экспресс-способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов

Формула изобретения

Экспресс-способ биотестирования токсичности природных, сточных вод и водных растворов, включающий приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов и измерение кинетики биолюминесценции, отличающийся тем, что при приготовлении контрольной пробы используют биолюминесцентный биомодуль, включающий совместно иммобилизованные ферменты и субстраты биферментной системы светящихся бактерий с добавлением дистиллированной воды или фосфатного буфера, а при приготовлении рабочей пробы - биолюминесцентный биомодуль, включающий совместно иммобилизованные ферменты и субстраты биферментной системы светящихся бактерий с добавлением анализируемого образца воды, выдерживают обе пробы в течение 30-300 с, запускают реакцию биолюминесценции в обеих пробах раствором ФМН, причем соотношение объемов раствора ФМН в концентрации 5×10^-4 М и контрольного или анализируемого раствора составляет 1:10-1:50, регистрируют интенсивность свечения биолюминесценции обеих проб, при этом критерием токсичности воды является снижение на 20% и более или увеличение на 20% и более величины максимальной интенсивности свечения биолюминесценции, измеряемой в рабочей пробе по сравнению с этими параметрами в контрольной пробе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам биотестирования токсичности и может быть использовано для оценки качества вод, экологического картирования и мониторинга природных, а также промышленных сточных вод и водных растворов, с целью экологического контроля вод разного целевого назначения, в том числе загрязненных промышленными, сельскохозяйственными, бытовыми токсикантами и их смесями в концентрациях от 0,1 до 1000 ПДК и выше.

Известен способ определения фитотоксичности препаратов, основанный на регистрации изменения интенсивности замедленной флуоресценции тест-организма (микроводоросли и водные растения) в индукционных максимумах после включения возбуждающего света высокой, а потом низкой интенсивности [патент РФ № 2222003, МПК G01N 21/64, опубл. 2004.01.20].

Недостатком данного способа является длительное время проведения биотестирования. Так, согласно изобретению, перед измерением замедленной флуоресценции необходимо предварительное облучение контрольных и опытных проб тест-организмов в течение 2 ч светом интенсивностью 60 Вт/м². Кроме того, существуют ограничения в использовании данного метода при биотестировании вод с высоким содержанием органических соединений, служащих пищей для используемых тест-организмов, что вносит ошибку в результаты анализов, либо делает невозможным применение способа. Кроме того, для проведения биотестирования требуется культивирование тест-организма и создание специфических условий для его содержания, что усложняет весь способ биотестирования в целом.

Наиболее близким к изобретению является способ определения концентрации ингибиторов биологической активности путем измерения величины интенсивности свечения, достигаемой через 10-30 секунд, в реакционной смеси, содержащей растворы ферментов и субстратов биферментной системы в насыщающих концентрациях [а.с.СССР № 1204639, МПК C12Q 1/26, опубл. 1986.01.15, бюл. № 2 (прототип)].

Недостатком данного способа является сложность и низкая чувствительность анализа, т.к. процедура проведения анализа состоит в смешивании 5-ти компонентов (растворы ферментов, 3-х субстратов и буфера), каждый из которых при проведении анализа необходимо добавлять в определенных концентрациях и количествах в процессе одиночного измерения. Кроме того, в прототипе проводят измерение максимальной интенсивности свечения в реакционной смеси, включающей все компоненты, а затем непосредственно в контрольную пробу добавляют незначительное количество (5 мкл) анализируемого образца воды, что приводит к первоначальному разбавлению анализируемого образца в 100 раз и снижению чувствительности анализа. В полевых условиях использование данного анализа весьма затруднительно, поскольку растворы ферментов необходимо хранить при постоянной низкой температуре (4°С), а растворы субстратов (миристинового альдегида и НАДН) подвержены быстрой инактивации.

Техническим результатом данного изобретения является разработка высокочувствительного экспресс-способа биотестирования природных, сточных вод и водных растворов.

Указанный результат достигается тем, что в экспресс-способе биотестирования природных, сточных вод и водных растворов, включающем приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов и измерение кинетики биолюминесценции, новым является то, что при приготовлении контрольной пробы используют биолюминесцентный биомодуль, включающий совместно иммобилизованные ферменты и субстраты биферментной системы светящихся бактерий с добавлением дистиллированной воды или фосфатного буфера, а при приготовлении рабочей пробы - биолюминесцентный биомодуль, включающий совместно иммобилизованные ферменты и субстраты биферментной системы светящихся бактерий, с добавлением анализируемого образца воды, выдерживают обе пробы в течение 30-300 секунд, запускают реакцию биолюминесценции в обеих пробах раствором ФМН, причем соотношение объемов раствора ФМН в концентрации 5×10 ^-4 M и контрольного или анализируемого раствора составляет 1:10-1:50, регистрируют интенсивность свечения биолюминесценции обеих проб, при этом критерием токсичности воды является снижение на 20% и более или увеличение на 20% и более величины максимальной интенсивности свечения биолюминесценции, измеряемой в рабочей пробе по сравнению с этими параметрами в контрольной пробе.

