики в возрасте 4 часов жизни с диагнозом тяжелая асфиксия в родах, респираторный дистресс-синдром, ателектазы легких. При поступлении реакция на осмотр отсутствует, зрачковая реакция на свет ослаблена, мышечная гипотония, гипорефлексия; отмечалась выраженная бледность кожного покрова, петехиальные кровоизлияния в кожу головы и лица, артериальная гипотония, тахиаритмия свыше 160/мин; в легких выслушивались крепитирующие хрипы с обеих сторон, печень +2 см, селезенка у края реберной дуги, в общем анализе крови анемия, тенденция к нейтропении, прокальцитонин крови 2 нг/мл. Уровень экспрессии Аннексина V на моноцитах составлял 17,3%, что несмотря на тяжелое состояние и неоднозначность клинических симптомов и лабораторных данных позволяло исключить развитие неонатального сепсиса. Несмотря на проводимую терапию на 3 сутки ребенок погиб. На паталогоанатомическом вскрытии поставлен диагноз родовой травмы. Признаков бактериального инфицирования не обнаружено. Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение уровня экспрессии Аннексина V на моноцитах ниже 17,4% свидетельствовало об отсутствии у пациента неонатального сепсиса, что и подтвердилось в дальнейшем.

Пример 3

Ребенок С-в, 3-х суток жизни, история болезни № 211/63. Перевод в отделение реанимации на ИВЛ обусловлен нарастанием дыхательной недостаточности при отсутствии клинических симптомов бактериальной инфекции (акро - и периоральный цианоз, дыхание с участием вспомогательной мускулатуры, втяжением межреберий, одышка свыше 80/мин, с ослаблением аускультативного дыхания в легких с обеих сторон; симптомы угнетения ЦНС; печень, селезенка не увеличены, общий анализ крови без особенностей; прокальцитонин крови 0,4 нг/мл).

В результате проведенного исследования были получены следующие результаты относительного содержания Аннексина V на моноцитах: Аннексин V на моноцитах при поступлении - 17,5%.

Обнаружение цифр относительного содержания Аннексина V на моноцитах 17,5% у новорожденного свидетельствовало о высоком риске развития неонатального сепсиса. На 4-е сутки терапии у ребенка появились признаки системной воспалительной реакции: повышение температуры тела до 39,3°С, тахиаритмия свыше 160/мин, в легких с обеих сторон выслушивались крепитирующие хрипы, наблюдалось увеличение размеров печени и селезенки, в общем анализе крови - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом до юных, прокальцитонин крови - 12 нг/мл, что в сочетании с обнаружением роста в крови Ps. Aeruginosa позволило поставить клинический диагноз неонатального сепсиса. Благодаря своевременному усилению интенсивной и антибактериальной терапии, назначению иммуностимулирующих препаратов пациенту удалось сохранить жизнь. На фоне проводимой интенсивной терапии на 11-е сутки при повторном исследовании относительное содержание Аннексина V на моноцитах понизилось до 16,2%. На 16-е сутки ребенок был экстубирован и на 20-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения. На момент перевода уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах составил 12,3%.

Предлагаемым способом было обследовано 80 новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и перинатальным поражением ЦНС, находящихся на ИВЛ, получавших терапию в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. У 28 детей уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах был выше 17,4%. У этих пациентов в дальнейшем был диагностирован неонатальный сепсис, подтвержденный клинико-лабораторным и бактериологическим обследованием. Благодаря ранней диагностике развития этого заболевания и своевременного усиления проводимой антибактериальной и интенсивной терапии лишь у 2-х пациентов зарегистрирован летальный исход. При паталогоанатомическом исследовании у всех погибших детей имел место неонатальный сепсис.

У 68 детей уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах был ниже 17,4%. Течение основного заболевания у этих пациентов развитием неонатального сепсиса не осложнилось.

Таким образом, исследование относительного содержания Аннексина V на моноцитах крови у новорожденных с респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС, находящихся на ИВЛ, позволяет говорить о том, что чувствительность заявляемого способа составляет 90,91%, а специфичность - 89,55%.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных по сравнению с существующими методами имеет следующие преимущества:

1. Способ прогнозирует развитие неонатального сепсиса в наиболее ранние сроки, до развития тяжелого симптомокомплекса и полиорганной недостаточности, позволяя своевременно усилить проводимую антибактериальную и интенсивную терапию.

2. Способ относится к экспресс-диагностике (время выполнения 2 часа).

3. Предлагаемый способ является высокотехнологичной методикой, обладает высокой точностью и специфичностью и найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических стационарах.

Предлагаемый способ прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных с дыхательными расстройствами и перинатальным поражением ЦНС может использоваться в неонатологии, педиатрии и реаниматологии, дополняя известные методы лабораторной диагностики, позволяя своевременно и обоснованно назначать патогенетическую терапию, способствуя повышению выживаемости новорожденных и сокращая продолжительность терапии.