Заявляемый биолюминесцентный экспресс-способ биотестирования отличается от прототипа количественным и качественным составом рабочей и контрольных проб, наличием дополнительной процедуры инкубации проб с биомодулем, порядком внесения реагентов, использованием в качестве токсикологической характеристики воды величины ее биологически безопасного разбавления. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».

Использование заявляемого экспресс-способа биотестирования позволяет существенно упростить процедуру анализа, сократить время биотестирования природных, сточных вод и водных растворов, а также увеличить чувствительность анализа. Описываемая в данном способе процедура анализа сводится к тому, что к биомодулю добавляют анализируемый или контрольный образец воды и запускают реакцию раствором ФМН. Увеличение чувствительности анализа достигается благодаря оптимально подобранному соотношению объемов раствора ФМН и анализируемого образца воды (1:50), а также дополнительной инкубации биомодуля с анализируемой пробой воды, что существенно увеличивает вероятность воздействия токсических веществ, содержащихся в анализируемых образцах воды, на параметры свечения биомодуля. Кроме того, увеличение чувствительности анализа достигается путем изменения порядка внесения компонентов: анализируемый образец воды добавляется до инициации ферментативных реакций (до добавления ФМН). В заявляемом способе биотестировании качество воды устанавливается на основе ее токсикологических характеристик через величину биологически безопасного разбавления, что позволяет унифицировать метод биотестирования и сравнивать результаты биотестирования с результатами, полученными с использованием других тест-объектов.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной области и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый экспресс-способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов осуществляется следующим образом.

Для проведения биотестирования готовят контрольную и рабочую пробы на основе биолюминесцентного биомодуля. Используемый в качестве тест-объекта биолюминесцентный биомодуль дозирован на одно измерение и представляет собой совместно иммобилизованные в гель ферменты (люцифераза и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза) и субстраты (НАДН и миристиновый альдегид), а также ФМН в виде раствора.

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносят биомодуль и 500 мкл дистиллированной воды или фосфатного буфера, выдерживают в течение 30-300 секунд, добавляют 5-50 мкл 5×10^-4 М раствора ФМН и измеряют интенсивность свечения и время выхода свечения на максимум.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносят биомодуль и 500 мкл анализируемого образца воды, выдерживают в течение 30-300 секунд, добавляют 5-50 мкл 5×10^-4 М раствора ФМН и измеряют интенсивность свечения и время выхода свечения на максимум.

Критерием токсичности воды является снижение на 20% и более или увеличение на 20% и более одного или обоих измеряемых параметров биолюминесценции биомодуля в рабочей пробе, по сравнению с параметрами свечения биомодуля в контрольной пробе. Рассчитывают коэффициенты токсичности по формулам:

или

где KT₁ и КТ₂ - коэффициенты токсичности;

I_o - интенсивность свечения в анализируемой пробе;

I_k - интенсивность свечения в контрольной пробе;

Т_о - время выхода свечения на максимум в анализируемой пробе;

T_k - время выхода свечения на максимум в контрольной пробе.

Качество воды устанавливается на основе ее токсикологических характеристик через величину биологически безопасного разбавления согласно таблице 1. Для этого из результатов биотестирования разведении пробы воды, кратных трем, выбирают то разбавление, для которого рассчитанные коэффициенты токсичности превысили критерий токсичности воды.

Таблица 1
Токсикологические характеристики качества испытуемой воды
Величина разбавления тестируемой воды, при которой превышен критерий токсичности	Качество воды
1	слаботоксичная
3	среднетоксичная
9	токсичная
27	сильнотоксичная
81	гипертоксичная

На фиг.1 показаны результаты биотестирования питьевой воды разных производителей. На фиг.2 представлены результаты биотестирования водного раствора CuSO₄ от времени инкубации. На фиг.3 представлены результаты биотестирования водных растворов бензохинона различных концентраций.

Пример 1

В таблице 2 представлены результаты биотестирования токсичности сточных вод ООО «Енисейский целлюлозно-бумажный комбинат» г.Красноярска. Исследуемые образцы сточных вод поступали из цеха очистки промышленных стоков ООО «Енисейский ЦБК» и различались по основным физико-химическим показателям (рН, содержание ХПК, нитратов, нитритов и т.д.).

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл дистиллированной воды или 0,05 М натрий-фосфатного буфера рН 7.0, выдерживали 30 секунд, добавляли 50 мкл 5×10^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_k.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл анализируемого образца воды, выдерживали в течение 30 секунд, добавляли 50 мкл 5×10 ^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I _о.

Коэффициент токсичности определяли по формуле: KT=[(I_k-I_o)/I_k]×100%. Качество воды устанавливали на основе ее токсикологических характеристик через величину биологически безопасного разбавления согласно таблице 1.

Таблица 2
Результаты биотестирования токсичности сточных вод ООО «Енисейский целлюлозно-бумажный комбинат» г.Красноярска в зависимости от образца, взятого в качестве контрольного
Место отбора пробы/ разведение	Коэффициент токсичности, %
Контрольный раствор - 0,05 М натрий-фосфатный буфер рН 7,0	Контрольный раствор - дистиллированная вода
На входе очистных сооружений (Проба № 1)	100	100
Проба № 1, разбавленная в 9 раз	90,9±7,9	90,5±8,2
Проба № 1, разбавленная в 81 раз	34,1±6,6	31,0±7.2
После механической очистки (Проба № 2)	100	100
Проба № 2, разбавленная в 9 раз	80,3±8,0	79,4±7,9
Проба № 2, разбавленная в 81 раз	58,6±7,4	56,6±6,5
На выходе очистных сооружений (Проба № 3)	71,6±10,2	86,4±8,9
Проба № 3, разбавленная в 9 раз	22,4±4,8	18,7±5,1

Из таблицы 2 видно, что показания биолюминесцентного экспресс-способа биотестирования не зависят от раствора, выбранного в качестве контрольного, т.е. при проведении биотестирования в качестве контрольных растворов могут использоваться дистиллированная вода или фосфатный буфер рН 6,8-7. Согласно результатам биотестирования пробы № 1 и 2 являются гипертоксичными, проба № 3 - токсичной. Кроме того, показано, что токсичность проб уменьшается в ряду проба 1> проба 2> проба 3, что соответствует изменению химических характеристик анализируемых проб.

Пример 2

На фиг.1 представлены результаты биотестирования питьевой воды разных производителей, в том числе природная питьевая столовая вода марки «Чистая вода Сибири» ООО ПКП «Комплекс»; питьевая вода марки «Аква-вита» ООО «Эковита»; питьевая вода марки «Аква Минерале» ООО «ПепсиКо Холдинг»; питьевая вода марки «Bon-Aqua» ООО «Кока-Кола Эйчбиси Евразия».

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл дистиллированной воды, выдерживали 300 секунд, добавляли 10 мкл 5х10^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_k.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл анализируемого образца воды, выдерживали в течение 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10 ^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I _о.

Коэффициент токсичности определяли по формуле: KT=[(I_k-I_o)/I_k] ×100%.

Поскольку критерий токсичности не превышен для всех анализируемых образцов, следует признать все исследованные образцы питьевой воды нетоксичными, годными к употреблению.

Пример 3

На фиг.2 представлены результаты биотестирования водного раствора CuSO₄ концентрации 5 мг/л в зависимости от времени инкубации биомодуля в растворе CuSO₄.

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл дистиллированной воды, выдерживали 0-300 секунд, добавляли 10 мкл 5х10^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_k.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл анализируемого водного образца CuSO ₄, выдерживали в течение 0-300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_о.

Коэффициент токсичности определяли по формуле: KT=[(I_k-I_o)/I _k]×100.

Видно, что результаты биотестирования зависят от времени инкубации биомодуля в водном растворе токсичного вещества. При биотестировании воды заявляемым способом для увеличения чувствительности биомодуля к токсичным веществам, содержащимся в исследуемых образцах воды, необходимо проводить инкубацию биомодуля в анализируемом образце воды.

Пример 4

На фиг.3 представлены результаты биотестирования водных растворов бензохинона различных концентраций.

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл дистиллированной воды, выдерживали 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10 ^-4 М раствора ФМН и измеряли время выхода свечения на максимум T_k.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл анализируемого водного образца бензохинона, выдерживали в течение 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10 ^-4 М раствора ФМН и измеряли время выхода свечения на максимум Т_о.

Коэффициент токсичности определяли по формуле: KT=[(T_o-T_k)/T_k]×100%.

Видно, что результаты биотестирования зависят от концентрации токсического вещества в водном растворе. При увеличении концентрации бензохинона в анализируемом водном растворе время выхода свечения на максимум возрастает. Нетоксичным является раствор бензохинона концентрации 1,7·10^-8 М.

Пример 5

В таблице 3 представлены результаты биотестирования водных растворов разных классов токсичных веществ (солей тяжелых металлов и хинонов).

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл дистиллированной воды, выдерживали 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10 ^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I _k.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и 500 мкл анализируемого водного раствора соли тяжелых металлов или хинона, выдерживали в течение 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_о.

Коэффициент токсичности определяли по формуле: KT=(I_k-I_o)/I _k×100%.

Таблица 3
Концентрации токсических веществ, вызывающих ингибировании свечения биомодуля на 50% и 20%
Название	ЕС 50, мг/л	ЕС 20, мг/л
Хиноны	Бензохинон(ПДК 0,1 мг/л)	0,01	0,003
Тимохинон	0,03	0,01
Толухинон	0,05	0,01
Нафтохинон (ПДК 0,25 мг/л)	0,003	0,001
	Пирокатехин (ПДК 0,1 мг/л)	0,002	0,0001
Гидрохинон (ПДК 0,2 мг/л)	0,02	0,01
Соли	CuSO4 (ПДК Сu2+ 1 мг/л)	0,4	0,24
CdSO4 (ПДК Сd2+ 0,001 мг/л)	0,2	0,05
CoCl2 (ПДК Со2+ 0,1 мг/л)	200	6
СrСl2 (ПДК Сr2+ 0,05 мг/л)	400	200

Из табл.3 видно, что заявляемый способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов является высокочувствительным методом определения содержания токсических веществ в пробах воды на уровне предельно допустимых концентраций и выше. Использование в качестве критерия токсичности ингибирование величины максимальной интенсивности свечения биомодуля на 20% по сравнению с контрольным раствором позволяет определять наличие в образцах воды меньших концентраций токсических веществ. Например, при использовании в качестве критерия токсичности ингибирование максимальной интенсивности свечения биомодуля на 50% чувствительность метода к бензохинону составляет 0,01 мг/л, а при использовании в качестве критерия токсичности ингибирование максимальной интенсивности свечения биомодуля на 20% чувствительность способа биотестирования увеличивается в 3 раза и составляет 0,003 мг/л.

По сравнению с биотестом на основе светящихся бактерий (J.Lappalainen, R.Juvonen, J.Nurmi, M.Karp «Automated color method for Vibrio fischeri toxicity test. Comparison of standart and kinetic assays» // Chemosphere, 2001. V.45. p.635-641) заявляемый способ биотестирования является более чувствительным к действию CuSO₄. Так, чувствительность к CuSO₄ стандартного теста BioTox на основе фотобактерий составляет 0,74 мг/л, чувствительность заявленного биомодуля составляет не менее 0,4 мг/л (табл.3).

Пример 6

В табл.4 представлены результаты биотестирования водного образца, представляющего сброс производственных сточных вод ООО «Енисейский целлюлозно-бумажный комбинат» г.Красноярска.

Для измерения параметров свечения в контрольной пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и разное количество дистиллированной воды (200, 300, 400, 500, 600 и 700 мкл), выдерживали 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10^-4 M раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_k.

Для измерения параметров свечения в рабочей пробе в кювету биолюминометра последовательно вносили биомодуль и разное количество анализируемого образца воды (200, 300, 400, 500, 600 и 700 мкл), выдерживали в течение 300 секунд, добавляли 10 мкл 5×10^-4 М раствора ФМН и измеряли интенсивность свечения I_о.

Коэффициент токсичности определяли по формуле: KT=(I_k -I_o)/I_k×100%.

Таблица 4
Зависимость коэффициента токсичности образца воды от соотношения объемов раствора ФМН и анализируемого образца воды
Соотношение объемов раствора ФМН
	1:10	1:20	1:30	1:40	1:50	1:60	1:70
и анализируемого образца воды
Коэффициент токсичности, %	46	48	56	71	85	84	85

Из результатов биотестирования видно, что при использовании соотношения объемов раствора ФМН и анализируемого образца воды 1:50 достигается максимальная чувствительность заявляемого способа к действию токсических веществ: индекс токсичности равен 85%, т.е. образец воды является токсичным. Отсутствие токсического действия образца воды на параметры свечения биомодуля при соотношении менее 1:50 объясняется недостаточным смачиванием бимодуля; а также недостаточной для воздействия на параметры свечения биомодуля концентрацией токсических веществ, содержащихся в небольшом объеме добавляемой пробы.